组织化学与细胞化学杂志。2010年5月；58(5): 443–453.
Atg9A蛋白是一种自噬相关膜蛋白，定位于小鼠大脑神经元
日本东京君天道大学医学研究生院细胞生物学和神经科学系（HT，MK，MSasaki，YU）；大阪大学医学研究生院生物化学与分子生物学系，日本大阪（HT）；和日本新泻大学医学和牙科科学研究生院大体解剖和形态发生科
通信地址：Yasuo Uchiyama，Juntendo大学医学研究生院细胞生物学和神经科学系，2-1-1 Hongo，Bunkyo-ku，Tokyo 113-8421，Japan。电子邮件：pj.ca.odnetnuj@ihcu-y 2009年12月18日收到；2010年1月12日接受。
摘要
旧的和不需要的细胞内大分子通过自噬传递到溶酶体，溶酶体将大分子降解为生物活性单体，如氨基酸。自噬在真核生物中是保守的，对维持细胞代谢至关重要。目前，在酵母中已鉴定出30多个自噬相关基因（Atgs）。在这些基因中，对自噬体形成至关重要的18个基因也保存在哺乳动物细胞中。Atg9是自噬体形成所需的唯一跨膜Atg蛋白。虽然已经检测了Atg9A蛋白（Atg9Ap）的亚细胞定位，但对其精确的细胞和组织分布知之甚少。为了确定这一点，我们制备了一种针对小鼠Atg9Ap的抗体。该抗体识别非糖基化和糖基化的Atg9Ap，其分子量分别为~94kDa和105kDa。虽然Atg9Ap被广泛检测到，但它在中枢神经系统的神经元中高度表达。在Purkinje细胞中，Atg9Ap免疫反应定位于内质网（ER）、跨高尔基网络（TGN）、溶酶体/晚期内体和轴突末端。这些结果表明，Atg9Ap可能参与神经元、TGN和溶酶体/晚期内体的内质网和轴突末端的自噬体形成。（《组织化学细胞化学杂志》58:443–4532010）
关键词：自噬，小鼠，Atg9A，神经元，浦肯野细胞，轴突
A类自噬 是 一 真核生物的在维持细胞内环境稳定中起关键作用的自我分级系统(Mortimore and Poso 1987年;Kuma等人，2004年;Meijer和Dubbelhuis 2004). 此外，在各种病理条件下，如饥饿、炎症和缺血，各种应激都会诱导自噬。一旦在细胞中诱导自噬，旧的和不需要的物质，包括细胞器，连同部分细胞质，就会被双层结构隔绝，形成自噬体。这些结构要么通过转运来自反高尔基网络（TGN）的囊泡来接收溶酶体水解酶，要么与溶酶体融合成为自溶酶体(Klinsky和Emr 2000;Ohsumi 2001年;Uchiyama等人，2008年). 酵母中发现了许多自噬相关基因（Atgs）酿酒酵母，这些基因的哺乳动物同源物也已被鉴定(Klonsky等人，2003年;2007年水岛). 此外，研究表明，这些Atg蛋白对自噬体的形成至关重要(2007年水岛;Uchiyama等人，2008年;Ravikumar等人，2009年).
Atg9蛋白（Atg9p）是唯一的完整膜Atg蛋白，位于吞噬细胞/自噬前体结构（PAS）中(铃木等人，2001;Yen和Klinsky 2007)尽管哺乳动物细胞的结构尚不清楚。PAS中定位了几个Atg蛋白，包括Atg9p(Krick等人，2008年;Sekito等人，2009年)，可能是自噬体膜的起源，表明Atg9p在自噬小体的形成中起着关键作用。有人提出，在营养丰富的条件下，Atg9p以依赖Atg11的方式被招募到PAS中，而在营养缺乏期间，Atg9的招募依赖于Atg17p(Sekito等人，2009年). 此外，Atg9p以ULK1依赖的方式在TGN和晚期内体之间循环(Young等人，2006年)而PAS和细胞外周区域之间的循环通过其他几种机制进行(Lang等人，2000年;Noda等人，2000年;Reggiori等人，2005年;Krick等人，2008年).
