美国生理学杂志肾生理学。2009年11月；297（5）:F1174–F1180。
运动激活氧化还原敏感转录因子并恢复肾脏D1老年大鼠的受体功能
德克萨斯州休斯顿市休斯顿大学药学院心脏和肾脏研究所
通讯作者。收到日期：2009年7月14日；2009年9月15日接受。
摘要
我们以前曾报道过通过蛋白激酶C（PKC）引起的年龄相关氧化应激增加D1受体（D1R）磷酸化并导致老Fischer 344大鼠肾近端小管（RPT）中D1R-G蛋白解偶联。这导致D1R激动剂SKF-38393抑制Na的能力降低+-K（K）+-老年大鼠RPT中的ATP酶。在这里，我们研究了跑步机运动对氧化应激标记物、PKC、D1R磷酸化、D1R-G蛋白偶联和Na的影响+-K（K）+-成年和老年大鼠RPT中的ATP酶活性。我们发现，老年大鼠RPT中丙二醛（氧化应激的标志物）水平升高，运动期间降低。运动老年大鼠RPT中核红细胞相关因子（Nrf）-2和核因子（NF）-κB（参与抗氧化酶基因转录的转录因子）的核水平增加。同时，抗氧化酶、超氧化物歧化酶和血红素氧化酶-1的活性和表达增加。运动期间，与年龄相关的D1R mRNA和蛋白质水平下降减弱。此外，老年大鼠运动降低PKC活性和D1R磷酸化，增加SKF-38393介导的[35S] 鸟苷5′-O（运行）-（3-硫代三磷酸）结合（D1R-G蛋白偶联的指标）。SKF-38393也能抑制Na+-K（K）+-这些动物体内的ATP酶。此外，运动使老年大鼠的蛋白尿减少，磷尿增加。这些结果表明，锻炼在提高抗氧化防御能力、减少氧化应激、改善肾功能，尤其是D1R功能方面具有有益的作用。Nrf-2和NF-κB似乎在这一现象中起着关键作用。
关键词：运动，衰老，D1受体，核红细胞相关因子-2，核因子-κB
肾多巴胺D类1受体在钠稳态中起关键作用，尤其是在钠摄入量增加时(17,27,29). 在盐超载期间，肾脏近端小管内多巴胺合成增加，通过D1受体抑制钠转运蛋白+-K（K）+-ATP酶和钠+/H（H）+交换器，导致钠排泄增加并维持钠稳态(29,45). 肾脏D受损1受体信号和功能在衰老、糖尿病和高血压中已有报道(24,42,47).
衰老伴随着包括肾脏在内的几个器官系统的大量形态和功能变化(22,39). 在衰老过程中观察到的许多退行性变化以及随之而来的发病率和死亡率都与年龄相关的氧化应激增加有关(1). 衰老过程中氧化应激的增加与肾脏多巴胺D的年龄相关性下降有关1受体的功能部分归因于较高的蛋白激酶C（PKC）活性和D1肾近端小管中的受体磷酸化(2,5). 我们还报道了通过补充抗氧化剂天妇罗来减少氧化应激可以改善D1老年大鼠的受体功能(23).
据报道，运动可以减少大鼠和小鼠的氧化应激(4,38). 然而，运动如何减少氧化应激的机制尚不清楚。有研究表明，通过诱导抗氧化酶的表达进行适度运动可以减少氧化应激(16,25). 转录因子核红细胞相关因子（Nrf）-2是抗氧化防御机制的一个重要介体，该机制通过转录调节多个II期抗氧化酶基因，包括谷胱甘肽S公司-转移酶（GST）、NAD（P）H-醌还原酶、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（GCS）、超氧化物歧化酶（SOD）和血红素氧化酶-1（HO-1）(4,25,30,33,35,41). 另一种转录因子-核因子（NF）-κB，通常被认为参与炎症过程(34)据报道，还可调节抗氧化酶如MnSOD、GCS和GST的转录(25,31,32,36).
