结果
K14-HPV16转基因小鼠在新生血管形成过程中早期MMP-9表达上调
在HPV16转基因小鼠中，广泛的细胞外基质（ECM）重塑发生在肿瘤进展的早期，表现为胶原纤维降解和上皮基底膜变薄(Coussens等人，1996年). 为了表征与ECM重构相关的蛋白水解酶活性，我们使用明胶底物酶谱来揭示分期肿瘤组织裂解液中胶溶活性的时间变化(). MMP-9的前酶形式在正常皮肤中未检测到，但在增生、异常增生和肿瘤组织中逐渐上调。活性MMP-9在一些增生症中检测到低水平，并且在100%的异型增生和肿瘤组织裂解物中丰富(). 正常皮肤中也未检测到明胶酶A/MMP-2（潜伏和活性），但在增生、异常增生和肿瘤裂解物中存在前酶形式。值得注意的是，活性MMP-2仅在肿瘤的裂解物中检测到(). 明胶酶谱法也在增生异常和一些肿瘤组织裂解物中检测到丝氨酸蛋白酶，即肥大细胞蛋白酶-4(Coussens等人，1999年).
MMP-2和MMP-9在HPV16转基因小鼠上皮癌发生过程中被激活阴性窝友（正常）和K14-HPV16转基因小鼠耳部皮肤活检的明胶底物酶谱分析，这些转基因小鼠具有增生（hyp）、异常增生（dys）和II级SCC。箭头表示酶活性的位置，对应于MMP-9和MMP-2的前体和活性形式。分子量标记（kDa）如左图所示。
MMP-9的缺失降低了癌症的发病率
为了评估HPV16转基因小鼠肿瘤进展过程中MMP-9活性升高的功能意义，我们采用了一种遗传方法，利用携带纯合子断裂的小鼠基质金属蛋白酶-9基因(Vu等人，1998年). 将四代HPV16/MMP-9+/-小鼠培育成FVB/n（n=76），在表型和组织病理学上与对照HPV16转基因小鼠（n=133）没有区别。HPV16/MMP-9+/-小鼠具有100%的外显率，在断奶时会出现肉眼可见的皮肤增生，随后在4个月大时会出现血管生成性发育不良（数据未显示）。HPV16/MMP-9+/-小鼠在12个月龄时表现出与HPV16/MMP-9+/-小鼠（50%）相似的SCC发展潜伏期和发病率（46%），最早的癌症也在约3个月龄出现().
HPV16/MMP-9–/–小鼠SCC数量较少，但恶性程度更高（A） 三个队列中无SCC-free转基因小鼠的百分比：HPV16/MMP-9+/+，n=133（FVB/n N14-N20；黄色三角形），HPV16/MMP-9+/-，n=76（FVB/n N4；粉红色方块），以及HPV16/MMP-9-/-，n=137（FVB/n N4；蓝色菱形）。HPV16/MMP-9+/+和HPV16/MMP-9+/-小鼠的SCC总发病率约为50%（分别为50%和47%）。相反，HPV16/MMP-9–/–小鼠SCC的发生率降低至约25%（Fisher精确检验，p=0.0004）。
（B） 中间丝的免疫染色（棕色染色）显示了不同级别SCC中保留的角质形成细胞分化程度。分化良好的I级SCC表现出标志性的角蛋白-珍珠结构（星号），表达基底上角蛋白K10，而不表达简单角蛋白K8。二级SCC分化程度较低，同时表达K10和K8。相反，低分化III级SCC失去终末分化能力，不表达K10，同时保持K8的表达。IV级SCC具有梭形细胞形态，K10表达有限，主要表达间充质中间丝蛋白波形蛋白。棒材：50μm。
（C） MMP-9–/–小鼠肿瘤分级的改变。SCC收集自面板（A）中显示的三组小鼠（HPV16/MMP-9+/+，133只小鼠，67只侵袭性SCC小鼠，共80个SCC；HPV16/MMP-9+/-，76只小鼠，35只侵袭性SC小鼠，共43个SCC），并根据面板（B）中的标准进行分级。MMP-9充足/HPV16（+/+和+/-）队列的SCC分级谱相似，没有发生IV级SCC。相反，MMP-9缺陷（–/–）转基因小鼠的SCC谱发生改变，倾向于分化程度较低、恶性程度较高的癌症（p<0.0001，可变等级的Wilcoxon评分）。