虽然Atg9A蛋白（Atg9Ap）的亚细胞定位明显依赖于营养物质的可用性，但Atg9A在自噬体形成中的作用仍有待确定。由于自噬是一个高度保守的降解系统，预计Atg表达的组织分布将相对均匀。然而，人类Atg9A mRNA的表达是组织依赖性的(Yamada等人，2005年). 为了更详细地检测Atg9Ap的精确细胞和组织分布，我们制备了一种小鼠Atg9Ap特异性抗体。有趣的是，Atg9Ap主要在神经元中表达，包括轴突和轴突终末。
材料和方法
动物
这里所描述的实验是按照君腾大学动物实验审查委员会的规定进行的。C57BL/6J小鼠，分别为3周龄和8周龄，取自日本Charles River Laboratories of Japan（Yokohama，Japan），随后被安置在Juntendo University的特定无致病条件下。
小鼠Atg9Ap抗体的制备
以小鼠脑cDNA为模板，通过PCR扩增出与开放阅读框相对应的小鼠Atg9A基因。扩增的Atg9A基因亚克隆到pGEM3Z载体的EcoRI/HindIII位点（Promega；威斯康星州麦迪逊）。感应和反感应引物的序列如所示通过PCR产生与aa 720和aa 839之间mAtg9A氨基酸序列相对应的DNA序列()它使用mAtg9A/pGEM3Z作为模板。然后将DNA亚克隆到pGEX6P-1载体（GE Healthcare UK，Ltd.；Little Chalfont，UK）的BamHI/EcoRI位点以表达GST融合蛋白。使用谷胱甘肽-Sepharose 4B和MacroPrep陶瓷羟基磷灰石（Bio-Rad；Hercules，CA）纯化GST–Atg9A融合蛋白，并使用PreScission蛋白酶（GE Healthcare UK）切除GST。抗体的制备如前所述(Lu等人，2005年). 简言之，用Titer Max Gold佐剂（CytRx Corp.；加利福尼亚州洛杉矶）乳化纯化的Atg9Ap，每隔2-4周将乳化液皮下注射到雌性兔子体内。使用与抗原结合的亲和柱从抗血清中纯化Atg9Ap特异性多克隆抗体。
表1
Atg9A（NM_001003917）和GAPDH（NM_008084）DNA片段克隆的引物序列
| 基因 | 使用 | 位置（bp） | 底漆 | 序列 |
|---|
| 附件9A | 克隆，RT-PCR | 1–2,520 | 感觉 | CGGAATTCATGGCACAGTTTGACACTGA公司 |
| | | 反义 | GGGAGCTTCTATACCTTGTGCACTTG公司 |
| GAPDH公司 | 控制，RT-PCR | 520–971 | 感觉 | ACCCAGTCACATGCACTCAC公司 |
| | | 反义 | TCCACCCCTGTTGCTGTA公司 |
| 附件9A | 抗原 | 2,158–2,520 | 感觉 | GCGGATCCCCAGACCAGGCTGAGCCGA公司 |
| | | 反感应 | GGAATTCCTATACCTTGTGCACTTGAG公司 |
| 附件9A | ECFP–Atg9A | 1–2,520 | 感觉 | ATCTCGAGCTGGCACAGTTTGACACTGA公司 |
| | | 反感应 | TATCTAGACTATACCTTGTGCACTTGAG公司 |
抗体
