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EMBO J。2010年2月3日；29(3): 619–631.
2009年12月3日在线发布。 数字对象标识：10.1038/emboj.2009.364
预防性维修识别码：项目经理2830700
PMID：19959994

IKK复合物有助于诱导自噬

阿尔弗雷多·克里奥洛,1,2,三，4 劳拉·塞诺维拉,1,2,三 Hélène作者,5 玛丽亚·恰拉·马乌里,1,2,三，6 尤金妮娅·莫塞利,1,2,三 伊利奥·维塔莱,1,2,三 奥利弗·凯普,1,2,三 埃兹吉·塔斯德米尔,1,2,三 洛伦佐·加卢齐,1,2,三 沈思慎,1,2,三 Maximilien裁缝,1,2,三 尼古拉斯·德拉海耶,2,三，7 安托万·泰斯尼尔,1,2,三 丹妮拉·德·斯特凡诺,6 阿梅娜·本·尤尼斯,1,2,三 弗朗西斯·哈珀,8 杰拉德·皮尔龙,8 塞尔吉奥·拉万德罗,4 劳伦斯·齐特沃格尔,2,三，7 阿兰以色列,9 Véronique波德,5和吉多·克罗默1,2,三，一
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摘要

为了应对压力，细胞启动转录和转录依赖性程序，从而导致适应或死亡。在这里，我们表明，包括营养物质耗竭在内的多种自噬诱导物触发IKK（IκB激酶）复合体的激活，该复合体因其在应激激活转录因子NF-κB中的关键作用而广为人知。组分活性IKK亚单位刺激自噬并转导多种信号，这些信号在饥饿诱导的自噬中起作用，包括AMPK和JNK1的磷酸化。NF-κB核转位的遗传抑制或p65/RelA NF-kb B亚单位的消融都不能抑制IKK诱导的自噬，表明IKK可以以NF-kb-非依赖性的方式促进自噬途径。在小鼠和人类细胞中，IKK亚单位（但不是p65）的敲除和/或敲除阻止了对多种刺激的自噬诱导。此外，IKK-β基因敲除通过食物剥夺或雷帕霉素注射抑制自噬激活体内，在小鼠中。总之，这些结果表明IKK在生理和药理刺激刺激自噬中起着重要作用。

关键词：缺氧、小鼠、NF-κB、雷帕霉素、饥饿

介绍

为了应对亚致死压力，细胞会产生反应，使其能够修复损伤并适应不断变化的环境。这种适应性反应包括不需要转录重编程的即时细胞质改变，并产生特定的亚细胞结构，如应激颗粒(安德森和凯德莎，2008年; 允许细胞储存并消除停滞的翻译起始前复合物）和自噬体(克林斯基，2004年; 使细胞消除受损的细胞器并调动能量储备）。自噬体是一种双膜小泡，通过隔离细胞器、长寿蛋白质和/或部分细胞质，介导大自噬（迄今称为“自噬”）的第一步。自噬体通过与溶酶体融合而成熟（从而成为所谓的“自溶体”），这导致其管腔内容物的降解(克林斯基，2004年;莱文和克罗默，2008年). 虽然缺乏对不同表现的细胞质应激反应的系统研究，但这些反应可能有共同的分母，例如翻译起始因子eIF2α的磷酸化依赖性失活，这是应激颗粒生成和自噬所必需的事件(凯德莎等, 2002;塔洛奇等, 2002).

对压力的适应通常涉及转录程序，如DNA损伤后p53所协调的转录程序(莱利等, 2008)，热休克转录因子（HSFs）对热休克的影响(Anckar和Sistonen，2007年)缺氧条件下缺氧诱导因子1（HIF-1）(塞门扎，2007年)和NF-κB对多种刺激作出反应(Baud和Karin，2009年). NF-κB二聚体通常通过与抑制性IκB蛋白的相互作用而被隔离在细胞质中。多重外部刺激导致IκB磷酸化，从而将其靶向泛素化和随后的蛋白酶体介导的破坏。IκB的降解使NF-κB二聚体转移到细胞核，在那里它们与几个靶基因相互作用，其中许多靶基因抑制凋亡，触发细胞周期进展并刺激炎症。IκB激酶（IKK）复合物由两个高度同源的催化激酶亚基（IKKα和IKKβ）和一个调节亚基（IKγ，也称为NEMO；Hacker和Karin，2006年). IKK复合物可以被上游激酶激活，上游激酶将其连接到TNF家族死亡受体、toll-like受体（TLR）家族的模式再认知受体或DNA损伤发出的信号(Hacker和Karin，2006年;珀金斯，2007年;Baud和Karin，2009年;瓦拉巴普拉普和卡林，2009年).

关于转录和细胞质对压力的反应之间的串扰有争议性的信息。缺氧可通过HIF-1介导的BNIP3等蛋白质的反式激活诱导自噬(张等, 2008)，但也可以以独立于HIF-1和BNIP3的方式发挥作用(帕潘德里欧等, 2008). p53可以诱导自噬诱导物如DRAM和SESN2的转录(克里顿等, 2006;布达诺夫和卡林，2008年)但可以通过转录依赖机制在细胞质水平抑制自噬(塔斯迪米尔等, 2008). 自噬与NF-κB之间的假定联系，NF-κ的B可能是应激最频繁激活的转录因子(珀金斯，2007年;Baud和Karin，2009年;瓦拉巴普拉普和卡林，2009年)这也是一个有争议的问题。根据一些研究，NF-κB可以通过反式激活自噬触发蛋白Beclin-1诱导自噬(科佩蒂等, 2009). 然而，NF-κB也被报道抑制自噬，例如在TNFα诱导的细胞死亡的情况下(贾瓦赫里·梅尔尼等, 2006)或肠杆菌感染的巨噬细胞(施洛特曼等, 2008). 胰岛素或TNFα诱导的IKKα或IKKβ的激活与结节性硬化症复合物1/2（TSC1/2）的磷酸化有关，导致mTOR的激活和自噬的抑制(李等, 2007;Dan和Baldwin，2008年). 此外，自噬本身可能有助于抑制NF-κB通路。因此，自噬已被证明可介导IKK复合物的三个亚基（α、β和γ）及其上游激活剂NF-κB诱导激酶（NIK；清等, 2007). 此外，自噬介导p62（也称为固碳体1）的特异性耗竭，p62参与IKK复合物的激活(马丁等, 2006;杜兰等, 2008).