相反，HPV16/MMP-9–/–小鼠（n=137）在特征性增生和异常增生表型的发育方面表现出明显的延迟。断奶时，HPV16/MMP-9–/–小鼠没有表现出增生，也无法与MMP-9-/–非HPV16同卵鼠进行表型区分（数据未显示）。然而，到2个月大时，100%的HPV16/MMP-9–/–小鼠出现轻度表皮增生，特征是所有角质形成细胞层增加2倍，保留完全的终末分化能力，基质重塑最小，炎症细胞浸润，更典型的是3至4周龄的HPV16对照（数据未显示）。到4个月大时，只有约20%的HPV16/MMP-9表现出发育不良，其特征是角质形成细胞终末分化丧失、角质形成淋巴细胞增殖增加、炎症细胞浸润和血管生成加剧。到7个月大时，90%已发展为异型增生；然而，与年龄匹配的对照组相比，发生的病变更具局限性，皮肤受累程度有限。HPV16/MMP-9–/–小鼠的恶性转化率也降低。只有27%的HPV16/MMP-9–/–小鼠（p<0.0001；Fisher's Exact Test）发生肿瘤，而MMP-9高产/HPV16小鼠的发病率约为50%(). 在所有三个队列（+/+，+/-，–/–）中，每只小鼠的SCC平均数量（1.06%±0.12）及其解剖位置（耳朵，23%–29%；躯干，51%–54%；头部，5%–16%；附件，10%–12%）没有显著变化。
HPV16/MMP-9引起的肿瘤–/–小鼠更恶性
MMP-9高产/HPV16小鼠中出现的肿瘤代表了基于特征性上皮分化标记物的一系列癌症等级，主要包括高分化（I级）癌、罕见低分化（III级）癌和罕见IV级癌(). 因为MMP-9缺陷/HPV16中产生的SCC的频率较低，潜伏期延长，所以我们预计它们将趋向于更终末分化的癌症表型。为了评估这一点，我们根据角蛋白中间丝同种型的表达对肿瘤进行了分级(布罗德斯，1932年;莱恩和亚历山大，1990年;Coussens等人，1996年). 分化程度最高的肿瘤表达角蛋白10和14，但不表达简单上皮角蛋白K8，并被归类为I级SCC(). 表达K10、K14和K8的肿瘤被归类为II级SCC，而低分化肿瘤不再表达K10，但保留K14和K18的表达，则被归类为III级SCC(). 我们将梭形细胞外观的癌定义为IV级SCC，与上皮-间充质转化相一致，后者抑制角蛋白中间丝的表达，并增加间充质细胞标记物波形蛋白的表达(Sternlicht等人，1999年;).
值得注意的是，与HPV16/MMP-9+/-和+/+对照组的肿瘤相比，HPV16/MMP-9–/-小鼠的肿瘤分布偏向于表达分化程度较低的肿瘤或代表较高恶性等级的胚胎表型的肿瘤。在没有MMP-9的情况下，分化良好的I级癌症从57.5%（MMP-9阳性/HPV16小鼠）下降到了MMP-9阴性小鼠的21.4%。相比之下，在没有MMP-9的情况下，II级、III级和IV级癌症的百分比都增加了（II级，35%至42.8%；III级，7.5%至28.5%；IV级，0%至7.1%；p<0.0001，可变级别的Wilcoxon评分；).
MMP-9缺乏/HPV16小鼠角质形成细胞增殖受限
肿瘤的侵袭性通常根据其失去正常分化特征的程度和增殖细胞的比例进行分级。为了解决后一个参数，通过溴脱氧尿苷（BrdU）掺入分析角质形成细胞增殖，结果表明，与HPV16/MMP-9+/-对照组相比，HPV16/MMP-9/-小鼠在所有时间点和组织学阶段都显著降低(). 尽管HPV16小鼠中MMP-9的缺失只会使特征性异型增生和血管生成的进展延迟约3-5个月，但角质形成细胞从未完全达到特征性的阶段性增殖增加，即使对组织学上相似的组织进行比较（尽管年龄不同），例如：。，增生与增生、异型增生与异型增生或分级相似的肿瘤。因此，与对照组相比，尽管MMP-9缺乏的SCC倾向于恶性程度更高，但角质形成细胞增殖仍受到抑制().
