低密度脂蛋白受体（LDLR）对维持血浆胆固醇水平至关重要(1). 该受体的突变是常染色体显性高胆固醇血症（ADH）的主要病因，其特征是血浆胆固醇水平升高，心血管疾病风险增加(2,三). 根据其在胆固醇稳态中的关键作用，LDLR的表达受到严格调控。的转录低密度脂蛋白受体该基因通过固醇反应元件结合蛋白（SREBP）转录因子的作用与细胞胆固醇水平偶联(4,5). 当细胞固醇水平下降导致增加时，SREBP的加工增强至其成熟形式低密度脂蛋白受体转录(6). LDLR表达的转录后调节也是脂蛋白代谢的主要决定因素。遗传研究已确定编码LDLR适配器蛋白1的基因突变(LDLRAP1/ARH机场) (7,8)和SREBP靶基因前蛋白转化酶枯草杆菌素/可欣9(PCSK9系列)导致LDLR的稳定性、内吞或转运发生改变(9-13).
肝脏X受体（LXRs）也是胆固醇代谢的重要转录调节因子。LXRα（NR1H3）和LXRβ（NR1H2）是对细胞胆固醇过量反应而激活的固醇依赖性核受体(14). LXR靶基因，如ABCA1型和ABCG1公司促进细胞胆固醇流出，帮助维持全身甾醇稳态(15,16). 缺乏LXR的小鼠在其组织中积累固醇并表现出加速动脉粥样硬化，而合成的LXR激动剂促进胆固醇反向转运并保护小鼠免受动脉粥样硬化的影响(17-19). LXR和SREBP信号通路对细胞内固醇水平的协调调节使我们研究了LXR是否控制胆固醇的摄取和流出。
我们最初测试了LXR调节HepG2人肝细胞和原代小鼠巨噬细胞LDL摄取的能力。用合成LXR配体（GW3695或T1317）处理降低BODIPY标记的LDL的结合和摄取(). LXR配体没有引起LDLR mRNA表达的变化（图S1A）；然而，它们以剂量依赖性的方式迅速降低LDLR蛋白水平，这种作用与细胞固醇水平无关(). LXR配体可相互增加LXR的既定靶点ABCA1蛋白水平(). LXR配体对缺乏LXRα和LXRβ的巨噬细胞或小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的LDLR水平没有影响(和S1B）。LXR激活也降低了人SV589成纤维细胞中的LDLR蛋白，但不降低mRNA水平（图S1C，D）(20).
LXR的激活通过降低LDLR蛋白的表达来抑制LDL的摄取。（A） 二甲基亚砜或合成LXR配体GW3965（GW）和T090117（T）处理的HepG2细胞和小鼠腹腔巨噬细胞中BODIPY-LDL的结合和摄取(N个= 6). （B） 用DMSO或GW（1μM）预处理HepG2细胞8 h，然后在LPDS或含有DMSO和GW的甾醇消耗培养基（LPDS补充5μM辛伐他汀和100μM甲羟戊酸）中再培养18 h（C）将原代小鼠腹腔巨噬细胞培养在甾醇耗尽培养基中，并用指定剂量的GW处理8 h。（D）腹腔巨噬细胞培养于甾醇耗尽介质中，并使用GW（1μM）处理指定时间。（E） 。来自WT或Lxr公司αβ-/-小鼠在甾醇消耗培养基中培养，并用LXR配体处理。（F） 稳定表达LDLR-GFP的HepG2细胞经DMSO、GW或T（1μM）处理72小时后的免疫荧光图像。所有印迹均代表至少3个独立实验*P（P）<0.05，**P<0.01。本图和所有后续图中的误差条表示平均值±SD。