在本研究中，我们研究了适度运动对成年和老年大鼠血浆和RPT中氧化应激和抗氧化酶的影响。此外，还研究了适度运动对这些动物RPT中Nrf-2和NF-κB活性的影响。更重要的是，我们研究了运动对PKC活性D的影响1受体磷酸化和D1受体激动剂SKF-38393介导G蛋白的刺激和钠的抑制+-K（K）+-RPT中的ATP酶。将久坐的成年大鼠和老年大鼠纳入研究，比较运动对上述参数的影响。此外，我们还测定了久坐和运动的成年和老年大鼠的蛋白尿和磷尿。
材料和方法
跑步机运动。
Harlan Sprague-Dawley（印第安纳波利斯）提供的雄性Fischer（F344/NNiaHsd）大鼠年龄为3个月（成年）和21个月（老年），从国家老龄研究所（马里兰州贝塞斯达）购买。这些动物被安置在大学动物护理设施内，本研究得到了动物护理和使用委员会的批准。在进行任何实验性动作之前，对大鼠进行7天的习服。成年和老年大鼠分为久坐组和运动组。运动组成年大鼠和老年大鼠进行跑步机运动12wk（12m·min−1·60分钟−1，15度等级，5天/周）(4). 成年和老年大鼠的久坐组不进行运动。所有四组老鼠都可以自由享用标准的啮齿动物食物和水。
动物外科。
在最后一次运动后48 h，用戊巴比妥钠（50 mg/kg体重）麻醉大鼠，并与相应年龄匹配的静坐对照大鼠一起麻醉。进行气管切开术以辅助通气，并在腹部中线切开。用注射器抽吸膀胱尿液，并在−80°C下冷冻以进行进一步分析。在肾动脉分叉处下方使用PE-50导管对腹主动脉进行插管，并在EDTA涂层管中采集血液。用不含钙的Krebs-Henseleit缓冲液（KHB）灌注肾脏[KHB-B（mM）:118 NaCl，27.2 NaHCO三，4氯化钾，0.12氯化镁2，1千赫2人事军官4，5葡萄糖和10 HEPES，pH 7.4]。用含有230 U/ml g胶原酶和250 U/ml透明质酸酶的KHB-B缓冲液进行原位肾脏消化。切除肾脏，用实验室常规使用的方法分离RPT(18). 通过在4°C下以3000 rpm离心血液15分钟来分离血浆。
PKC活动。
根据制造商的方案（威斯康星州麦迪逊市普罗米加），使用非放射性分析试剂盒测定PKC活性。
SOD活性。
使用Cayman Chemical（密歇根州安阿伯）的超氧化物歧化酶检测试剂盒测量RPT匀浆中的SOD活性。
丙二醛的测量。
采用先前公布的方法，将RPT匀浆中的丙二醛（MDA）水平作为硫代巴比妥酸反应物质进行测量(23). 摩尔消光系数，1.56 X 105M/cm，用于量化MDA。
HO-1的测量。
使用assay Designs（密歇根州安阿伯）的大鼠HO-1酶联免疫吸附测定试剂盒测定血浆和RPT匀浆中HO-1的水平。
尿蛋白测定。
尿液蛋白水平采用比钦酸（BCA）蛋白检测试剂盒（伊利诺伊州罗克福德热电科学公司）和牛血清白蛋白（BSA）作为标准测定。
尿肌酐的测量。
使用Taussky法通过Jaffe反应测量尿液中的肌酐水平(43). 简单地说，将50μl 10%NaOH添加到500μl稀释（1:100）尿样中。添加饱和苦味酸溶液（200μl），并在室温下培养混合物20 min。然后在520 nm处读取样品，并使用已知肌酐浓度生成的标准曲线测定浓度。
尿磷酸盐的测量。
使用Taussky和Shorr方法测量尿液中无机磷酸盐的水平(44).