HPV16/MMP-9–/–小鼠癌变各阶段上皮增生减少溴脱氧尿苷（BrdU）阳性角质形成细胞在年龄匹配的正常FVB/n阴性窝友（-LM；[1]，MMP-9–/–[1]）、HPV16/MMP-9+/-和HPV16/MMP-9-/–小鼠1个月和2个月[2]、3个月和4个月[3]、5个月以上[4]和II级SCCs[5]的百分比。从每个年龄组五只小鼠的至少五个高倍（40×）视野中计数BrdU阳性角质形成细胞。结果显示为平均百分比，±平均值的标准误差。各组的P值（未配对、非参数Mann-Whitney）分别为0.66[1]、0.11[2]、0.73[3]、0.03[4]和0.06[5]。
该途径中MMP-9存在时癌前阶段的初始诱导和日益强烈的血管生成特征（Smith-McCune，1997；Coussens等人，1999年)也受到影响：在MMP-9缺乏的增生和异型增生中，血管生成与角质形成细胞增殖一样减弱。然而，虽然角质形成细胞增殖永远不会达到野生型平台，但血管生成最终会达到，但会延迟数月（数据未显示）。
反应性基质细胞在肿瘤进展中提供MMP-9
鳞状上皮伤口边缘角质形成细胞中MMP-9的增殖增加和上调被认为对这些角质形成上皮细胞具有迁移优势(Madlener等人，1998年). MMP-9缺乏/HPV16小鼠角质形成细胞增殖能力的降低可能是由于HPV16阳性角质形成细胞核中缺乏MMP-9。因此，我们试图确定HPV16转基因皮肤中MMP-9的细胞来源().
肿瘤组织中MMP-9存在于反应性基质细胞中（A–C）对正常皮肤和HPV16转基因皮肤的肿瘤组织进行原位杂交分析，以检测MMP-9 mRNA的表达。正常非转基因耳部皮肤（A）、HPV16异型耳部肌肤（B）和II级SCC（C）的耳部组织切片的黑视野照片。显示组织的表皮（e）、真皮（d）、软骨（c）、恶性肿瘤角质形成细胞（t）和肿瘤基质区域。上皮基底膜用虚线标记。棒材：50μm（A）；100μm（B和C）。
（D–I）正常和HPV16转基因皮肤切片中MMP-9（棕色染色）的免疫定位，用来自正常非转基因耳朵（D）、发育不良耳朵皮肤（E）和II级SCC（F）的甲基绿进行复染。高倍镜显示发育不良肥大细胞颗粒中存在MMP-9（G，箭头），与我们之前的观察结果一致(Coussens等人，1999年). 此外，在中性粒细胞中发现MMP-9，在发育不良和癌中都有典型的双叶细胞核（H，箭头所示）。在肿瘤中，MMP-9也存在于具有特征性膜皱褶和指状突起的巨噬细胞（I，箭头）以及ECM（F，箭头）中。显示表皮（e）、真皮（d）、软骨（c）、恶性肿瘤角质形成细胞（t）、肿瘤基质和毛细血管（*）。上皮基底膜用虚线标记。棒材：50μm（D）；75微米（E）；20微米（F）；10微米（G）；7μm（H，I）。
通过石蜡层组织活检原位杂交分析确定，正常非转基因皮肤的上皮或真皮隔室中不存在MMP-9 mRNA(). 在特征性增生性皮肤中，MMP-9 mRNA未被检测到，除了在邻近皮肤擦伤的孤立基底角质形成细胞和一些毛囊中（数据未显示）。相反，MMP-9 mRNA在异型增生皮肤中的表达广泛见于真皮中的反应细胞(). 在肿瘤中，mRNA表达主要在毛细血管周围的细胞和肿瘤相关成纤维细胞亚群中检测到(). 因此，MMP-9 mRNA在肿瘤皮肤中显示出双重定位：它主要局限于基质中的细胞，而不是进化中的癌细胞；毛囊中零星的基底角质形成细胞也表达MMP-9。