本研究制备了兔抗Atg9Ap多克隆抗体。本研究中用于免疫组织/细胞化学和Western blotting的市售抗体如下：抗绿色荧光蛋白（GFP）的兔多克隆抗体（MBL；日本名古屋），抗GFP的大鼠单克隆抗体（Nacalai Tesuque；日本京都），小鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）单克隆抗体（Ambion；Austin，TX）、GM130（高尔基体标记物）（Becton，Dickinson and Company；Franklin Lakes，NJ）、葡萄糖调节蛋白78/BiP（内质网（ER）标记蛋白标记物BiP]（Becton-Dickinson and Corporation）、早期内体标记物（EEA1）（Becton、Dickinson和Company）、γ-adaptin（TGN的标记蛋白）（Becton-Dickinson和公司）、囊泡对接蛋白p115（ER的标记蛋白/顺式-Golgi，p115）（Becton，Dickinson and Company），小鼠胶质纤维酸性蛋白（GFAP）（Sigma-Aldrich；密苏里州圣路易斯），神经丝-L（NF-L）（Novus Biologicals；利特尔顿，CO），突触素（PROGEN Biotechnik；德国海德堡），一种大鼠多克隆抗鼠lamp1抗体（溶酶体膜蛋白标记物）（发育研究杂交瘤银行；爱荷华州爱荷华市），针对小鼠普遍存在的线粒体肌酸激酶（CK-Mi）的豚鼠多克隆抗体（前沿科学；日本石井市），谷氨酸转运体（GLAST；前沿科学），以及针对小鼠囊泡GABA转运体的山羊多克隆抗体。此外，在蛋白质印迹和免疫染色中使用了辣根过氧化物酶偶联的种特异性二级抗体（Dako；Glostrup，丹麦）。免疫染色中使用了Alexa Fluor 488结合的物种特异性二级抗体和Alexa Fluor 594结合的物种特异性二级抗体（Invitrogen；Carlsbad，CA）。
细胞培养和转染
NIH3T3细胞在补充有100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10%胎牛血清（10%FBS DMEM）的DMEM（Nacalai Tesque）中培养。根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000试剂（Invitrogen）转染细胞。
质粒构建与细胞转染
将小鼠Atg9A基因的开放阅读框亚克隆到pECFP-c1载体的XhoI/XbaI位点（Clontech；Mountain View，CA）(). 将ECFP–Atg9A载体转染NIH3T3细胞，并通过向培养基中添加G418（Nacalai Tesuque）来选择阳性克隆。
小鼠Atg9A的RNA干扰
如前所述，对Atg9A进行RNA干扰（RNAi）(Yoshimura等人，2006年). 小鼠Atg9A#1和Atg9A#2的四个寡核苷酸()合成了。将每个寡核苷酸退火并亚克隆到pSUPER_neo载体中（OligoEngine；西雅图，华盛顿州）。RNAi载体转染NIH3T3细胞，转染细胞培养14天，期间通过向培养基中添加G418筛选阳性克隆。
表2
| 使用 | 目标序列（bp） | 寡核苷酸 | 序列 |
|---|
| 附件9A RNAi#1 | 3–23 | 感觉 | GATCCGCACAGTTTACACTGAATATTCAAGAGAT-ATTCAGTCTCAAAACTGTCTTTTTGGAAA |
| | 反义 | AGCTTTCCAAAAAGGCACAGTTGACACTGAATA-TCTCTTGAATATTCACTCAACTGGCCG |
| 附件9A RNAi#2 | 428–448 | 感觉 | GATCCGGATCCCGGCTTCAAGATA-CTTGAGAA-CTTGATAAGCGTGGATCCTTTTTGGAAA |
| | 反义 | AGCTTTCCAAAAAGGATCACCCGGCTTCAAGT-TCTCTGAAACTTGAGAGCGCGCGCGGATCCGG |
Atg9A和GAPDH的RT-PCR
使用ISOGEN（Nippon Gene；日本东京）从野生型和Atg9A敲低的NIH3T3细胞中提取总RNA。然后使用RevaTra Ace（Toyobo；日本大阪）逆转录总RNA。用于GAPDH和Atg9A的引物如所示.