基于这些不确定性以及无偏见的筛选结果显示IKK是自噬的假定调节器（见下文），我们决定研究NF-κB激活途径和自噬之间的可能联系。在这里，我们报道了IKK激活足以通过NF-κB非依赖机制促进自噬，并且IKK是最佳自噬诱导所必需的。

结果和讨论

自噬刺激可以激活IKK而不刺激NF-κB类

ICCB文库中包含的482种药物中，有20种药物能够将骨肉瘤U2OS细胞中饥饿诱导的自噬体标记GFP–LC3重新分布到细胞质点状物（伴侣介导的自吞噬过程中不会发生的大自噬特异性过程）减少65%以上(图1A). 在这二十种药物中，已知三种可以抑制IKK：BAY 11-7082是一种直接激酶抑制剂，格尔德霉素及其17-烯丙基氨基衍生物是HSP90的抑制剂，HSP90是IKK激活所必需的(布勒默等, 2004). 在这些结果的驱动下，我们研究了IKK对自噬的可能贡献。作为对自噬的最生理诱导物，营养素饥饿的反应(水岛和克林斯基，2007年)人宫颈癌HeLa细胞在丝氨酸177/181上表现出IKKα/β的磷酸化，在丝氨酸376上表现出了IKKγ/NEMO的磷酸化(图1B). 用mTOR抑制剂雷帕霉素诱导自噬时也发生了同样的情况(图1C)，p53抑制剂pifithrin-α(图1D)内质网应激源衣霉素或肌醇单磷酸酶抑制剂锂（数据未显示）。免疫沉淀的IKK复合物显示出磷酸化半合成IκBα衍生底物的能力增强在体外(图1E-G). 尽管饥饿、雷帕霉素或匹非他林-α激活自噬诱导了IκB的轻微磷酸化（与阳性对照相比，较小的是TNF-α），但EMSA测定，自噬未能刺激IκB丰度的明显减少或诱导NF-κB核移位(图1H–J)或NF-κB亚单位p65/RelA的免疫荧光检测(补充图S1). 因此，在HeLa细胞中，自噬诱导条件不会导致典型NF-κB靶基因的反式激活，例如肿瘤坏死因子-α,白介素-6,白介素-8和CCL-2型由NF-κB激活剂TNF-α诱导(补充图S2). 与这些观察结果一致，非小细胞肺癌（NSCLC）A549细胞在暴露于自噬刺激时，未能将GFP–p65融合蛋白转移到细胞核中(补充图S3). 在这些细胞中，TNFα被用作NF-κB活化的阳性对照(贾瓦赫里·梅格尼等, 2006)，诱导GFP–p65核移位(补充图S3)，但未能诱导自噬（数据未显示）。这表明TNFα刺激了一个尚不明确的自噬抑制信号(贾瓦赫里·梅格尼等, 2006). 最后，暴露于各种自噬诱导物的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）表现出NF-κB的轻微激活（与注射TNFα相比），主要是p65–p50异二聚体，与IκB降解相关(补充图S4). 总之，这些结果表明自噬诱导与IKK活化和IκB降解相关，但不一定与NF-κB活化相关。

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自噬诱导剂对NF-κB活化途径的影响。(一)在无偏见的筛选中鉴定IKK抑制剂为自噬抑制剂。如材料和方法部分所述，在添加化合物后12 h，测量ICCB化合物对稳定表达GFP–LC3和RFP–H2B的U2OS细胞营养剥夺的自噬抑制水平(B类–D类). 的影响(B类)饥饿(C类)雷帕霉素或(D类)pifithrin-α对IκBα水平和IKK复合物磷酸化状态的影响。将HeLa细胞暴露于自噬诱导剂中指定的时间，然后进行免疫印迹以测定指定的蛋白质。百分比值显示了GFP–LC3（%GFP–LC 3）间断分布的细胞比例真空细胞）。(E类–G公司)IKK复合物酶活性的测定。HeLa细胞按(B类–D类)用抗NEMO抗体进行裂解和免疫沉淀。测试免疫沉淀物的磷酸化能力在体外IκBα的半合成衍生物，GST-Iκaα（1-54）。用TNFα处理15分钟的细胞裂解液作为IKK（和NF-κB活化）的阳性对照。(H（H）–J型)NF-κB激活状态。EMSA用于测定NF-κB在细胞中的DNA结合能力(B类–D类). 结果代表了三个独立的实验。

