KcsA细胞质结构域的重排是其门控作用的基础^*

摘要

介绍

离子通道是通过控制膜离子渗透性来调节细胞功能的膜蛋白(1). 许多离子通道受细胞质域的刺激调节。例如，当钙与细胞内结合位点结合时，大电导钙激活钾通道BK被激活(2). 其他通道，如超极化激活的环核苷酸门控阳离子通道和环核苷酸门限通道，通过环核苷酸与其细胞质结合域的直接结合而激活(三). 这些结合引起细胞质结构域中的重排，并使通道稳定在开放状态。对于向内整流器K⁺-通道KirBac1.1，门控被认为是由细胞质结构域和膜之间的相互作用控制的(4). 因此，这些通道的细胞质域在调节其功能方面很重要。此外，在每种情况下，都认为细胞质结构域中的变化通过连接子传递到通道核心区，通道核心区包括通道孔并导致门打开。

KcsA公司²是来自青链霉菌它由跨膜孔、N端的α-螺旋和每个亚单位C端由35个氨基酸组成的细胞质结构域组成。它是一种具有四个同源亚单位的四聚体，每个亚单位都有两个跨膜片段TM1和TM2(5,6). KcsA的封闭结构已经解决(7)而开放式结构没有。总的来说，尽管离子传导的分子机制已经被揭示(8)，选通的情况尚不清楚。KcsA通道门控机制特别重要，因为该通道是一个相对简单的钾通道，因此其机制可能被用作更复杂通道的模型。江等。(9)提出了一种将KcsA的封闭结构与MthK的开放结构相结合的模型，MthK是另一个已知开放结构的钾通道。根据他们的模型，这是目前关于KcsA浇口最为接受的模型，由四个TM2段组成的束交叉形成浇口。

KcsA被称为pH-门控通道，因为在膜细胞内的酸性pH值下，其开放概率高于中性pH值。酸性pH值通过破坏闭合状态的稳定性间接增加了开放概率(10). 因为细胞内pH值青链球菌在打开过程中保持接近中性，打开KcsA通道的生理刺激未知(11). 为了理解整个门控机制，我们需要了解与门控和生理刺激相关的结构变化。核磁共振波谱已报道(12)和表面等离子体共振研究(13)通道中有几个部分在通道选通期间发生了显著的重新排列。这些研究表明，至少有两种不同的构象响应pH值的变化，并且在特定区域周围发生了大规模重排，包括选择性过滤器（Glu-71-Asn-80）、TM2的C末端（Ala-98-Gly-116）和细胞质结构域。

在本研究中，我们通过检测荧光强度的变化来测量KcsA通道中的构象变化，以确定与细胞质域门控相关的氨基酸残基的位置变化。因此，当通道在pH 4下被激活时，从TM2的C末端到细胞质结构域相邻部分的通道部分被发现处于疏水环境中，而在pH 7下，当通道关闭时，它处于亲水环境中。我们还测量了在双甲酰胺（DPA）存在下，细胞质结构域荧光团之间的荧光共振能量转移，双甲酰胺是一种膜定位猝灭剂(14)在酸性pH下降低荧光强度。这些结果表明，当闸门打开时，从TM2的C末端到细胞质结构域相邻部分的区域主要向膜移动。

实验程序

结果

删除细胞质结构域对活性的影响

为了研究细胞质结构域对KcsA通道门控的影响，我们制作了三个胞质结构域缺失突变体，即KcsAΔ125–160、KcsA△135–160和KcsAδ145–160，并研究了它们的特性。每个通道都有一个E71A突变，这使得通道没有激活。由于门控失活，野生型KcsA通道即使在酸性pH下也具有极低的开放概率(15). 然而，众所周知，去除残基Glu-71中的电荷会缩短失活时间并增加开启概率(15,18).