由于反应性炎症细胞可以将proMMP-9以预制颗粒的形式传递到病变组织，我们还通过MMP-9特异性抗体在HPV16肿瘤组织中的免疫定位来评估前MMP-9和活性MMP-9的存在(). 正常非转基因皮肤中未检测到MMP-9蛋白(). 在增生性皮肤中，MMP-9仅在基质室中分离的毛细血管相关细胞中观察到（数据未显示）。相反，基质室中的许多细胞检测到MMP-9在增生异常皮肤和癌中的表达(). 高倍镜下，细胞核和细胞质颗粒形态表明肥大细胞()和中性粒细胞()是癌前组织中MMP-9的主要来源。在肿瘤中，与毛细血管相关的中性粒细胞中也发现MMP-9()，在分离的巨噬细胞中()和肿瘤核心的ECM(). 与我们之前的观察结果一致(Coussens等人，1999年)尽管MMP-9阳性的肥大细胞与周围侵袭性肿瘤叶相关，但我们在实体瘤的核心中未检测到表达MMP-9的肥大上皮细胞。因此，在癌基因阳性的肿瘤细胞中未检测到MMP-9；相反，它存在于ECM和SCC途径的癌前和恶性阶段填充基质的反应性炎症细胞中。
表达MMP-9的炎症细胞可恢复HPV16的特征表型
数据记录了MMP-9在上皮增生、血管生成和恶性潜能中的功能参与，并揭示了在发育不良和肿瘤的基质中表达MMP-9的主要细胞是炎症细胞。巨噬细胞、中性粒细胞和肥大细胞都来自骨髓中的造血干细胞(魏斯曼，2000). 如果炎症细胞是MMP-9的主要提供者，那么用MMP-9+/+骨髓源性（BM-d）细胞重建MMP-9缺陷/HPV16骨髓应能恢复特征性肿瘤表型，如MMP-9-/-小鼠软骨内骨化所见(Vu等人，1998年). 因此，我们对1个月大的HPV16/MMP-9–/小鼠进行致命照射（7.5 Gy），并用野生型（MMP-9+/+）或MMP-9-/细胞重建其骨髓(). 野生型骨髓()成功植入HPV16/MMP-9–/–小鼠。移植后8周通过酶谱法检测MMP-9（3月龄小鼠；比较具有). 移植后16周（5个月大的小鼠），来自HPV16对照小鼠的发育不良裂解物的MMP-9水平（前和活性形式）是典型的（比较具有).
骨髓移植对MMP-9缺乏/HPV16小鼠MMP-9活性的恢复（A） 骨髓移植（BMT）方案，其中1个月龄小鼠（HPV16/MMP-9+/-，HPV16/MMP-9-/-）接受致命照射（7.5 Gy）并移植BM-d细胞（1×106)来自非转基因供体小鼠（MMP-9+/+或MMP-9-/-）。每个队列至少包含10只动物。当动物分别为3个月和5个月大时，在BMT后8周和16周进行耳部活检。对所有动物进行研究，直到肿瘤出现，或动物发展出符合健康的表型，或直到12个月大。（B） BM-d细胞（1×10）明胶底物酶谱6)来自MMP-9+/+（+/+，第1通道）和MMP-9–/–（–/–，第2通道）供体小鼠。箭头表示对应于proMMP-9的酶活性。
（C） 用野生型（+/+）或MMP-9缺乏（–/–）BM-d细胞（1×10）重建HPV16/MMP-9–/–小鼠组织活检的明胶底物酶谱6)BMT后8周和16周。显示存在对应于前MMP-9和活性MMP-9、前MMP-2和活性MMP-2的酶活性，以及一种无特征的明胶酶。分子量标记（kDa）如右图所示。
用MMP-9+/+BM-d细胞移植后()，HPV16/MMP-9–/–动物恢复到肿瘤进展的特征表型（4个月大时从增生到异型增生），类似于用MMP-9+/+BM-d细胞移植的对照HPV16/MMP-9+/-队列（数据未显示）。通过细胞周期调节增殖细胞核抗原（PCNA）评估，移植MMP-9+/+BM-d细胞的嵌合HPV16/MMP-9-/-小鼠恢复了肿瘤中角质形成细胞的过度增殖(). 相比之下，移植MMP-9–/–BM-d细胞的HPV16/MMP-9-/–小鼠的角质形成细胞增殖指数仍然较低().