[35S] 5′-O-（3-硫代三磷酸）结合分析。
[35S] 5英尺-O（运行）-如前所述进行（3-硫代三磷酸）（GTPγS）结合(26). 简而言之，5μg肾近端小管膜与载体或不同浓度的SKF-38393（10 pmol/l至10μmol/l）在[35S] GTPγS（最终浓度6nM）在30°C下持续1小时。非特定[35S] 在100μM GTP存在下测定GTPγS结合。
纳+-K（K）+-ATP酶活性。
使用新分离的RPT测定Na+-K（K）+-正如我们之前报道的那样，ATP酶活性(10–12,37). 简言之，RPT（1 mg/ml）与载体（0.1%焦亚硫酸钠）或SKF-38393（最终浓度10−9M至10−5M） 在37°C下保持15分钟。通过在液氮中快速冷冻RPT来终止反应。RPT悬浮液（1 mg蛋白质/ml）用于测定哇巴因（1 mmol/l）敏感钠+-K（K）+-以ATP（4 mmol/l）的终点磷酸水解为指标的ATP酶活性。用比色法测量释放的无机磷酸盐。
蛋白质测量。
使用BCA蛋白检测试剂盒和BSA作为标准物测量蛋白质。
核蛋白和细胞溶质蛋白的分离。
按照制造商的说明，使用NE-per核和细胞溶质萃取试剂（伊利诺伊州罗克福德的Thermo Scientific）分离RPT的核和细胞溶解部分。
转录因子Nrf-2和NF-κb的测定。
使用特异性Nrf-2和NF-κB抗体（加州圣克鲁斯市圣克鲁斯）和辣根过氧化物酶（HRP）结合的山羊抗兔二级抗体，通过Western blotting法测定RPT中的核水平。
D的免疫沉淀1受体。
肾近端小管膜用于免疫沉淀D1使用特异性D的受体1先前发表的受体抗体(5). 简单地说，RPT在蔗糖缓冲液中均质[在mM中：250蔗糖、10 Tris、1苯基甲基磺酰氟（PMSF）、1原钒酸盐、2.5焦磷酸钠、1β-甘油磷酸和蛋白酶抑制剂混合物，pH 7.4]，并且通过差速离心分离膜。将膜（1.5 mg/ml）悬浮在免疫沉淀（IP）缓冲液中（mM:140 NaCl，3 KCl，10 Na2高性能操作4，2千赫2人事军官4，1个原钒酸钠，1个PMSF，1%Nonide P-40，0.5%胆酸钠，0.1%十二烷基硫酸钠和蛋白酶抑制剂混合物，pH 7.4），在4°C下与蛋白A/G琼脂糖珠培养30分钟，并在14000下离心克.上清液（不含与琼脂糖珠结合的非特异性蛋白质）与2.5μg D1受体抗体（Millipore，Billerica，MA）在4℃下培养2小时，然后在4℃与50μl琼脂糖珠培养过夜。通过离心沉淀抗原-抗体-A/G琼脂糖珠复合物，用IP缓冲液洗涤两次，用50 mM Tris·HCl洗涤一次，pH 8.0。抗原-抗体复合物用莱姆利缓冲液（125mM Tris·HCl、4%SDS、5%β-巯基乙醇和20%甘油）在37°C下解离1小时。样品在室温下涡旋和离心，上清液用于电泳。
检测D1受体丝氨酸磷酸化。
免疫沉淀D1受体样品（5μl）通过SDS-PAGE分离并转移到聚偏二氟乙烯膜上。在室温下，用含0.05%吐温20的PBS中5%的BSA封闭膜2小时，并用特定的磷酸丝氨酸抗体（克隆16B4；Calbiochem，Gibbstown，NJ）1:400在2.5%BSA中培养4℃过夜。使用HRP缀合的第二抗体来探测磷酸丝氨酸抗体，并使用增强化学发光试剂盒来观察条带（Alpha Diagnostics，San Antonio，TX）。然后使用抗体剥离溶液（Alpha Diagnostics）剥离膜，并重新进行D1使用特异性D的受体蛋白1受体抗体（Millipore）。
D类1逆转录聚合酶链反应。
RPT在−80°C的条件下储存在RNA保存试剂中，并按照制造商的说明使用RNeasy迷你试剂盒（加利福尼亚州巴伦西亚的齐亚根）分离总RNA。然后使用Clontech（加州山景城）的Advantage RT for PCR试剂盒，使用RNA合成cDNA。多巴胺D1分别使用与核苷酸序列263-281和688-706对应的已发表基因特异性引物（正向5′-AGATCTCTTGGTGCTGTC-3′和反向5′-ATAATGGCTACGGATGT-3′）扩增受体信息(40). 放大的样品在含有溴化乙锭的0.8%琼脂糖凝胶上运行，使用紫外线透射仪对条带进行可视化，并使用Alpha Innotech软件进行量化。
结果
与成年大鼠相比，久坐老人RPT中的氧化应激标记物MDA水平较高。老年大鼠的运动使RPT中的MDA水平降至成年大鼠的水平(). 血浆中抗氧化酶HO-1水平升高()和RPT()运动过的老老鼠。运动成年大鼠和老年大鼠血浆中SOD总活性增加，这是抗氧化能力的另一个标志().