Atg9Ap、GFP和GAPDH的Western Blot
收集转染ECFP–Atg9A或Atg9A-RNAi载体的NIH3T3细胞，用裂解缓冲液[1%Triton X-100和PBS中的蛋白酶抑制剂混合物（Nacalai Tesuque）]进行裂解，并在冰上培养30分钟。然后将裂解液在20400×g下离心10分钟，收集所得上清液。使用Cryo-Tec冷冻组织破碎机在液氮中粉碎小鼠组织（Microtec公司；日本福纳巴什）。使用Polytron PT3100（Kinematica；瑞士利托）用5-10 vols的裂解缓冲液将粉碎的组织均质化，所得匀浆在冰上培养30 min。然后将这些裂解液在20400×g下离心10 min，并收集所得上清液。对裂解产物（20μg）进行SDS-PAGE，然后使用Atg9Ap（1:500）、GFP（1:1000）或GAPDH（1:100000）抗体进行Western blotting。使用Image Gauge软件程序（富士照片胶片有限公司；日本东京）对蛋白质带进行量化。
免疫组织化学/细胞化学
如前所述，免疫染色用于检查组织和细胞分布(Koike等人，2000年,2005;Yoshimura等人，2006年). 成年雄性和年轻C57BL/6J小鼠（分别为8周龄和3周龄）用戊巴比妥（25 mg/kg腹腔注射）进行深度麻醉，并用4%多聚甲醛和含4%蔗糖的0.1 M磷酸盐缓冲液进行心脏灌注固定。由于Atg9Ap在中枢神经系统（CNS）中高度表达，因此将大脑切除并进一步固定在同一固定液中24小时。冷冻切片的组织样品通过浸泡在15%和30%蔗糖溶液中进行冷冻保护，然后嵌入OCT化合物中（Miles；Elkhart，in）。用低温恒温器（CM3050；德国努斯洛赫莱卡）将包埋组织切成10μm的切片。将切片放在硅烷涂层玻片上，在4C下用抗Atg9A抗体（稀释1:200）免疫染色2天，然后在室温下用过氧化物结合链霉亲和素（Vectastain ABC试剂盒；Vector Laboratories，加利福尼亚州伯灵盖姆）进一步孵育1小时。每一步后，将切片在0.1 M磷酸盐缓冲0.5 M盐水（pH 7.2）中彻底冲洗，其中含有0.1%吐温20（TPBS）。使用0.0125%3,3-二氨基联苯胺四氯化氢（DAB）和0.002%H进行过氧化物酶染色2O（运行）2在0.05 M Tris-HCl缓冲液（pH 7.6）中放置5分钟（Vector Laboratories）。为了进行双重免疫荧光染色，冷冻切片与抗Atg9Ap抗体和细胞内标记物的抗体孵育，这些标记物包括BiP（1:50）、p115（1:100）、GM130（1:200）、γ-调适素（1:1004C，持续2天。然后将冷冻切片与Alexa Fluor 488偶联山羊或驴抗兔抗体和抗小鼠、抗鼠、抗驴或抗豚鼠IgG偶联Alexa Fluor 594（Invitrogen）的混合物在室温下孵育1小时。然后使用含4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）（Vector Laboratories）的Vectashield安装介质覆盖切片，并在共焦激光扫描显微镜（LSM）下观察（FV1000；日本东京奥林巴斯）。
野生型（模拟转染）、ECFP-Atg9A转染和Atg9A mRNA敲除的NIH3T3细胞用4%多聚甲醛和含有4%蔗糖的0.1 M磷酸盐缓冲液缓冲固定。然后用抗Atg9A抗体（1:200）对细胞进行单次免疫染色，或用抗GFP抗体（1:2000）和抗Atg9抗体在4C下进行双重免疫染色2天。然后在室温下分别用Alexa Fluor 488偶联羊抗兔IgG或Alexa Fluor 488-偶联羊抗家兔和Alexa Fuor 594-偶联鼠抗IgG（Invitrogen）的混合物培养细胞1小时。然后使用Vectashield安装介质和DAPI（Vector Laboratories）覆盖这些节段，并在LSM下查看。
结果
小鼠Atg9Ap特异性抗体的制备
为了检测内源性Atg9Ap的组织分布和亚细胞定位，制备了一种针对小鼠Atg9Ap羧基末端区域的特异性抗体。使用表达与ECFP羧基末端（ECFP–Atg9）融合的Atg9Ap的NIH3T3细胞确认制备抗体的特异性。使用GFP和Atg9Ap抗体对细胞裂解物进行Atg9A融合蛋白的Western blot分析，在分子量为94、105、123、134和>200kDa的情况下发现其阳性条带(). 根据其氨基酸序列，推测Atg9Ap的分子量为94kDa。因此，可以合理假设94-kDa蛋白带(; 通道3和4）中标记5号的带是在粗略内质网中合成的Atg9Ap。人Atg9Ap在Asn99处的糖基化导致其分子量为105kDa(Young等人，2006年). 因此，94kDa和105kDa条带对应于内源性、非糖基化和糖基化的Atg9Ap(，分别在车道3和车道4中标记数字5和4）。这一结果与抗GFP抗体检测到的123kDa和134kDa条带（分别标记为数字3和2）一致(，车道1）。由于ECFP的分子量为29kDa，因此123-kDa和134-kDa-蛋白带分别为非糖基化和糖基化ECFP–Atg9A。