为了测量细胞质结构域缺失突变体的活性，将突变体重组成脂质体，插入平面双层，并测量其单通道电流。在200 m的对称溶液中进行单通道记录米pH 4.0的KCl，这是一种促进野生型通道开放的条件。图1一显示了60 mV下细胞质域缺失突变体的典型单通道记录。图1B类是突变体的单通道I-V关系。显示了六个测量值中的最低电导。总结如下表1KcsAΔ125–160在100 mV时的弦电导远小于全长KcsA（E71A），而KcsA△145–160的弦电导大。KcsAΔ135–160的电导率在43至90 pS之间。此外，KcsA△125–160的开路概率较低。这些通道特性的变化表明细胞质结构域在调节功能中起着重要作用。

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图1。

细胞质域缺失KcsA突变体的当前测量。在含有200 m的对称溶液中，记录了重组为人工平面脂质双层的突变通道的单通道电流米KCl和10m米Tris-MES，pH 4.0。一，显示了60 mV时KcsA E71A（控制）、KcsAΔ125–160、KcsAΔ135–160和KcsA△145–160的代表性电流记录。B类显示了细胞质域缺失突变体的I-V关系。●, KcsA E71A；■, KcsAΔ125–160；▴, KcsAΔ135–160；♦, KcsAΔ145-160。

表1

胞质域缺失KcsA突变体的通道特性

在含有200 m的对称溶液中，在100 mV下测量全长KcsA（E71A）和细胞质域缺失KcsA突变体的弦电导和开放概率米KCl和10 m米Tris-MES，pH 4.0（平均值±S.D。，n个= 3–9).

	弦电导	开放概率
	pS公司
E71A（对照）	92 ± 8	0.91 ± 0.06
KcsAΔ125–160	50 ± 11	0.68 ± 0.13
KcsAΔ135–160	43–90	0.84 ± 0.10
KcsAΔ145-160	144 ± 18	0.97 ± 0.04

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位点特异性突变和荧光标记

为了研究调控门控的机制，研究了细胞质域中残基的重排。因此，用TMR-马来酰亚胺对某些氨基酸残基进行荧光标记，并测量伴随这些pH值变化的荧光强度变化。制备了单半胱氨酸突变体，其中一个氨基酸残基取代半胱氨酸，以实现TMR-马来酰亚胺的特异性标记。每个通道都有一个E71A突变，这使得通道没有激活。所有单一半胱氨酸突变体在大肠杆菌并通过His亲和柱纯化。13个单半胱氨酸突变体中有9个用TMR-马来酰亚胺标记。6个突变体标记在细胞质域（G123C、V126C、A132C、A136C、A143C和N158C），2个标记在跨膜和细胞质域之间的界面（G116C和Q119C），1个标记在2个跨膜域之间的细胞外环（G53C）(图2一).图2B类显示了野生型的荧光照相(车道1)，E71A(车道2)，G53C(车道3)，A132C(车道4)然后用TMR-马来酰亚胺标记每一个，并将其重组为脂质体。我们证实，单半胱氨酸突变体G53C和A132C被特异标记。

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图2。

推导了TMR-马来酰亚胺的KscA结构和附着位点。 一，测试的突变显示在根据EPR测量推导出的结构上（蛋白质数据库代码1F6G型). 图中显示了四个亚基中的两个。半胱氨酸引入的位置用黄色圆圈。虚线显示膜/溶液界面。B类用TMR-马来酰亚胺标记纯化的突变体，并将其重组为脂质体。蛋白质在SDS-PAGE后通过荧光成像（分子成像仪，Bio-Rad）进行分析。这个箭头表示KcsA单体。车道1，野生型；车道2，E71A；车道3，G53C；车道4，A132C。

标记突变体重组为脂质体及通道活性测定

为了测量荧光标记通道的活性，测量了它们的单通道电流。图3一显示了标记有TMR的通道突变体的典型单通道记录，而图3B类显示了各种突变体的单通道I-V关系。因此，所有突变体都具有pH依赖性通道活性。100 mV时弦电导在70和121 pS之间，而野生型和单个E71A突变体的值分别为84和92 pS。100 mV的开放概率在0.89和0.99之间，接近E71A突变株（0.93）。这些结果表明，标记对所有TMR标记突变体的通道活性没有显著影响。