IKK刺激NF中的自噬-κB独立方式

用组成活性（CA）IKKβ突变体转染（由于激活环S177E和S181E中两个丝氨酸的两个磷酸模拟点突变；水银等, 1997)或与构成激活IKK复合物的NEMO变体（MN-NEMO）结合（由于引入了以NEMO为靶向质膜的N-末端肉豆蔻酰化位点；威尔等, 2003)导致了几种自噬表现。这些包括GFP–LC3融合蛋白聚集到细胞质点(图2A和B)与LC3脂质化相关（免疫印迹进一步证实；图2C)以及作为自噬选择性底物的蛋白p62的降解(克利恩斯基等, 2008;图2A和C). 阻断IKK酶活性（使用化学抑制剂BAY11-7082）可阻止CA-IKKβ和MN-NEMO诱导自噬(图2B). HeLa细胞胞质点中GFP–LC3聚集增强(图2)以及其他六种转染CA-IKKβ或MN-NEMO的人类或小鼠细胞系（数据未显示）。理论上，自噬体的积累可能反映了自噬隔离的增加或与溶酶体融合后自噬小体的清除减少(克利恩斯基等, 2008;莱文和克罗默，2008年). 在溶酶体抑制剂巴非霉素A1（BafA1）有效抑制溶酶体和自噬体融合的条件下(补充图S5A和B)CA-IKKβ和MN-NEMO继续增加以GFP–LC3聚集为特征的细胞百分比(补充图S5C)表明IKK激活确实刺激了自噬隔离。透射电子显微镜（TEM）证实了在表达CA-IKKβ或MN-NEMO的HeLa细胞中存在双膜自噬体和单膜自溶体(图2D和E). CA-IKKβ和MN-NEMO的自噬诱导作用明显强于未修饰的对应物IKKβ及NEMO(图2B-F). 组分活性IKKβ和MN-NEMO分别弥散分布于质膜，与GFP–LC3点无明显共定位(补充图S6). 自噬机制的必需蛋白（即Atg10、Atg12、Beclin-1和Vps34）的敲除消除了由CA-IKKβ或MN-NEMO触发的GFP–LC3聚集增加(图2F)，证实这一现象反映了真诚地自噬。

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IKK激活自噬。(一,B类)CA-IKKβ或MN-NEMO诱导GFP-LC3聚集。用GFP–LC3编码质粒和pcDNA3.1载体或构建物联合转染人宫颈癌HeLa细胞12 h，以过度表达野生型（WT）IKKβ、CA-IKKβ，WT NEMO或MN-NEMO，然后用免疫荧光显微镜评估p62的表达。如有指示，在实验的最后6小时内添加了IKK抑制剂BAY11-7082。在(一)，显示了具有代表性的免疫荧光显微照片。带有GFP–LC3斑点的细胞百分比真空单元格）中报告(B类)（平均值±标准误差。，n个=3,*P（P）<0.05). (C类)免疫印迹法测定LC3成熟和p62耗竭。用pcDNA3.1载体或IKKβ、CA-IKKβ-、NEMO-或MN-NEMO-编码质粒转染HeLa细胞12小时（转染效率为～70%），然后按照材料和方法一节中的描述进行免疫印迹处理。(D类,E类)透射电镜检测自噬空泡。HeLa细胞被转染为(C类)然后进行透射电镜处理。代表性图像如所示(D类)以及每个细胞的自噬体（白柱）和自噬溶酶体（黑柱）的数量（平均值±标准差）。，n个=30–40个单元格，*P（P）<0.05）如图所示(E类). (F类)CA-IKKβ或MN-NEMO诱导的GFP–LC3聚集对自噬相关蛋白的需求。用对照siRNA（Co）或靶向指示自噬相关蛋白的siRNA转染HeLa细胞24小时，然后用GFP–LC3内切质粒加上指示的IKK相关构建物再转染12小时，然后用免疫荧光显微镜定量显示GFP–LC3聚集的细胞百分比真空平均值±标准误差。，n个=3,*P（P）<0.05).

接下来，我们研究了与IκB“超阻遏物”（IκSR）共转染是否会影响CA-IKKβ或MN-NEMO诱导的自噬(迪多纳托等, 1995)，一种非磷酸化IκB变体（由于双突变S32A/S36A），有效抑制IKK诱导的p65/RelA核移位(图3A和B). IκSR不能抑制CA-IKKβ或MN-NEMO诱导的自噬(图3A、C、D和F). 因此，第65页−/−NIH-3T3成纤维细胞激活自噬，与野生型（WT）成纤维细胞对多种自噬诱导物（包括饥饿）的反应相似(图3E)，化学刺激(补充图S7)、CA-IKKβ和MN-NEMO(图3F). 此外，在NIH-3T3细胞中，IκSR未能阻止CA-IKKβ或MN-NEMO诱导的自噬(图3F). 总之，这些结果表明IKK可以通过一种不涉及NF-κB的机制促进自噬。

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IKK诱导的自噬作用可以与NF-κB活化解偶联。(一–C类)免疫荧光显微镜检测IκSR对IKK诱导NF-κB活化和自噬的影响。用表达GFP–LC3的构建物和pcDNA3.1载体或野生型（WT）IKKβ-、CA-IKKβ/、WT NEMO或MN-NEMO编码质粒同时转染细胞，或与编码IκSR的质粒联合转染，然后用免疫荧光染色检测p65。典型的显微照片如所示(一)而转染细胞显示细胞核p65易位的百分比（%p65核子细胞）或细胞质GFP–LC3聚集（%GFP-LC3真空单元格）如所示(B类,C类)分别为（平均值±标准误差。，n个=3,*P（P）<0.05). (D类)免疫印迹法评估IκB“超阻遏物”（IκSR）对IKK诱导NF-κB活化和自噬的影响。用pcDNA3.1载体或WT IKKβ-、CA-IKKβ/、WT NEMO或MN-NEMO编码质粒单独或与IκSR表达构建物联合转染HeLa细胞18 h，然后进行免疫印迹测定的分析和处理。在全细胞提取物中评估LC3的成熟度。或者，对裂解产物进行亚细胞分离，以评估细胞质与细胞核中p65/RelA的存在，分别使用GAPDH和TFIIA-α控制细胞质和核组分的相等负载。(E类,F类)p65/RelA基因敲除不能影响自噬。WT和第65页−/−将小鼠NIH-3T3成纤维细胞暴露于饥饿条件下指定的时间，然后进行LC3成熟的免疫印迹评估(E类). 或者，用GFP–LC3编码结构与pcDNA3.1载体或指示的IKK相关质粒共同转染细胞18小时，然后用免疫荧光显微镜定量GFP–LC 3真空细胞（平均值±标准偏差。，n个=3,*P（P）<0.05) (F类).