骨髓来源细胞中的MMP-9足以恢复HPV16/MMP-9-/-小鼠的野生型新生表型（A） 来自未经辐射、未移植的HPV16/MMP-9+/+和–/–小鼠的I级和/或II级SCC中PCNA阳性角质形成细胞的百分比，以及来自经致命辐射并移植有野生型（+/+）或MMP-9缺陷型（–/–）BM-d细胞的HPV16/MMP-9+/-和–/-小鼠的PCNA阳性角朊细胞的百分比。从分析的至少五个高倍（40×）视野/肿瘤中计数PCNA阳性的角质形成细胞。显示的结果来自5个SCC，每个SCC来自未经辐照、未移植的HPV16/MMP-9+/-[46.6%±1.9]和-/-[32.3%±2.3]小鼠，5个SCCs来自辐照/移植的HPV 16/MMP-9+/-、BMT+/+[45.6%±5.0]和HPV16/MMP-9-/-、BMT-/-[45.9%±4.6]小鼠，以及1个SCC携带的HPV16/MMP-9-/-小鼠，BMT–/–[29.9%±5.1]小鼠（p<0.05，ANOVA[单向方差分析]）。结果显示为平均百分比，即平均值的±标准误差。
（B） 通过增殖细胞核抗原（PCNA）免疫反应测定四组小鼠II级SCC中角质细胞增殖：(一)HPV16/MMP-9+/-(b条)HPV16/MMP-9–/–(c（c）)HPV16/MMP-9–/–，用MMP-9+/+BM-d细胞照射和移植，以及(d日)HPV16/MMP-9–/–，用MMP-9-/–BM-d细胞照射和移植。中的注释(一)这种扩散在整个恶性肿瘤簇中是异质的，而在(b条)，增殖限制在基质近端3-4个细胞层内。MMP-9+/+BM-d细胞移植恢复角质形成细胞的特征性增殖模式(c（c）). 棒材：100μm(一–d日).
（C） 与未经辐照、未转基因的转基因动物（HPV16/MMP-9+/-，n=13，67只SCC小鼠；HPV16/MMP-9–/–，n=137只小鼠，37只患有SCC）。
值得注意的是，HPV16/MMP-9–/–小鼠的肿瘤除了增殖指数降低外，还显示出其角质形成细胞增殖模式的明显差异。然而，HPV16/MMP-9+/+和+/-小鼠肿瘤中的角质形成细胞（如S期标记物BrdU和PCNA所示）在整个恶性集群中都有增殖(，面板一)，HPV16/MMP-9-/-小鼠肿瘤中增殖的角质形成细胞仅限于与基质紧密贴壁的上皮层(，面板b条). 通过移植+/+BM-d细胞，HPV16/MMP-9-/-小鼠角朊细胞增殖的弥散模式得以恢复(，面板c（c）)而不是通过移植MMP-9–/–BM-d细胞(，面板d日). 这些数据提供了证据，证明肿瘤细胞的过度增殖不仅受肿瘤细胞固有因素（如E6/E7癌基因表达）的控制，而且在MMP-9的控制下，还受来自基质的因素的外部调节。
此外，MMP-9/HPV16嵌合小鼠（MMP-9的唯一来源是BM-d细胞）的SCC发生率（50%）与野生型相同(). 相比之下，移植MMP-9–/–BM-d细胞的HPV16/MMP-9-/–小鼠表现出肿瘤进展延迟（数据未显示）和癌症发病率较低(). 有趣的是，致命照射HPV16/MMP-9+/-小鼠并移植+/+BM-d细胞后，SCC的发病率增加（70%）。发病率的增加并不是致死性全身照射的简单结果，因为HPV16/MMP-9–/–小鼠经致死性照射并移植MMP-9-/–BM-d细胞后，其未经照射、未移植的对应物中观察到约20%的肿瘤发病率。这种影响值得进一步调查。
讨论
这项工作揭示了MMP-9在鳞癌发生过程中的调节能力。我们发现，MMP-9增加了癌基因表达的角质形成细胞的过度增殖率并拓宽了其分布，促进了发育不良向弗兰克癌的恶性转化，并影响了新兴肿瘤的分化特征。此外，MMP-9将这些调节能力作为旁分泌因子传递给癌基因阳性肿瘤细胞，这些旁分泌因子来源于被征召来支持肿瘤生长和进展的反应性炎症细胞。
MMP-9对旁分泌细胞生长的调节