抗–Atg9A蛋白（抗Atg9Ap）抗体的特性。(A类)蛋白质印迹分析。表达ECFP–Atg9A（Lanes 1和3）或ECFP（Lanes 2和4）的NIH3T3细胞的裂解物用抗绿色荧光蛋白（抗GFP）（Lanes I和2）或抗Atg9Ap抗体（Lanes 3和4）染色。条带上的相应数字表示以下分子质量：1：～200 kDa；2:134kDa；3:123kDa；4:105kDa；和5:94 kDa。105kDa和94kDa条带对应于内源性Atg9Aps，在第3和第4道中检测到，但在第1和第2道中检测不到。(B类)使用抗Atg9Ap抗体进行免疫染色。用抗GFP（绿色）和抗Atg9Ap抗体（红色）对表达ECFP–Atg9A的NIH3T3细胞进行免疫染色。这两种蛋白质的阳性信号显示出明显的重叠（黄色）。(C类)RNA干扰抑制Atg9A表达。对从野生型（wt）和Atg9A敲除（#1和#2）NIH3T3细胞获得的mRNA进行逆转录，并通过PCR扩增Atg9A基因。上面板显示Atg9Ap，下面板显示甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）。(D类)野生型和Atg9A mRNA敲低（#1和#2）NIH3T3细胞内源性Atg9Ap的Western blot分析。上面板显示Atg9Ap的蛋白带免疫阳性，下面板显示GAPDH的蛋白带抗体阳性。敲除细胞中Atg9Ap的表达被显著抑制。星号表示非特定带。(E类)使用抗Atg9Ap抗体（红色）对野生型（WT）和Atg9A mRNA敲除（Atg9ARNAi#1和Atg9-ARNAi#2）NIH3T3细胞中的Atg9Ap进行免疫荧光染色。细胞核用DAPI复染。棒材=10μm。
为了进一步检查抗体特异性，用Atg9Ap抗体对ECFP–Atg9A表达细胞进行染色，并用共焦显微镜观察。Atg9Ap在核周区和周围点状结构中检测到强烈的免疫信号。表明ECFP–Atg9A的GFP阳性信号与Atg9Ap阳性信号基本一致(). 为了通过遗传方法验证抗体特异性，我们建立了RNA干扰抑制Atg9Ap表达的细胞。将RNAi载体导入NIH3T3细胞，其中一些显示出抑制Atg9A表达。RT-PCR和Western blotting分别证实这些细胞中Atg9A mRNA和蛋白表达水平降低(和). 如所示在对照细胞的核周区域检测到Atg9Ap的免疫反应性，但在Atg9Ap敲低细胞的细胞质中显著降低或基本消失。此外，分子量>200kDa的Atg9A阳性条带在Atg9AmRNA敲除细胞中不明显。这一结果表明，这些大分子可能对应于Atg9p的二聚体形式。因此，这些实验的结果证实了抗体对Atg9Ap具有特异性，并可用于后续实验，以研究Atg9Ap的组织和细胞分布。此外，我们还证实，产生的抗体可以识别人Atg9Ap，并且可以用于蛋白质印迹和免疫组织化学（数据未显示）。
Atg9Ap的组织分布
如上所述，抗体在NIH3T3细胞中识别内源性Atg9Ap。为了检测不同小鼠组织中Atg9Ap的表达水平，使用抗体对每个组织的提取物进行Western blotting。如所示虽然Atg9Ap的表达水平依赖于组织，但发现Atg9Ap在小鼠组织中普遍存在。在每个组织中观察到的主要条带的分子量范围为～95 kDa至120 kDa。已知只有Atg9Ap的Asn99在HeLa细胞中被糖基化，但该分子有四个可能的N-糖基化位点(Young等人，2006年). 因此，小鼠Atg9Ap的糖基化可能因细胞类型而异(). 使用Western blots中Atg9Ap阳性主带的强度比较组织间Atg9Ap的表达水平(). 在大脑和脊髓中表达量最高，在十二指肠和空肠中表达量最低。这些结果表明Atg9A的表达具有组织依赖性。
Atg9Ap在小鼠不同组织中的分布。(A类)使用抗Atg9Ap（上面板）或抗GAPDH（下面板）抗体对各种小鼠组织裂解物进行Western blot分析。星号表示非特定带。(B类)不同小鼠组织中Atg9A的蛋白质水平与GAPDH的蛋白质水平相对。每个波段的强度A类测量，并使用等于1的脑比率计算Atg9Ap与GAPDH蛋白的量的比值。根据三个独立实验的结果计算平均值±标准误差。
Atg9Ap在中枢神经系统组织中的定位
由于Atg9Ap在中枢神经系统组织中的表达较高，我们使用免疫组织化学方法进一步检测Atg9Ap在小鼠大脑中的定位。如所示Atg9Ap的免疫反应主要定位于CNS神经元，但信号强度随脑区不同而不同；从外部颗粒细胞层（第二层）到多形层（第六层），大脑皮层神经元的免疫反应性很高()，海马锥体神经元()和小脑中的浦肯野细胞(和). 除了小脑中的浦肯野细胞外，在与浦肯野相邻的其他神经元细胞或小脑分子层中也发现了这种免疫反应(). 根据细胞的分布模式，这些免疫阳性细胞可能是篮形细胞。这些神经元中的免疫信号比Purkinje细胞中观察到的弱，但比颗粒细胞中检测到的弱信号强得多().