IKK刺激典型自噬

饥饿诱导的自噬与AMP-activated kinase（AMPK）的激活密切相关(梅利等, 2006)mTOR的抑制(水岛和克林斯基，2007年)，细胞质p53的降解(塔斯迪米尔等, 2008)以及Beclin-1与Bcl-2的抑制性相互作用的分离(帕廷格等, 2005;世界环境学会等, 2008). 饥饿诱导自噬以及CA-IKKβ或MN-NEMO表达导致AMPK的过度磷酸化依赖性激活，mTOR底物p70的低磷酸化S6K系列（表明mTOR抑制）、p53蛋白耗竭以及与Bcl-2共同免疫沉淀的Beclin-1数量减少(图4A和C). CA-IKKβ或MN-NEMO的自噬诱导通过敲低AMPK的α亚基而被阻止，雷帕霉素不能进一步增强自噬诱导(图4B)这表明IKK刺激的自噬确实由典型的AMPK/mTOR通路控制。siRNA-介导和药物抑制MDM2（靶向p53降解的泛素转移酶）抑制IKK诱导的自噬，同时阻止p53降解(图4C)支持IKK诱导的自噬需要p53缺失的观点。为了进一步了解IKK诱导自噬的机制，我们对转染CA-IKKβ和MN-NEMO的细胞胞浆提取物磷酸化的丝氨酸/苏氨酸激酶底物进行了无偏见的筛选(图4D). 我们观察到，CA-IKKβ、MN-NEMO和其他自噬诱导物（即饥饿、雷帕霉素和吡氟菊酯-α）导致产生酶活性，该酶活性将丝氨酸/苏氨酸残基上的合成JNK1底物磷酸化(图4D和E). 因此，CA-IKKβ-和MN-NEMO转染细胞表现出JNK1的活化磷酸化(图4F). 此外，siRNA-介导和药物抑制JNK1均抑制CA-IKKβ或MN-NEMO诱导的自噬(图4G和H). 敲除专用JNK1激活剂MKK4和MKK7(劳勒等, 1998)还废除了CA-IKKβ或MN-NEMO诱导的自噬作用，而c-Jun的敲除没有影响(图4H和补充图S8). 总之，这些结果表明IKK减轻了通常由p53和mTOR确保的自噬抑制，从而通过AMPK和JNK1促进自噬。

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AMPK、mTOR、p53和JNK1在IKK激活诱导自噬中的意义。(一)激活AMPK、抑制mTOR和分离Beclin-1–Bcl-2复合物以响应IKK激活。将HeLa细胞置于饥饿条件下1 h，或转染pcDNA3.1载体或野生型（WT）IKKβ-、CA-IKKβ/、WT NEMO-或MN-NEMO-编码质粒18 h，然后对指示蛋白进行免疫印迹检测。或者，用Beclin-1特异性抗体对裂解产物进行免疫沉淀，然后进行Beclin-2或Bcl-2的免疫印迹检测。(B类)AMPK和mTOR参与IKK诱导的自噬。在用GFP–LC3编码结构和所示质粒转染HeLa细胞12小时之前，用对照siRNA（Co）或AMPKα特异性siRNA转染HeLa细胞48小时。或者，在单独质粒转染后12小时，用雷帕霉素或等量的二甲基亚砜（溶剂对照）处理细胞6小时。列描述了表现GFP–LC3聚集（%GFP–LC3）的细胞百分比真空平均值±标准误差。，n个=3,*P（P）<0.05). (C类)p53降解参与IKK诱导的自噬。用对照（Co）或MDM2特异性siRNA转染MEF 24小时，然后用编码GFP–LC3构建物的质粒再加上所示构建物转染6小时。另一种方法是，在质粒转染后6小时，单独用Nutlin-3或RITA处理细胞12小时。最后，对细胞进行免疫荧光显微镜检查，以量化GFP–LC3聚集。列报告GFP–LC3的百分比真空细胞（平均值±标准偏差。，n个=3,*P（P）<0.05). (D类,E类)检测自噬刺激触发的丝氨酸/苏氨酸激酶底物磷酸化的基因体分析。CelluSpot丝氨酸/苏氨酸激酶底物微阵列与转染pcDNA3.1载体或CA-IKKβ或MN-NEMO编码质粒的细胞提取物孵育18 h。另一种选择是，从饥饿条件下的细胞或用雷帕霉素或匹菲林-α处理2 h的细胞中获得提取物。通过荧光标记的抗磷丝氨酸/苏氨酸抗体显示磷酸化。中的虚线(D类)强调了人工合成JNK1底物的位置，该底物被细胞自噬提取物磷酸化。面板(E类)描述了该信号的折叠感应（平均值±s.e.m。，n个=2,*P（P）<0.05). (F类)β和MN-NEMO诱导JNK1磷酸化。转染或处理的HeLa细胞提取物(一)对磷酸化（P-）和总JNK1进行免疫印迹检测。监测GAPDH水平，以确保负载均衡。(G公司,H（H）)JNK1缺失/抑制对IKK诱导的自噬的影响。用对照（Co）或JNK1特异性siRNA转染细胞24小时，然后用指示的构建物转染细胞12小时，并用免疫印迹法评估LC3的成熟和p62的耗竭(G公司). 细胞未经处理或用指定的siRNA转染24小时，然后用编码GFP–LC3的构建体加上指定的质粒进一步转染12小时。或者，用指定的JNK1抑制剂（或等体积的DMSO）预处理细胞30分钟然后与GFP–LC3编码结构和指定质粒共同转染12小时(H（H）). 列描述了GFP–LC3的百分比真空细胞（平均值±标准偏差。，n个=3,*P（P）<0.05).