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图3。

TMR标记的KcsA突变体的电流测量。在含有200 m的对称溶液中，记录了重组为人工平面脂质双层的突变通道的单通道电流米KCl和10 m米Tris-MES，pH 4.0。一，显示了突变通道（G53C和A132C）的代表性电流记录。B类显示了TMR标记的KcsA突变体的I-V关系。

开放概率与荧光的相关性

为了比较荧光和开放通道概率，我们绘制了荧光的pH依赖性以及从通道电流记录中获得的开放概率。如所示图4，A132C的荧光随着pH值的降低而增加，并且与通道的开放概率密切相关。此外，pK（K）_一荧光变化（pK（K）_一=4.8）对应于pK（K）_一KcsA质子传感器（pK（K）_一= 5.4). 这强烈表明，高强度的荧光团对应于开放状态下的通道，而低强度的荧光体对应于闭合状态。我们知道TMR在疏水环境中的荧光强度高于亲水环境(19). 因此，A132C荧光的变化表明TMR分子在亲水和疏水环境之间移动。相反，G53C的荧光没有显著变化，表明即使该位点在选通过程中移动，它仍保持在相同的环境中。

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图4。

荧光和通道开放概率之间的相关性。突变体G53C和A132C中pH-依赖性荧光变化的代表性示例沿着其通道电流记录获得的开放概率绘制。pK（K）_一A132C的荧光变化为4.8。pK（K）_一A132C的开放概率为5.4。

pH 4和7下的荧光测量

对于所有测试的突变体，在酸性溶液中的开放概率为~1.0，但在中性溶液中为0。我们在pH4和pH7下测量了与取代半胱氨酸连接的TMR的荧光。图5,一和B类，显示A132C和G53C发射光谱的代表性结果。A132C在pH4时的荧光比pH7时高，在570nm时几乎是pH7的5倍(图5一). 这一结果表明，与闸门关闭时相比，闸门打开时Cys-132处于更疏水的环境中。另一方面，在pH值4和7之间，我们没有发现G53C有任何显著差异(图5B类). 如中所示图5C类，即使在pH值为4时，G53C的荧光强度也远低于A132C，表明G53C一直处于亲水环境中。

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图5。

TMR-A132C和TMR-G53C的发射光谱。我们测量了TMR标记的KcsA突变体A132C的荧光强度(一)和G53C(B类)将其重组为脂质体后。激发波长为532 nm。数据在570 nm和pH 4下标准化。C类，A132C和G53C的光谱重叠。

对于其他七个TMR标记的突变体，荧光强度结果总结如下图6对这些数据进行蛋白质浓度标准化。位于细胞质域（Q119C、G123C、V126C、A132C和A136C）中的TMR的荧光强度随着pH值的变化而急剧变化，这表明当栅极打开时，这些残留物处于疏水环境，但当栅极关闭时，这些残余物切换到亲水环境。相反，面对细胞外空间的G53C、位于膜和细胞质空间之间界面的G116C以及位于细胞质结构域的A143C和N158C在pH 7下的TMR荧光与在pH 4下测量的TMR荧光没有显著差异。因此，与上述五种残留物相比，这些残留物对门控和pH值变化的环境变化较小。

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图6。

TMR-标记的KcsA突变体在pH 4和7下的荧光强度。在pH4和7条件下，在570nm处测量了9个不同突变体的荧光强度。直方图显示了蛋白质浓度的归一化结果（平均值±S.D。，n个= 3–6). *,第页与pH值为4时测得的每个突变株的值相比，<0.05。