小鼠脑内Atg9Ap的免疫组织化学染色。大脑皮层的冷冻(A类)，海马(B类)和小脑(C类)用抗Atg9A抗体进行免疫染色，并用DAB进行可视化。扩大装箱面积C类如所示D类Atg9Ap的免疫反应性局限于各种类型的神经元。在小脑中，免疫信号在Purkinje细胞的核周区域强烈检测到，在分散在分子层的小神经元中也可以看到。ML，分子层；GL，颗粒细胞层。酒吧：A–C=100μm；D类=20微米。
Atg9Ap在Purkinje细胞中的定位
虽然Atg9Ap在Purkinje细胞中高度定位，但其在神经元中的确切作用尚待确定。为了揭示Atg9Ap在神经元细胞中的意义，用免疫细胞化学方法检测其与各种细胞器标记物的共定位，如下所示：BiP为ER标记物；ER的p115/顺式-高尔基体标记；GM130用于高尔基标记；γ-adaptin主要用于TGN标记；EEA1为早期内体标记；lamp1用于溶酶体/晚期内体标记；线粒体标记物中普遍存在的CK-Mi(). Atg9Ap的免疫信号主要与γ-adaptin和lamp1共定位，分别用作TGN和溶酶体/晚期内体的标记物(和). Atg9A免疫信号在ER中部分与BiP共定位(). 特别是，Atg9Ap和BiP在3周龄小鼠小脑浦肯野神经元中的协同表达更为显著(). 其他标记，包括p115、GM130()和EEA1在Purkinje细胞中染色良好，但未与Atg9Ap共定位（未显示p115和EEA1的数据）。此外，CK-Mi线粒体标记未与Atg9Ap共定位().
Atg9Ap在小鼠小脑浦肯野细胞中的定位(A–E)和3(F类)周龄。(A–F)小鼠浦肯野细胞与抗Atg9A抗体（绿色）和各种细胞器标记物的抗体（红色）共免疫：内质网的BiP(A、 F类); 高尔基器械用GM130(B类); γ-适应TGN(C类); lamp1用于溶酶体/晚期内体(D类); 线粒体肌酸激酶（CK-Mi）(E类). 细胞核用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚复染。酒吧：A–F=5μm；插入=2μm。
除了Atg9Ap在Purkinje细胞中的核周定位外，在轴突的初始部分也观察到了强烈的染色(–)，在树突中检测到微弱但明显的染色(). 因为已经证明，在Purkinje细胞的初始轴突段周围，轴突和篮状细胞的末端形成一个称为pinceau的致密丛，对VGAT呈阳性反应(Chaudhry等人，1998年;Miura等人，2006年)，我们还用VGAT对Atg9Ap进行了双重染色(). 此外，Atg9Ap与胶质细胞的GLAST或GFAP共染色(和)，NF-L代表轴突()和轴突末端的突触素(). 如上所述，VGAT免疫反应密集地存在于Purkinje细胞Atg9Ap阳性起始段周围的轴突和终末中，并与其中的Atg9Ap免疫信号共定位(). 然而，当VGAT阳性轴突和终末出现在Atg9Ap阳性Purkinje细胞体周围时，它们对Atg9Ap免疫反应基本呈阴性(). 在Purkinje细胞周围观察到GLAST和GFAP阳性星形胶质细胞(和). 