内源性IKK对自噬的作用

上述实验表明，诱导自噬需要IKK，但IKK的结构性激活是足够的。在MEF中，编码IKKα、IKKβ、IKKγ/NEMO或其上游激活物TAK1的基因的敲除(Hacker和Karin，2006年;埃雷罗·马丁等, 2009)通过营养物质消耗或雷帕霉素、吡氟菊酯-α、锂和衣霉素治疗减少（但没有消除）自噬诱导(图5A). 当特定siRNAs下调相同蛋白时，在HeLa细胞中获得了类似的结果(图5B). 在这些条件下，p65/RelA的敲除或敲除并不影响自噬反应(图5A和B). 在MEF中，缺乏IKK亚单位或自噬相关蛋白并没有导致饥饿、雷帕霉素、匹非他林-α、锂和衣霉素激活自噬24小时后的细胞死亡(补充图S9A). 然而，IKK复合体和自噬机制的基因操作（单独或联合）使MEF对葡萄糖缺乏和缺氧引起的长时间（48小时）代谢应激的致死效应敏感(图5C和D). 这些结果表明，IKK复合物亚基至少是诱导最佳自噬所必需的在体外，在细胞系中。

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IKK复合体在诱导自噬中的意义和功能影响在体外. (一,B类)IKK亚单位对培养细胞自噬的贡献。用GFP–LC3编码质粒转染具有所示基因型的MEF 12小时，在所示自噬诱导物存在下培养4小时，最后通过免疫荧光显微镜分析GFP–LC 3点。(B类)或者，用对照siRNA（Co）或靶向所示蛋白质的siRNA转染HeLa细胞24小时，然后用GFP–LC3编码质粒转染，自噬诱导和免疫荧光显微镜检查，如(一). 在(一,B），列描述了细胞质点中表现出GFP–LC3的细胞百分比（%GFP–LC3真空平均值±标准误差。，n个=3,*P（P）<0.05），而插入物说明了通过免疫印迹法评估的敲除或敲除的效果。(C类,D类)在自噬诱导和代谢应激条件下，IKK成分和自噬相关蛋白对细胞活力的影响。(C类)用对照siRNA（Co）或靶向所示自噬相关蛋白的siRNA转染所示基因型的MEF 24小时，然后承受代谢应激（葡萄糖剥夺，0.1%氧气）48小时，并染色以进行细胞荧光测定凋亡相关参数。黑色和白色或灰色列表示单元格的百分比（平均值±标准偏差。，n个=3,*P（P）<0.05），以质膜破裂（PI+)或ΔΨ损失米（DiOC公司6(3)低的/PI公司−)分别是。(D类)以所示遗传缺陷为特征的MEF受到代谢应激，并进行平板试验以确定克隆存活率。柱体描述了平均克隆发生生存率±s.e.m(n个=3,*P（P）<0.05).

评估IKK复合物对自噬的作用体内我们研究了IKKβ基因编码的肝脏特异性条件敲除（由白蛋白启动子控制下表达的Cre重组酶介导）；阿尔坎等, 2005). 腹腔注射雷帕霉素或24小时禁食后，对照组肝细胞（IKKβ+/+：Cre公司阿尔布)免疫组织化学检测，小鼠表现出LC3在胞质点中的聚集(图6A–C). 相反，来自IKKβ的肝脏Δhep（IKKβflox/flox公司：克里阿尔布)小鼠表现出雷帕霉素或饥饿诱导的LC3聚集的强烈减少(图6A–C). TEM监测自噬时也观察到类似的结果（自噬体和自溶体的积累；图6B)免疫印迹（LC3成熟；图6D). 这种自噬抑制作用是特异性的，因为它可以从IKKβ的肝脏中检测到Δhep小鼠，但其他器官（IKKβ表达正常水平；图6C,补充图S10和第11节). 饥饿导致对照小鼠的肝脏和脾脏出现大量自噬诱导，但仅在肝细胞中导致核p65/RelA易位(补充图S12)强调自噬诱导和NF-κB活化之间缺乏严格的相关性体内值得注意的是，IKKβΔhep小鼠在饥饿诱导的p53缺失中表现出肝脏特异性缺陷(图6D)，p70的次磷酸化S6K系列AMPK和JNK1的过度磷酸化(图6E)支持IKK和其他自噬调节器之间的密切联系。在饥饿条件下，我们未能在肝脏特异性自噬缺陷的情况下检测到循环葡萄糖水平的显著下降（数据未显示），类似地，因为其他器官在全身水平上补偿了这一缺陷。

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IKK复合体在诱导自噬中的意义体内. (一–D类)具有所示基因型的小鼠被剥夺食物24小时或腹腔注射雷帕霉素，然后进行尸检。生命(一,C类)和其他器官(C类)对实质细胞细胞质中的LC3点进行免疫组织化学检测。列显示了每毫米LC3点的数量2（平均值±标准误差。，n个=3,*P（P）<0.05) (C类). 或者，用透射电子显微镜分析组织切片以检测自噬体和自溶体(B类)，并对小脑旁细胞进行处理，以检测LC3成熟度、p53和IKKβ(D类). (E类)阻断IKKβ缺陷肝细胞的上游自噬信号。对照组或IKKβ的肝脏和脾脏Δhep将在饥饿条件下饲养或不饲养24小时的小鼠进行处理，以对指示的蛋白质进行免疫印迹评估。结果代表了三个独立的测定结果。

结束语

在本报告中，我们表明IKK有效地触发了自噬，而多重刺激对自噬的最佳诱导需要激活IKK。然而，自噬的诱导与NF-κB的激活无关，抑制NF-κ的B不能阻止IKK诱导的自噬。由于其激酶活性，IKK具有多种NF-κB非依赖性信号传导功能(Hacker和Karin，2006年;德卡尔格等, 2008)自噬明显属于IKK诱导的反应，不需要NF-κB。目前，IKK如何被激活而不导致IκB降解，从而导致NF-κB活化，这是一个尚未解决的难题，我们至少在一些细胞类型（如HeLa细胞、，图1; 和小鼠脾细胞，图5). 作为一种推测可能性，在这种细胞中，自噬诱导物对IKK的激活水平过低，不会导致显著的IκB磷酸化和降解，但足以参与自噬的诱导。