运动降低老年大鼠丙二醛（MDA）水平升高，增加老年大鼠血浆和肾近端小管（RPT）血红素氧化酶（HO）水平，增加成年和老年大鼠总超氧化物歧化酶（SOD）活性。AS，成人久坐；AE，成人运动；OS，老式久坐；OE，旧的训练。A类：在RPT匀浆中测量MDA，作为氧化应激的标志，如材料和方法.B类和C类：在血浆中测量HO-1(B类)和RPT匀浆(C类)使用HO-1酶联免疫吸附测定试剂盒。D类：使用SOD测定试剂盒测定总SOD活性。结果为平均值±SD；n个=4或5只动物A–D.P（P）<0.05与AS（*）、OS（#）、AS、AE和OE（$）、AS和OS（†）。
运动老年大鼠RPT中转录因子Nrf-2和NF-κB的核水平升高(,A类和B类).
运动增加了老年大鼠RPT核部分的转录因子核红细胞相关因子（Nrf）-2和核因子（NF）-κB p65。A类：RPT中的核Nrf-2水平。B类：RPT中的核NF-κB p65水平。核蛋白（15μg）(A类和B类)通过SDS-PAGE进行解析，并使用特定抗体对Nrf-2和NF-κB p65进行免疫印迹。结果为平均值±标准差；n个=4只动物/组*P（P）与AS相比<0.05。
D1久坐老年大鼠RPT中受体mRNA水平较低。运动增加了D1老年大鼠受体mRNA水平(). 此外，D水平降低1久坐老年大鼠RPT膜中的受体蛋白，这些动物的RPT膜随着运动而增加().
运动可提高D水平1受体mRNA和蛋白质。A类：D1用基因特异性引物扩增受体mRNA，并在0.8%琼脂糖凝胶上进行解析。用甘油醛-3-磷酸脱氢酶对谱带进行归一化。B类：20μg RPT膜蛋白通过SDS-PAGE溶解，D1用特异性抗体免疫印迹法测定受体蛋白；n个=4只动物/组。结果为平均值±标准偏差。P（P）与AS（*）和OS（#）相比<0.05。
与成年大鼠相比，久坐老年大鼠RPT的基础PKC活性较高。运动老年大鼠RPT中PKC活性降低(). D的水平1在久坐的老年大鼠中，RPT膜中的受体磷酸化程度较高，这些动物的RPT膜中的受体磷酸化程度随着运动而降低().
运动降低升高的蛋白激酶C（PKC）活性和D1老年久坐大鼠的受体磷酸化。A类：使用Promega的PepTag分析试剂盒测量PKC活性。B类：D1受体蛋白被免疫沉淀，如材料和方法，并使用特定的磷丝氨酸抗体测定受体磷酸化；n个=4只动物/组。结果为平均值±标准差。P（P）与AS（*）和OS（#）相比<0.05。
D类1受体激动剂SKF-38393增加了[35S] GTPγS结合()并抑制Na+-K（K）+-ATP酶活性()在成年大鼠的RPT中。SKF-38393介导了[35S] GTPγS结合()和钠的抑制+-K（K）+-ATP酶()在久坐的老年大鼠中减少。刺激[35S] GTPγS()和钠的抑制+-K（K）+-ATP酶()SKF-38393使运动老年大鼠恢复。
运动量增加[35S] 5英尺-O（运行）-（3-硫代三磷酸）（GTPγS）结合和钠+-K（K）+-ATP酶抑制对D的反应1老年运动大鼠的受体激动剂（SKF-38393）。A类: [35S] 在5μG RPT膜中测量G蛋白活化指数GTPγS结合。B类：Na（钠）+-K（K）+-如中所述，在RPT中测量ATP酶材料和方法;n个=5只动物/组。结果为平均值±标准差。P（P）<0.05与AS（*）、OE（#）和OS（$）。
久坐的老年大鼠的尿蛋白水平较高，运动后尿蛋白水平下降(). 运动增加成年和老年大鼠尿磷水平().