然而，这些GLAST-和GFAP阳性细胞在Purkinje细胞层的Atg9Ap免疫信号大部分为阴性，尽管在某些情况下在GFAP或GLAST阳性星形胶质细胞中可以看到Atg9Ap的点状染色（数据未显示）。此外，Atg9Ap的免疫信号与穿过小脑白质的轴突中NF-L的免疫信息共存，尽管在这些轴突中相对较弱且不连续(). 此外，突触素的免疫反应定位于小脑深部核神经元周围的轴突终末，在这些突触素阳性的轴突末梢中也检测到Atg9Ap免疫阳性信号(). 与Purkinje细胞Atg9Ap阳性起始轴突末端周围篮细胞VGAT阳性轴突末端的密集分布比较()突触素阳性轴突终末散在小脑深核神经元周围(). 由于Atg9Ap阳性点在突触素阳性的轴突终末区数量较少，因此有一些突触素阴性终末缺乏Atg9Ap阳性点(). 共焦激光扫描显微镜经常证实这些轴突终末在双重染色小脑切片的其他断面上有小的Atg9Ap阳性点（数据未显示）。这些结果提示Atg9Ap可能参与轴突终末自噬体的形成。
Purkinje细胞层Atg9Ap和囊泡GABA转运体（VGAT）的双重免疫染色(A类)，玻璃(B类)和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）(C类)在Purkinje细胞层，白质中的神经丝-L（NF-L）(D类)和齿状核中的突触素(E类)小脑。Atg9Ap（绿色）的免疫染色在Purkinje细胞（箭头）的起始段强烈检测到(A–C)，虽然它很弱，但在枝晶中很明显（箭头所示）(C类). VGAT（红色）的免疫反应性在Purkinje细胞Atg9Ap阳性的初始轴突末端周围的轴突和篮形细胞的轴突末端中密集检测到，形成一个pinceau，其中Atg9Ap的免疫信号被共同定位(A类). 此外，Atg9Ap的免疫反应在GLAST或GFAP阳性的星形胶质细胞（红色）中没有共定位(B、 C). 在白质中，Atg9Ap-免疫阳性染色在NF-L免疫阳性的轴突中纵向运行（红色）(D类). 在齿状核中，Atg9Ap-免疫阳性的大神经元胞体被突触素阳性轴突终末（红色）包围，其中Atg9Ap的点状信号重叠或与突触素密切相关（红色）(D类). 酒吧：A–C、E=5μm；D类=20微米；插入E类=2微米。
讨论
本研究的主要发现如下：（1）免疫印迹和免疫组织/细胞化学证实抗Atg9Ap抗体可识别非糖基化和糖基化形式的Atg9Ap；（2） 虽然小鼠体内Atg9Ap的表达水平是组织依赖性的，但Atg9Ap的表达普遍存在于中枢神经系统组织中，尤其是神经元中；（3）除了TGN-溶酶体循环外，Atg9Ap在Purkinje细胞体的内质网中也有部分表达，在细胞的轴突末端也有明显表达。
虽然在酵母中发现了Atg蛋白定位的PAS，但其在哺乳动物细胞中的存在尚未得到证实。然而，就像酵母中的PAS膜一样，鉴定哺乳动物细胞中自噬体形成的膜来源非常重要。由于Atg9Ap是唯一的Atg膜蛋白，有人认为Atg9Ap在自噬体形成过程中运输膜；该蛋白定位于TGN和晚期内体，在饥饿条件下在这些细胞器之间动态循环(Young等人，2006年;Webber等人，2007年). 事实上，一代Atg9A缺陷小鼠表明，该蛋白对新生儿饥饿期间的生存至关重要(Saitoh等人，2009年).