门打开时细胞质结构域处于疏水环境中

我们发现TM2的C末端和细胞质结构域的相邻部分（上述五个残基位于其中）在处于开放状态时处于疏水环境。这一结果表明，这些区域要么被四个细胞质域包裹，要么在开放状态下位于膜的疏水环境中。为了确定这一点，我们在膜局部猝灭剂DPA存在的情况下测量了TMR荧光。图7一显示了在存在和不存在DPA的情况下，A132C在pH为4时的发射光谱的代表性结果。无DPA时A132C的荧光比有DPA时高。其他TMR标记突变体的荧光强度结果总结如下图7B类对这些数据进行蛋白质浓度标准化。在pH值为7时，甚至在C末端（N158C）也观察到了猝灭效应，这是结晶学中已知的距离膜最远的位置(7). 在pH为4的条件下，DPA的存在对五个突变体（TMR-Q119C、G123C、V126C、A132C和A136C）检测到了更大的猝灭效应，每个突变体在pH 4下没有DPA的情况下强度都很高。荧光强度不仅被DPA猝灭，而且被疏水环境增强。因此，很可能低估了淬火效应。这表明这些残留物在pH为4时移动到膜中或膜附近。

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图7。

在pH 4和pH 7条件下，膜定位猝灭剂DPA对TMR-标记的KcsA突变体的影响。 一，所示为A132C在存在和不存在DPA的情况下的发射光谱。在没有DPA的情况下，将数据归一化为570 nm。B类图中显示了在pH 4和pH 7条件下，DPA存在和不存在时的荧光强度。这个直方图显示了蛋白质浓度的标准化结果（平均值±S.D。，n个= 3–6). *,第页与pH为7时DPA的猝灭率相比，<0.05。

讨论

尽管打开KcsA通道的生理刺激尚不清楚，但很可能与细胞内因素有关。据报道，细胞内低pH值会破坏封闭结构的稳定性，从而增加开放概率(10)这表明，即使在某些情况下，细胞内的pH值严格保持在中性pH值，pH值变化也会调节门控青链球菌.

为了从物理上理解KcsA的门控机制，需要关于全长KcsA，尤其是在细胞质C末端结构域，在开放和闭合状态下的结构信息，因为细胞质结构域很可能调节门控，并且可能在其他几个通道中也这样做。例如，在MthK通道的情况下，涉及Ca的细胞质结构域的构象变化²⁺钙诱导的结合位点²⁺结合被认为是通过内部螺旋延伸对孔隙施加力(20). 此外，将环核苷酸门控通道的细胞质环核苷酸结合域替换为KcsA的细胞质域导致对cAMP的反应。

我们的电生理学结果表明细胞质结构域调节门控。细胞质域缺失突变体KcsA的pH依赖性与野生型KcsA没有差异。然而，电导和开放概率等信道特性随着较大的删除区域而改变，显示出较低的电导(图1). 此外，KcsAΔ125–160的开放概率较低。从这些变化中，我们得出结论，细胞质域不起pH传感器的作用，但在闸门调节中起着重要作用。

由于荧光团TMR在疏水环境中的荧光强度高于亲水环境，因此我们用TMR标记KcsA并观察其构象重排，这使我们能够识别TMR标记残基所在的环境。KcsA位点主要标记在细胞质域中，并在pH 4（活化条件）和pH 7（非活化条件）下测量其荧光。在pH 4时，标记在TM2 C末端（Q119C）或细胞质结构域相邻部分（G123C、V126C、A132C和A136C）的KcsA突变体显示出高荧光强度。另一方面，在pH值为7时，其强度较低。这些结果表明，这些区域在开放状态下位于疏水环境中，在封闭状态下位于亲水环境中。