MMPs，包括MMP-2和MMP-9，在多种人类和动物癌症中表达，其作用历来与侵袭和转移表型相关，特别是在利用培养的肿瘤细胞进行生物检测时(Nelson等人，2000年). 相反，使用缺乏MMP-9的转基因小鼠已经清楚地证明了这种MMP在HPV16癌基因诱导的新生鳞癌模型中的作用大不相同。缺乏MMP-9的HPV16小鼠限制了角质形成细胞的过度增殖，延缓了从增生到异型增生到侵袭性癌的肿瘤进展。增生和异型增生下真皮血管生成的双相诱导和扩增被延迟。HPV16小鼠的总体癌症发病率从50%降至27%。值得注意的是，根据基于上皮分化标志物的经典鳞状细胞癌分级标准评估，不太常见的癌症，包括较少的增殖角质形成细胞，更具恶性。因此，在肿瘤进展过程中，MMP-9起到旁分泌调节器的作用，刺激癌基因阳性角质形成细胞的增殖和恶性转化，促进血管生成，但限制肿瘤进展到更具侵袭性、低分化阶段。
如何将这些影响合理化？根据目前的知识，我们可以设想几种可能的情况。MMP-9缺乏/HPV16小鼠角质形成细胞的增殖模式和百分比表明，MMP-9可能动员了一种扩散性较差的生长因子。在没有MMP-9的情况下，上皮细胞的增殖仅限于基质最靠近的一层或两层细胞，无论是在发育不良还是在癌细胞的叶片中，而有功能性MMP-9时，增殖细胞分布在两个病灶中。也许连接到细胞表面或储存在基质中的生长因子被MMP-9释放，使其能够更广泛地扩散，产生观察到的均匀细胞增殖模式。事实上，蛋白酶对生长因子的储存和释放具有优先性(Werb，1997年;Bergers和Coussens，2000年;Yu和Stamenkovic，2000年). 我们预计MMP-9还通过改变生物可利用的血管生成生长因子的局部平衡来调节血管生成。在另一种小鼠胰腺胰岛癌模型中(哈纳汉，1985年)，我们最近已经证明，MMP-9再次有助于调节血管生成，并且它在一定程度上是通过使血管生成诱导分子VEGF更容易被内皮细胞上的受体利用来实现的(Bergers等人，2000年). 值得注意的是，VEGF也在HPV16模型中表达(Smith-McCune等人，1997年). 在这两种模型中，MMP-9的缺失会延迟血管生成并降低肿瘤发生率；由于血管生成最终被激活，肿瘤确实形成，因此隐含着代偿机制。这显然不是肿瘤角质形成细胞增殖的情况，因为它们的增殖指数和模式都没有随着随后的进展而恢复。
对于在缺乏MMP-9的情况下所见的增殖减少和分化改变缺乏生长因子动员的另一种解释可能在于靶细胞的性质。在MMP-9缺失的环境中，可能癌基因阳性的角质形成细胞正在进行肿瘤进展和恶性转化，其来源于更原始的鳞状干/祖细胞，可能对HPV16癌基因有不同的反应，对基质支持有不同的要求，增殖和分化特征随之改变。据信，干细胞的增殖速度比其子代慢，并保留胚胎的未分化特征(魏斯曼，2000). 描述表皮干/祖细胞与基底角朊细胞的标记物尚不完全明确(Jensen等人，1999年)但应该允许这种可能性在未来得到解决。
炎症细胞作为共刺激物在致癌中的作用
这项研究的一个显著结果表明，骨髓源性炎症细胞是MMP-9的充足来源，可以证明这种蛋白酶对HPV16鳞状细胞癌变途径的作用。预测发展中的癌细胞表达MMP-9，以诱导血管生成和实现扩散过度增殖能力的形式来控制自己的命运，这并非不合理。但数据显示情况并非如此。虽然细胞培养中的角质形成细胞可以明显表达MMP-9（参见Coussens and Werb，1996年;钱伯斯和马特里斯，1997年)我们发现MMP-9不是由体内角质形成细胞生成的；相反，增生、异型增生和癌症基质中的细胞表达MMP-9 mRNA和蛋白。将MMP-9+/+BM-d细胞转移到MMP-9缺陷/HPV16小鼠中，恢复了该蛋白酶在鳞状细胞癌变中的所有表型：在所有阶段的弥漫性角质形成细胞增殖、丰富的血管生成，以及50%的动物在1年内侵袭性癌症的进展；此外，低度恶性肿瘤的优势也得到了恢复。因此，炎症细胞是MMP-9在这一致癌途径中的关键供应商。但哪种骨髓衍生细胞类型呢？在本研究中，我们观察到中性粒细胞在发育不良和癌症中大量存在。肥大细胞普遍存在于增生、异型增生和浸润性癌前病变中，而巨噬细胞则存在于肿瘤中；所有三种细胞类型都表达MMP-9。T淋巴细胞，也表达MMP-9(Weeks等人，1993年)，也存在于这些小鼠的肿瘤病变中（D.Daniels、L.M.C.和D.H.，未发表的数据）。这些BM-d细胞中的每一个都可能有助于MMP-9的供应；单个细胞类型的有条件基因消融应该能够评估其贡献。