然而，除了通过Northern blot分析显示人类Atg9A mRNA普遍表达的研究外，还没有关于体内细胞和组织分布的研究(Yamada等人，2005年;Young等人，2006年). 为了检测Atg9Ap在小鼠组织中的分布，我们制备了一种抗Atg9Ap抗体，通过Western blotting和小鼠组织样品的免疫组织化学/细胞化学以及ECFP–Atg9A转染和Atg9AmRNA击倒NIH3T3细胞，证实该抗体能特异性识别多种形式的内源性Atg9Ap。人类Atg9A mRNA的表达普遍存在，但在骨骼肌中表达最高(Yamada等人，2005年;Young等人，2006年). 使用实时PCR方法测量Atg9A mRNA证实了这一结果（数据未显示）。然而，小鼠Atg9Ap的表达是组织依赖性的，并且在大脑中表达最高。这些结果表明，Atg9A在小鼠组织中的蛋白表达可能以翻译后方式进行调节。
据我们所知，这是首次报道Atg9Ap广泛分布于大脑神经元的证据。特别是，免疫细胞化学显示Atg9Ap在Purkinje神经元的γ-适应性蛋白阳性TGN和lamp1-阳性溶酶体/晚期内体中共定位。这些结果与Young等人（2006）他报告说，Atg9Ap在培养细胞中的TGN和晚期内体之间动态循环。虽然有人认为Atg9p部分定位于酵母中的线粒体(Reggiori等人，2005年)培养细胞的线粒体中不存在内源性和过表达的小鼠和人类Atg9p(Yamada等人，2005年;Young等人2006;Webber等人，2007年). 在本研究中，Atg9Ap未定位于中枢神经细胞CK-Mi阳性线粒体。除了TGN/溶酶体定位外，该蛋白还定位于BiP-阳性ER中，尤其是在幼年小鼠的大脑中。有趣的是，最近的研究表明，ER为自噬体的形成提供了与双FYVE结构域蛋白1有关的重要成分(Axe等人，2008年). 此外，电子显微镜断层扫描显示ER膜与自噬体膜具有直接连续性(Hayashi-Nishino等人，2009年;Ylä-Antila等人，2009年). 由于Atg9Ap是唯一的Atg膜蛋白，它在内质网中的定位强烈表明内质网膜参与了中枢神经系统神经元的自噬体形成。
虽然Atg9Ap的免疫信号主要在神经元体、轴突和轴突终末检测到，但一些神经元，如小脑中的颗粒细胞，对Atg9Ap信号的反应微弱或呈阴性。我们目前关于VGAT阳性轴突终末的数据与之前报道的结果一致，VGAT在Purkinje细胞的初始轴突终端周围形成一个密集的网络(Chaudhry等人，1998年;Miura等人，2006年). 在篮状细胞的VGAT阳性轴突终末发现Atg9Ap阳性点。由于Purkinje细胞层中存在星形胶质细胞，我们还检测了Atg9Ap和GFAP或GLAST的双重免疫染色，以检测星形胶质细胞标记物(Shibata等人，1997年)发现在Purkinje细胞层的GFAP或GLAST阳性星形胶质细胞中，Atg9Ap免疫信号基本呈阴性。因为自噬在维持细胞内环境稳定中起着关键作用(Mortimore and Poso 1987年;Kuma等人，2004年;Meijer和Dubbelhuis 2004)，我们不能排除Atg9Ap阳性点存在于星形胶质细胞中的可能性。
我们之前已经证明，组织蛋白酶D缺陷型或组织蛋白酶B和L双重缺陷型小鼠大脑胼胝体的轴突中积聚有对LC3（一种自噬体标记物）呈阳性的双膜自噬小体(Koike等人，2005年)表明自噬体在轴突内形成。此外，已有研究表明，Atg5/Atg7是维持轴突末端代谢所必需的，任何一种基因的缺失都会导致轴突病变，导致神经元变性(小松等人，2007年;Nishiyama等人，2007年). 除这些数据外，我们目前的结果显示，Atg9Ap存在于Purkinje细胞的轴突和轴突末端，这是Atg9Ap参与这些区域自噬体形成的有效论据。此外，非常有趣的是，Atg9Ap的免疫信号强烈存在于篮细胞的VGAT阳性轴突末端和Purkinje细胞的初始轴突段中(). Atg9Ap在这些突触前和突触后区域密集定位，代谢转换被认为是活跃的，这可能进一步支持我们的假设，即Atg9Ap参与自噬体的形成。
总之，使用Atg9Ap特异性抗体获得的本研究结果表明，该蛋白定位于小鼠小脑Parkinje细胞的ER、TGN和溶酶体/晚期内体。此外，Atg9Ap在Purkinje和篮状细胞的轴突末端以及Purkinje细胞的内质网中的定位表明，Atg9 Ap是唯一的膜Atg蛋白，可能在自噬体形成的启动中起重要作用。
致谢
这项工作得到了日本科学促进会创新科学研究赠款的支持。
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