我们还通过使用膜定位猝灭剂DPA观察TMR荧光的猝灭，确定疏水环境包括膜。据报道，当闸门打开时，细胞质域中的亚单位间相互作用变得微弱，从而破坏低聚物的稳定性(13). 因此，当门打开时，TMR不太可能被四个细胞质域包装到疏水环境中。然而，仍有可能，所观察到的荧光变化不是由TMR和膜之间的相互作用引起的，而是由TMR与不同亚单位中周围氨基酸残基之间的相互影响引起的。例如，Trp、Tyr、Phe和His都对TMR荧光有猝灭作用(21,22). 为了确保观察到的荧光变化对应于pH值的变化是由于TMR从亲水溶液移动到疏水膜，我们测量了DPA存在下的荧光(图7). 在pH为4的条件下，DPA的存在对五个突变体（TMR-Q119C、G123C、V126C、A132C和A136C）检测到了更大的猝灭效应，每个突变体在pH 4下没有DPA的情况下强度都很高。当TMR和DPA之间的距离或TMR和膜之间的距离足够近时，TMR荧光会因TMR到DPA的荧光共振能量转移而降低(14). 因此，TMR荧光的猝灭表明上述区域位于膜内或非常靠近膜。我们还检测到A143C有较大的猝灭效应，在pH 4和pH 7下，荧光强度没有显著差异(图6)，表明Ala-143与膜之间的距离在pH 4时比在pH 7时更近，并且该位点保持在相同的环境中。因此，当通道打开时，即使位置向膜移动，它也从未进入膜。

根据这些结果和以前的研究，我们提出了一个构象模型(图8). 在闭合状态下，束交叉点（TM2的C端）附近的pH感应位置形成一个复杂的网络，使闭合状态稳定(10)四个细胞质结构域形成稳定的低聚物。在这种状态下，我们在本文中观察到的九个标记残基处于亲水环境中。当细胞内pH值变低时，pH感应位点的网络中断(10)TM2螺旋在Gly-99周围的一个铰链点弯曲，使其张开(9). 这导致细胞质结构域的低聚物不稳定(13)每个细胞质结构域都向膜移动，从而使门变宽。最后，细胞质结构域的一部分位于膜或膜附近，以调节门控。因此，TM2（Gln-119）C末端和部分细胞质结构域（Ala-123、Val-126、Ala-132和Ala-136）周围的环境从亲水环境切换到疏水环境。

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图8。

重新安排的模型。亚基的四个细胞质域在封闭状态下形成一个低聚物（pH 7）。低聚物在开放状态（pH 4）下不稳定，导致细胞质域摆动，从而接近或进入膜。

该模型可以解释细胞质结构域缺失突变体的电生理数据。细胞质结构域对拉宽栅极起着重要作用；因此，这个区域的缺失应该会阻止闸门轻易打开。与此一致，细胞质结构域缺失突变体KcsAΔ125–160和KcsA△135–160的电导较小。KcsAΔ125–160的开放概率也较低。因此，细胞质区域可能是使门打开的关键，这导致了KcsA门的特性。然而，我们没有观察到KcsAΔ145-160的电导或开放概率下降。事实上，电导增加了。这一结果表明，细胞质结构域的C末端决定结构域的位置，从而影响通道活性。

在这项研究中，我们发现在KcsA门控期间Gln-119位点发生构象变化。据说TM2的C末端，包括Gly-116和Gln-119，是一个重要的选通区域。X射线分析表明，四条TM2螺旋在闭合状态下形成一束，张开以在通道中形成一个宽的入口通道(5,9). 然而，我们无法检测到Gly-116位点的任何变化，因为TMR仅检测到环境差异。换句话说，无论pH值如何，Gly-116都保持在相同的环境中。

为了阐明蛋白质的功能，我们需要做的不仅仅是解决蛋白质的结构。还必须研究蛋白质的动力学行为。这是因为蛋白质中的柔性区域可能对其功能非常重要，但也是结构研究中最难解决的问题。在这里，我们使用离子通道作为模型来证明这一点。本研究中观察到的大通道重排发生在细胞质结构域中，由于其柔性，在酸性pH条件下其结构尚未确定。事实上，单分子研究表明，KcsA通道选通导致了与通道功能不同步的大运动(23)这意味着通道结构不能唯一地决定门何时打开，尽管我们确实知道细胞质结构域的C末端在膜内或其附近。因此，为了进一步阐明KcsA门控背后的机制，需要对其他因素进行研究，尤其是在单分子水平上。

致谢

参考文献