运动可减少Fischer 344大鼠的蛋白尿并增加磷酸盐。A类：尿蛋白水平标准化为尿肌酐。B类：尿磷酸盐水平标准化为尿肌酐。尿总蛋白用比新新酸法测定。使用Taussky-Shor测量尿磷酸盐(44)方法。使用Jaffe法测量尿肌酐(43)如中所述材料和方法结果为平均值±SD；n个=5只动物/组。P（P）<0.05 vs.AS（*），vs.OS（#），以及vs.AS和OS（$）。
讨论
我们的研究清楚地表明，运动减少了氧化应激，刺激了转录因子（Nrf-2和NF-κB），增加了抗氧化酶，如HO-1和SOD。它还增加了D水平1老年大鼠RPT中的受体mRNA和蛋白质。此外，运动减少了PKC活性和D的年龄相关性增加1受体磷酸化和恢复D1老年大鼠RPT中的受体功能。此外，运动在减少蛋白尿和磷酸盐潴留方面改善了肾功能。
众所周知，锻炼可以降低老年人的发病率和死亡率，改善生理结果，减轻功能损伤，并防止慢性病的进展(14). 众所周知，运动可以增加抗氧化酶，减少氧化应激，改善内皮功能，降低冠心病风险(20). 此前，我们报道了F344/NNiaHsd大鼠氧化应激的增龄性增加，这与肾脏D1老年大鼠的受体功能障碍(23). 在这项研究中，我们发现运动降低了老年（24个月）大鼠的氧化应激水平。然而，有研究表明，运动在减少氧化应激方面的有益作用在52岁（13个月）大的小鼠中很明显，但在78岁（19.5个月）的小鼠中不明显(37). 运动训练不能减少78-wk小鼠的氧化应激尚不清楚。然而，我们发现24个月大鼠的运动训练可以减少氧化应激。这种差异的可能解释可能是因为我们的研究中使用了不同的动物种类和运动方案。纳瓦罗等人(38)在他们的研究中，从28周开始，对小鼠采用了运动方案（跑步机速度为10、15和20cm/s，每周5分钟，每周78周）。我们使用了不同的锻炼方案（跑步机速度为12米·分钟−1·60分钟−1分别从3个月和21个月开始，在成年和老年Fischer 344大鼠中进行，15度等级，5天/周，持续3个月）。
HO-1，一种诱导型抗氧化酶，能够催化血红素转化为胆红素(32)，在老年大鼠中通过运动上调。胆红素也是一种有效的抗氧化剂，能够对抗氧化剂种类(32). 老年大鼠运动时HO-1的增加可能是对抗衰老过程中氧化应激升高的一种代偿机制。运动增加了老年大鼠血浆和RPT中HO-1的含量，但成年大鼠没有。成年大鼠和老年大鼠血浆中SOD活性同样升高。与仅在成年运动大鼠中使用SOD相比，在老年运动大鼠体内观察到的氧化应激的大幅度降低可能是由两种抗氧化酶（即HO-1和SOD）的上调介导的。虽然原因尚不清楚，但运动对老年大鼠抗氧化酶调节的更大反应可能是为了对抗这些动物的更高程度的氧化应激(22). 值得注意的是，老年大鼠的氧化应激升高并不是这些动物抗氧化机制受损的结果。相反，肾NADPH氧化酶的一个亚单位的增龄增加似乎有助于老年大鼠的氧化应激增加(三).