从我们的数据中可以清楚地看出，这些炎症细胞的主要作用是向病变组织传递MMP-9。然后，这个单基因产物协调了HPV16癌基因启动的恶性表型的完整表现所必需的多个参数。尽管这些炎症细胞可能不会被癌基因“转化”或失去抑癌基因，但它们通过增强血管生成和肿瘤细胞增殖，并影响恶性癌症的进展，显然为发展中的肿瘤服务（这项工作，以及Coussens等人，1999年). 然而，值得注意的是，BM-d细胞并不是肿瘤微环境中唯一的旁分泌细胞。肿瘤成纤维细胞也有助于癌症表型(布德劳和比塞尔，1998年;Masson等人，1998年;Olumi等人，1999年)内皮细胞被广泛研究为可行的抗癌靶点。肿瘤病灶中引发炎症反应的信号尚待阐明。
这项研究揭示了炎症细胞表达MMP-9的重要作用，这提出了一个问题，即这些细胞或该因子是否代表了更易控制的抗癌治疗靶点。如果我们的结果，即MMP-9促进血管生成和肿瘤生长，并由炎症细胞提供，可以推广到人类癌症，我们设想炎症细胞类型可能成为抗癌药物靶向的另一类重要肿瘤相关细胞。虽然MMP-9肯定是这些BM-d细胞的关键基因产物，但它可能不是唯一的一个。当然，需要注意的是，对提供MMP-9功能的炎性细胞进行药物抑制也可能导致进展为低分化癌症。尽管如此，COX-2抑制剂等抗炎药的疗效似乎是可信的(福斯林，2000)血管生成抑制和癌症化学预防是由于提供MMP-9的炎症细胞的募集和/或功能受损。
因此，出现了一种新的观点，即肿瘤是复杂的多细胞企业，其中表面上正常的细胞被转化的癌细胞征用，从而对肿瘤表型做出重大贡献(Boudreau和Bissell，1998年;哈纳汉和温伯格，2000年). 特别是，这项研究表明，炎症细胞，尤其是那些表达MMP-9的细胞，在鳞癌发生过程中可能是肿瘤细胞的帮凶。
实验程序
K14-HPV16转基因和MMP-9缺失小鼠及其组织制备
K14-HPV16转基因小鼠(Arbeit等人，1994年)以前曾报道过基于角蛋白中间丝表达的肿瘤分期特征以及组织切片的制备(Coussens等人，1996年). 据报道，MMP-9纯合缺失动物的产生(Vu等人，1998年). 在与HPV16转基因小鼠（N21 FVB/n）杂交之前，将MMP-9+/-小鼠培育四代成为FVB/n.，进而产生MMP-9缺乏型（–/–；n=133）和MMP-9高产型（+/-；n=76）HPV16小鼠。
底物酶谱
根据相邻皮肤石蜡包埋切片的组织学分析，对代表肿瘤进展不同组织学阶段的组织样品进行称重，然后在含有50 mM Tris-HCl（pH 8.0）、150 mM NaCl、1%NP-40、0.5%脱氧胆酸盐、0.1%十二烷基硫酸钠的裂解缓冲液中均质（重量与体积的比值为1:4）。通过离心分离可溶性和不溶性提取物，然后在-20°C下储存。通过明胶酶谱分析等量的可溶性提取物(Herron等人，1986年a,b条)在样品缓冲液（10%十二烷基硫酸钠，0.25 M Tris-HCl，0.1%溴酚蓝，pH 6.8）中与底物（1 mg/ml明胶）共聚的10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上。电泳后，将凝胶在2.5%Triton X-100中清洗两次15分钟，并在37°C的50 mM Tris-HCl和10 mM CaCl中培养16小时2（pH 7.6），然后在0.5%考马斯蓝中染色并在50%甲醇中脱色。