IκB激酶通过一条涉及p53缺失、mTOR抑制、AMPK和JNK1激活以及前自噬蛋白Beclin-1从其与Bcl-2的抑制相互作用中释放的典型途径促进自噬。过去，其中的几个过程相互关联。尽管AMPK可能是TAK1的目标(埃雷罗·马丁等, 2009)，没有迹象表明AMPK将成为IKK的目标。NF-κB活化途径和p53在多种拮抗途径中发挥作用(斯托菲尔等, 2004;黄等, 2007)IKKβ可以磷酸化和破坏p53(特尔甘卡等, 2002;夏等, 2009). 吡氟菊酯-α对p53的药理学抑制（以及对第53页基因）据报道足以激活IKK(川内等, 2008)如图所示，IKK的激活可导致p53缺失，这表明存在一个自我放大的调节电路，该调节电路可能构成一个“开关”，以全能或全无（而非渐进）的方式快速诱导自噬。事实上，生物开关通常包含这样的正向反馈回路(塔普斯科特，2005年). AMPK是mTOR的负调节器(萨尔巴索夫等, 2005). 重要的是，雷帕霉素对mTOR的抑制导致IKK激活，进而刺激AMPK并抑制mTOR，这表明存在另一个自放大电路。最后，JNK1可以磷酸化Bcl-2的柔性环，从而减少其与Beclin-1的相互作用并启动自噬级联反应(世界环境学会等, 2008). 然而，IKK激活有利于JNK1激活的机制尚未阐明，一些研究表明NF-κB（IKK下游）实际上会抑制JNK1激活(爸爸等, 2006;珀金斯，2007年).

自噬是一种有效的肿瘤抑制机制，可能是因为它对维持基因组稳定性的重要贡献(马修等, 2007)，避免过多的ROS生成(马修等, 2009)及其参与细胞衰老(年轻等, 2009)，这构成了阻止肿瘤发生的屏障。因此，诱导/执行自噬所需的多个基因是有效的肿瘤抑制剂，包括PTEN、TSC1、TSC2、LKB1、ATG4、Beclin-1、UVRAG和Bcl-2家族的仅BH3蛋白(迈乌里等, 2009). 在这里，我们揭示了IKK复合体的三个组成部分对自噬过程的重要性。有趣的是，这些IKK亚单位中的每一个都被证明在特定情况下起到肿瘤抑制作用。NEMO的肝脏特异性敲除导致肝癌发生，而肝癌发生之前是一种肝细胞脂肪变性(吕德等, 2007)这让人想起在贝克林-1+/−肝脏(曲等, 2003;马修等, 2009). 肝脏特异性IKKβ基因敲除增强诱变诱导的肝癌发生，这一过程与炎症反应有关(樱井等, 2006). 最后，IKKα的角蛋白细胞特异性敲除促进小鼠鳞状肿瘤的诱导(公园等, 2007)在人类皮肤癌中经常发现IKKα失活突变(线路接口单元等, 2006). IKK亚单位的抑瘤功能是否可以通过其对自噬的贡献来解释，这仍然是一个值得进一步研究的有趣的可能性。

材料和方法

细胞系和培养条件

除非另有说明，否则细胞培养用培养基和补充剂购自Gibco-Invitrogen（Carlsbad，USA）。所有细胞系在37°C和5%CO下培养2，在含有10%胎牛血清（FCS）和10 mM HEPES缓冲液的培养基中。此外，细胞类型特异性培养条件包括：Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）+1 mM丙酮酸钠用于宫颈癌HeLa和骨肉瘤U2OS细胞；DMEM/F12培养基+100 U/ml青霉素G钠和100μG/ml硫酸链霉素用于NSCLC A549细胞；DMEM+1%非必需氨基酸（Sigma-Aldrich，St.Louis，USA）用于WT，地图3k7−/−（大阪大学S Akira赠送的礼物），笨蛋−/−,ikbkb公司−/−,ikbkg（千克）−/−和关系−/−MEF；WT和关系−/−NIH-3T3小鼠成纤维细胞。对于血清和氨基酸饥饿，细胞在无血清厄尔平衡盐溶液（EBSS）培养基（Sigma-Aldrich；冈萨雷斯-波洛等, 2005). 在接近缺氧的条件下（37°C，0.1%氧气，5%CO），通过在EBSS培养基中培养细胞48小时来施加代谢应激2).

治疗和转染

细胞接种在6孔、12孔或24孔板中，并在实验前附着12–24小时。用以下药物激发细胞0.5–12小时：1 nM巴非霉素A1（Sigma-Aldrich）；1μM BAY11-7082（美国普利茅斯会议，BioMol研究实验室，BioMol）；1μM JNK抑制剂I（Calbiochem，美国圣地亚哥）；10 mM氯化锂（Sigma-Aldrich）；10μM nutlin-3（Alexis生化公司，美国圣地亚哥）；30μM吡氟菊酯-α（钙生物化学）；1μM雷帕霉素（Tocris Bioscience，Ellisville，USA）；10μM RITA（亚历克西斯生物化学公司）；10μM SP600125（钙生物化学）；1 ng/ml TNF-α（来自Sigma-Aldrich）；和2.5μM衣霉素（钙生物化学）。siRNA转染是使用寡聚体胺进行的®（Invitrogen），根据制造商的说明。靶向以下蛋白质的定制设计的siRNA双链体购自Sigma Proligo：AMPKα（sense 5′-UGCUCACCAUCUAUAUAdTdT-3′）；Beclin-1（感觉5′-dTdT-3′；冈萨雷斯-波洛等, 2005)，IKKα（意义5′-CAAGAGAGCUACAAUACUdTdT-3′）；IKKβ（5′-GGAAGUACCUGAACCAGUUAAdTdT-3′）；MDM2（感测5′-AAGGAUAAGCCCCCAdTdT-3′）；NEMO（感测5′-AACAGAGGGGGUGAUCGAUAAdTdT-3′）；p65/RelA（感觉5′-GGAUGAGGAGAAACGUAA-3′）；JNK1-1（5′-GGAAAGAAUUGAAUAUAAdTdT-3′义）；c-Jun（感觉5′-GAACGAGAGAGAGdTdT-3′）；MKK4（感测5′-GGACGAGCUUAUGUUUUdTdT-3′）；和MKK7（5′-AGAUGAGAGGGGGCGAUUGUGUdTdT-3′）。JNK1-2 siRNA购自圣克鲁斯生物技术公司（美国圣克鲁斯）。采用一个不相关的siRNA双链（5′-GCCGUAUGCGGUUAAGUdTdT-3′）作为阴性对照。使用Lipofectamine 2000进行质粒转染®（Invitrogen），按照制造商的建议。编码GFP–LC3融合蛋白的质粒(卡贝亚等, 2000)与空载体pcDNA3.1（Invitrogen）或过度表达WT-IKKβ、WT-NEMO、显性活性IKKβ（CA-IKK；水银等, 1997)或构成激活IKK复合体的NEMO变体（MN-NEMO；威尔等, 2003). 除非另有规定，细胞在转染24小时后使用。