HO-1和SOD均受转录因子Nrf-2和NF-κB的调节(25,28,32). 这些转录因子在成年大鼠和老年大鼠的运动中均上调，尽管只有老年大鼠显著上调。已知Nrf-2与多种酶基因上的抗氧化反应元件结合，如HO-1、SOD、GST、GCS和过氧化氢酶(4,25,30,33,35,41). 另一方面，NF-κB作为一种转录因子的作用能够上调抗氧化酶，如HO-1、MnSOD、GCS和GST，直到最近才被认识到(25,31,32,36). 有报道表明运动能上调NF-κB并有利于抗氧化酶的诱导(13,25). 我们发现，在老年大鼠的RPT中，运动介导的Nrf-2和NF-κB的激活分别为29%和25%。与单独增加相比，Nrf-2和NF-κB水平的增加可能足以上调抗氧化防御，如HO-1()从而减少氧化应激并恢复D1运动老年大鼠RPT中的受体功能。值得一提的是，本研究中使用的核组分富含核蛋白。通过Western blotting检测细胞溶质和核组分中的组蛋白去乙酰化酶（HDAC）核标记物证实了这一点。细胞核中HDAC的水平高于细胞溶质部分（数据未显示）。然而，我们未能使用HDAC作为负荷控制，因为用于检测Nrf-2和NF-kB的核蛋白数量（15μg）导致HDAC的背景信号较高，给其量化带来困难。
我们以前的研究表明，与年龄相关的D1受体和G蛋白偶联导致钠减少+-K（K）+-多巴胺对ATP酶的抑制和钠尿反应(15). 早些时候，我们已经证明运动可以恢复老年大鼠对SKF-38393的利钠素反应(4). 然而，没有研究运动后恢复这种反应的机制。因此，本研究旨在研究运动对D的影响1成年和老年大鼠RPT的受体功能。在这里，我们表明锻炼可以恢复D1受体G蛋白偶联与钠+-K（K）+-ATP酶抑制对D的反应1老年动物中的受体激动剂SKF-38393。D类1受体-G蛋白偶联在成年动物中不受运动的影响。运动还导致D增加1成年和老年大鼠RPT膜中的受体蛋白和正常化D1老年运动大鼠的受体mRNA。此外，运动诱发的D有增加的趋势1RPT匀浆中的受体蛋白（数据未显示）。
我们实验室以前的工作表明，氧化应激通过PKC-G蛋白偶联受体激酶（GRK2）依赖性途径增加了较高的基础丝氨酸磷酸化，并导致D1老年动物的受体功能障碍(5,8,9). 向老年大鼠补充抗氧化剂可降低PKC和GRK2活性，降低D1受体磷酸化，并恢复D1老年大鼠RPT的受体功能(2,5). 在本研究中，虽然我们没有测量GRK2活性，但我们发现运动降低了PKC活性和D1老年大鼠的受体磷酸化。运动诱导的氧化应激减少可能导致PKC活性的减轻，随后D1老年大鼠的受体磷酸化。基底D减少1受体磷酸化可能负责D1受体功能增加[35S] GTPγS结合和Na+-K（K）+-ATP酶抑制对D的反应1老年大鼠RPTs中的受体激动剂。
另一个值得注意的发现是，运动减少了老年动物的蛋白尿，改善了成年和老年大鼠的磷酸盐排泄。蛋白尿和磷潴留是慢性肾脏病的并发症，会恶化生活质量并增加疾病负担(21,30亿). 晚期肾病患者的磷酸盐潴留通过饮食中的磷酸盐限制和磷酸盐粘合剂进行治疗，以防止并发症，如钙×磷酸盐产品沉积在血管床和软组织中、继发性甲状旁腺功能亢进和肾性骨营养不良(19,30年). 慢性肾脏疾病中的蛋白尿是预后指标，是疾病进展率的信号(21). 24个月大的Fischer 344大鼠运动期间减少蛋白尿的机制尚不清楚。运动可能改善了老年大鼠肾小球基底膜（GBM）的过滤机制，从而减少蛋白尿。在这方面，应该注意的是，24个月大的Fischer 344大鼠的足细胞（支持和维持GBM过滤机制的关键细胞）的完整蛋白nephrin减少。在这些大鼠中，nephrin水平的降低可能导致蛋白尿(46). 运动可能会导致肾蛋白水平升高，这可能是运动老年大鼠减少蛋白尿的机制，尚需确定。然而，适度运动作为一种治疗方式，可以潜在地减少肾脏疾病中的磷潴留和蛋白尿，这在本研究中是一个有希望的发现。
总之，运动介导的抗氧化酶上调和随后氧化应激的减少导致PKC活性和D1受体磷酸化，导致D1老年大鼠的受体功能。氧化还原敏感性转录因子Nrf-2和NF-κB可能是减少与年龄相关的氧化应激增加的关键因素，因为它们可以在抗氧化酶上调级联反应中发出精液事件信号。需要进一步的实验来阐明这些转录因子在减少氧化应激和恢复肾脏D1受体功能。
赠款
这项工作得到了国家老龄补助金研究所AG-25056（发给M.F.Lokhandwala）和AG-029904（发给M.Asghar）的支持。
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