阴性染色表示活性蛋白酶带的位置。在凝胶分离过程中，组织提取物中的原酶暴露于SDS会导致激活，而不会发生蛋白水解断裂(Talhouk等人，1991年). 为了抑制MMP蛋白水解活性，底物凝胶在底物缓冲液中与4 mM 1,10-菲咯啉（Sigma）孵育，如所述(Adler等人，1990年). 数据如所示是对K14-HPV16转基因小鼠中代表肿瘤进展不同阶段的107个组织切片进行检查后获得的代表性结果。数据如所示是从每个队列中的单个小鼠（n=10）中取出的活组织切片产生的具有代表性的裂解物。
原位杂交
如前所述，对正常和转基因皮肤的5mm石蜡包埋切片进行原位杂交分析(Coussens等人，1996年). 含有小鼠MMP-9 cDNA 323碱基对片段的线性化质粒（pSP65-92 KD-2）(Reponen等人，1994年)标记为35S用作探针。在2×SSC中以65°C的最终严格度清洗载玻片，将其浸入光乳剂中，并暴露12天和26天。用苏木精和伊红对载玻片进行复染。
免疫组织化学
将转基因动物的组织块浸入3.75%多聚甲醛和磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，然后通过分级醇和二甲苯脱水，并包埋在石蜡中。使用Leica 2135切片机切割5μm厚的石蜡切片。如前所述，将切片脱蜡并进行免疫组织化学染色(Coussens等人，1996年). 用于兔抗MMP-9的稀释液（根据Behrendtsen等人，1992年)抗体为1:5000，小鼠抗BrdU（CalTag，克隆IU-4）为1:100，小鼠抗PCNA（BioGenex，克隆号19A2）为1:100:1500，兔抗角蛋白10（BabCo，抗体MK10）为1:2500，兔抗角蛋白14（BabCo，抗体MK14）为1:2500:150，大鼠抗K8（TROMA 1，德国罗尔夫·凯姆勒博士的礼物）为1:50，在含有PBS pH 7.4、2.5%山羊血清和1%牛血清白蛋白（BSA）的封闭溶液中，兔抗波形蛋白（DAKO，Clone Vim 3B4）的比例为1:50。在4°C下用一级抗体孵育过夜。在室温下与生物素化二级抗体（山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG或山羊抗小鼠IgM，1:200，Pierce Chemical）孵育30分钟后，根据制造商的说明，用3,3′-二氨基联苯胺（DAB；Sigma，）显示抗原。切片在1%甲基绿中复染（1分钟），在分级酒精（70%、95%、100%乙醇）中脱水，安装在Cytoseal 60（Stephens Scientific）中，并用Nomarski光学进行可视化。所有免疫定位实验在多个组织切片上重复三次，包括阴性对照，以测定可忽略不计的背景染色。所有图像均在配备滨松数码相机的徕卡DMR显微镜上进行数字捕获，并使用Improvision Open-Lab软件进行成像。
致命辐射与骨髓移植
对HPV16/MMP-9+/-和HPV16/MMP-9-/-小鼠进行7.5灰色（Gy）致命X射线照射。24小时后，用PBS冲洗新鲜分离的同基因股骨和胫骨的腔，获得野生型MMP-9充足（+/+）小鼠或MMP-9缺乏（-/-）小鼠的骨髓衍生细胞。用移液管将冲洗后的细胞分散，清洗后再悬浮在PBS中。有核细胞（1×106)在50毫升中，逆行移植到致死性辐射动物体内，每组10-12只动物。将2 mg/ml的新霉素添加到受照射小鼠的水中。验证植入，小（~1 mm2)在3个月龄和5个月龄时，从耳部皮肤上取下穿孔活检，并将其切成两半。每个穿孔活检的一半进行明胶酶谱分析，以测试MMP-9活性。每个穿刺活检的另一半被嵌入石蜡中（见上文），并用于组织病理学检查。