自动化高含量显微镜

共10×10三治疗前24小时，将稳定共表达绿色荧光蛋白（GFP）-LC3嵌合体和组蛋白2B融合到红色荧光蛋白（H2B-RFP）的U2OS细胞接种在96周成像板（BD Falcon，Sparks，USA）中。用饥饿培养基清洗细胞，然后用化学和细胞生物学研究所（ICCB，哈佛，美国）已知生物活性库（浓度范围：1–12μM）的试剂处理细胞，再悬浮在饥饿培养基中。在处理后12小时，用4%多聚甲醛（Sigma）固定细胞。使用BD pathway 855自动显微镜（BD Imaging Systems，San José，USA）采集图像，该显微镜配备了一个自动化Twister II平板处理器（Caliper Life Sciences，Hopkinton，USAH2B–RFP标记的细胞核和细胞质中的GFP–LC3点。对每种化合物处理的大约250个细胞的双倍图像进行分析，以获得细胞数和平均胞浆荧光斑点数。减去自噬的背景水平（在完全培养基中），并将药物抑制剂的作用计算为自噬抑制百分比。

细胞荧光测定法

以下荧光色素用于测定凋亡相关修饰：3,3′-二己基氧羰菁碘化物（DiOC6（3） ，40纳米；线粒体跨膜电位（ΔΨ米)和碘化丙啶（PI，1μg/ml；分子探针-氮素）测定细胞活力(冈萨雷斯-波洛等, 2005). 胰蛋白酶化后，活细胞在37°C下染色30分钟，然后使用FACS Vantage进行细胞荧光分析（美国圣何塞Becton Dickinson）。

免疫印迹和免疫沉淀

为了进行免疫印迹评估，用冷PBS在4°C下清洗细胞，并如前所述进行裂解(克里奥洛等, 2007). 在4–12%SDS–PAGE预铸凝胶（Invitrogen）上根据分子量分离50μg蛋白质，并将其电转移到Immobilon膜（Millipore，Bedford，USA）。通过在添加了5%w/v非脂奶粉的0.05%吐温20（TBS中）中培养膜1小时来阻断非特异性结合位点。使用了针对以下磷酸化（P-）或总蛋白的一级抗体：P-AMPK（细胞信号技术，美国贝弗利）；AMPKα（细胞信号技术）；Beclin-1（圣克鲁斯生物技术）；Bcl-2（圣克鲁斯生物技术）；c-Jun（细胞信号技术）；细胞信号技术；P-IKKα/β（细胞信号技术）；IKKα/β（细胞信号技术）；P-NEMO（钙生物化学）；NEMO（圣克鲁斯生物技术）；LC3（细胞信号技术）；P-mTOR（细胞信号技术）；MKK4（细胞信令技术）、MKK7（细胞信号技术）；mTOR（圣克鲁斯生物技术）；p53（圣克鲁斯生物技术）；p62（圣克鲁斯生物技术）；P-p70S6K（细胞信号技术）；p70S6K（细胞信号技术）；或TFIIAα（圣克鲁斯生物技术）。在4°C下过夜孵育时，用适当的辣根过氧化物酶标记的二级抗体（Southern Biotechnologies Associates；Birmingham；UK）和SuperSignal West Pico化学发光底物（Thermo Fisher Scientific，Rockford，USA）检测一级抗体。使用特异性识别β-肌动蛋白（密理博）或GAPDH（密理博尔）的一级抗体来确保车道荷载相等。免疫沉淀7×106如前所述对细胞进行裂解(克里奥洛等, 2007)用30μl纯蛋白组蛋白g磁珠（Millipore）预先清除300μg蛋白质1小时，然后在存在抗Bcl-2抗体（Santa Cruz Biotechnology）或IgG对照物的情况下培养2小时。随后使用TrueBlot-HRP（eBioscience，San Diego，USA）二级抗体进行免疫印迹。

电泳迁移率变化分析（EMSA）

使用HIV-LTR串联κB寡核苷酸作为NF-κB探针，制备并分析核提取物的DNA结合活性(雅克等, 2005). 对于超位移测定，将核提取物与p50/NFκB1（细胞信号技术）特异性抗体预孵育；p52（细胞信号技术）；p65/RelA（BD生物科学）；添加标记探针之前，在冰上放置RelB（细胞信号技术）或cRel（圣克鲁斯生物技术）30分钟。

IKK复合激酶分析

用抗NEMO抗体免疫沉淀法（BD Bioscience）从细胞裂解物中分离出IκB激酶复合物，如前所述，用2μg半合成的IκBα衍生的IKK底物GST-IκB-α（1-54）测定相关激酶活性(胡等, 1999). 免疫印迹法测定IKKβ的含量。

基因体分析

收集细胞，在冷PBS中清洗，在200μl裂解缓冲液中重新悬浮，轻轻均质，并在冰浴中保存10分钟。然后，在10 000 r.p.m.（4°C，20分钟）离心裂解液以去除碎片，并通过DC蛋白质分析测定上清液中的蛋白质浓度（BioRad Laboratories，Hercules，USA）然后，在Intavis CelluSpot顶部的室温（RT）下，共培养200μg蛋白质30分钟®丝氨酸/苏氨酸激酶底物微阵列，在补充有1%牛血清白蛋白（BSA）的激酶缓冲液（细胞信号技术）中。清洗时，将微阵列与两种生物素结合抗体的混合物培养45分钟，这两种抗体特异识别丝氨酸和苏氨酸磷（Sigma-Adrich）。最后，阵列与AlexaFluor孵育®647–在使用GenePix进行荧光测量之前，将链霉亲和素结合物（分子探针-氮素）保持45分钟®4000B微阵列扫描仪（Molecular Devices，Sunnyvale，USA）。

动物和组织加工

所有动物都是根据FELASA和动物实验伦理委员会指南（法国瓦尔德马恩）饲养和饲养的。C57BL/6小鼠是从法国查尔斯河实验室获得的，ALB Cre IKK F/F小鼠（UCSD案卷编号SD2004-120；加利福尼亚州奥克兰）是由Urszula Hibner和Michael Karin提供的。小鼠被安置在具有12小时光/暗循环的温度控制环境中，并接受食物和水随意在饥饿研究中，老鼠被剥夺食物24小时，但可以自由饮用水。另一种方法是，在小鼠死亡前24小时腹腔注射5 mg/kg雷帕霉素。根据FELASA指南对小鼠进行麻醉和处死。收集肝脏、胰腺、心脏、脾脏和肾脏，用4%多聚甲醛固定至少4小时，然后在4°C下用30%蔗糖在PBS中隔夜处理。组织活检最终嵌入Tissue-Tek OCT复合物（Sakura Finetek Europe B.V.，Zoeterwoude，The Netherlands）中，并保存在−20°C。

组织切片的共焦显微镜

为了检查LC3的分布，用PBS冲洗10μm厚的冰冻切片，用0.3%Triton-X100渗透10分钟，用5%BSA饱和30分钟，并用初级抗APG8b抗体孵育过夜（美国圣地亚哥Abgent）。然后用PBS冲洗切片，用AlexaFluor在RT下培养1小时®488-结合二级抗体（分子探针-Inversion），用4%多聚甲醛（PBS中的w/v）固定两次10分钟，用10μg/ml Hoechst 33342染色15分钟，用相同的固定剂再次固定，最后装裱。免疫荧光图像由TCS SPE共焦显微镜（Leica Microsystems，Weitzler，USA）拍摄，并使用Leica Suite Advanced Fluorescence软件进行分析。

光学和免疫荧光显微镜

根据既定方案对细胞进行免疫荧光染色(克里奥洛等, 2007). 然后用识别Lamp2（圣克鲁斯生物技术）、p62（圣克鲁兹生物技术）或p65（圣克鲁茨生物技术）的一级抗体对固定细胞和渗透细胞进行染色，这些抗体通过适当的AlexaFluor®共轭物（分子探针）。细胞核用10μg/ml Hoechst 33342（分子探针-氮素）进行复染。分别使用配备DC300F相机和LSM 510显微镜（德国耶拿卡尔蔡司）的IRE2显微镜（徕卡微系统）进行荧光和共焦荧光显微镜评估。为了确定共同定位的百分比，使用了Image J软件。

电子显微镜

细胞在4°C的温度下，在1.6%戊二醛和0.1 M Sörensen磷酸盐缓冲液（pH 7.3）中固定1 h，清洗，再次在2%四氧化锇水溶液中固定，在30%甲醇中的2%乙酸铀酰中染色，最后嵌入Epon中。用Tecnai G2 Spirit电子显微镜（FEI，荷兰埃因霍温）在80kV下，在用柠檬酸铅和乙酸铀酰染色的超薄切片（80nm）上进行电子显微镜检查。

统计程序

除非另有说明，否则实验一式三份，并至少重复两次。图中显示了一个代表性实验的结果（平均值±标准偏差。，n个=3个平行样本）。使用Microsoft Excel（Microsoft，Redmond，USA）分析数据，并使用双尾Student’st吨-测试(*P（P）<0.05).

补充材料

补充图1

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补充图2

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补充图3

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补充图4

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补充图5

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补充图6

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补充图7

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补充图8

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补充图9

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补充图10

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补充图11

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补充图12

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补充图形图例

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审查过程文件

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致谢

我们感谢迈克尔·卡林（美国圣地亚哥加州大学），因为他送了我们淘汰老鼠的礼物。我们感谢Sandra Güemes（西班牙巴利亚多利德IBGM生物与遗传分子研究所）对技术支持的贡献。第65页−/−MEF由Thomas Meyer（柏林马克斯普朗克研究所）提供。GK得到了国家癌症防治协会（Equipe labellisée）、国家癌症防治机构、国家癌症研究所、欧洲委员会（Active p53、Apo-Sys、RIGHT、TransDeath、ChemoRes、ApopTrain）和医学基金会（FRM）的支持。我们感谢国际合作计划ECOS-CONICYT，向GK和SL授予C08S01。EM由欧盟ApopTrain Marie Curie培训网络提供支持。VB得到了国家癌症研究机构、癌症研究协会、比利时大学间吸引力极点、法国癌症研究所、国家癌症研究所和巴黎笛卡尔大学的支持。OK由EMBO支持，LG由Apo-Sys支持。

脚注

提交人声明他们没有利益冲突。

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