为了研究内源性LXR配体和LDLR表达之间的联系，我们使用了一种编码氧化甾醇硫转移酶（Sult2b1）的腺病毒载体(21,22). SV589细胞中Sult2b1对氧甾醇激动剂的消耗导致LDLR蛋白增加，这种作用被合成配体逆转（图S1E）。我们进一步测试了LXR激动剂对转染载体产生的LDLR的影响（即不受内源性SREBP调节）。在稳定表达LDLR-GFP融合蛋白的HepG2细胞中，LDLR-GFP的表达主要定位在质膜上(). LXR的配体激活降低了LDLR-GFP的表达，并将蛋白质从质膜重新分配到细胞内区室。
为了研究LXR影响LDLR的机制，我们通过转录谱检测了LXR靶基因。我们确定了一种潜在的调节剂，在我们的阵列上表示为9430057C20Rik（表S1），它对应于最初根据其与肌球蛋白调节轻链的相互作用确定的蛋白质(23). 我们建议将这种蛋白质改名为Idol（用于我可导电的D类麦草o个对于L（左）DLR）以反映其生物功能（见下文）。Idol包含带4.1和Ezrin/Radixin/Moesin同源（FERM）结构域，该结构域介导与跨膜蛋白细胞质结构域的相互作用(24,25). Idol在含FERM结构域的蛋白质中是独一无二的，它还包含一个C末端RING结构域，并被提议作为E3-双肽连接酶，尽管其生物底物尚未确定(23,26).偶像mRNA在小鼠中广泛表达体内（图S2A）。细胞暴露于升高浓度的低密度脂蛋白诱导的偶像和阿布卡1mRNA，表明其表达对细胞外胆固醇水平有反应（图S2B）。此外，LXR激动剂诱导偶像以LXR依赖的方式在多个细胞中表达，包括原代肝细胞、原代巨噬细胞、MEF和HepG2细胞(和S2C-E）。GW3965诱导小鼠表达偶像在多种组织中，包括脾脏、肠道和肾上腺(). 有趣的是，在肝脏中仅观察到LXR激动剂对Idol的适度调节，这与阿布卡1法规（图S2F）。脾脏和肝脏中的Idol mRNA水平也显著降低Lxr公司αβ-/-小鼠与野生型对照组的比较（图S2G）。
LXR靶基因Idol是LDLR蛋白水平的调节器。（A） GW或T（1μM）治疗后小鼠原代肝细胞和腹腔巨噬细胞中Idol的LXR依赖性调节。（B） 40 mg/kg GW3956经口灌胃3天诱导小鼠组织中Idol mRNA表达(N个=每组6人）。实时PCR检测基因表达。（C） 与LDLR-GFP和野生型或RING域突变人类和小鼠Idol共同转染的HEK293细胞的免疫荧光图像。（D） 与mIdol和LDLR-GFP表达质粒联合转染的HEK293细胞中LDLR-GFP蛋白的剂量依赖性降低。通过免疫印迹分析总细胞裂解物。箭头表示偶像蛋白质。（E） 原代肝细胞、HepG2细胞或McRH7777细胞在甾醇耗尽培养基中培养，并用Ad-GFP或Ad-Idol感染。用免疫印迹法分析总细胞裂解物。（F） Ad-βgal或Ad-Idol感染后McRH777（McR）细胞和LXRαMEF对BODIPY-LDL的摄取(N个= 3). 所有印迹均代表至少3个独立实验*P（P）< 0.05 **P（P）< 0.01.
LXR调节偶像对环己酰亚胺不敏感，表明这是一种直接转录效应（图S3A）。它不是继发于SREBP-1c的诱导，因为阻断SREBP加工的氧化甾醇仍然诱导偶像表达式（图S3B）。LXR通过与启动子中的共有元件（LXRE）结合来激活靶基因。我们在小鼠上游约2.5 kb处发现了一个LXRE偶像翻译起始点（图S3C）并生成了包含该区域的报告构造。LXRα和GW3965的激活导致报告活性增加约4倍，而在缺乏功能性LXRE的情况下，报告活性基本上被消除（图S3D）。电动迁移分析表明，LXR/RXR与Idol LXRE的野生型而非突变型结合（图S3E）。
鉴于Idol是一种假定的E3泛素连接酶，我们假设Idol诱导可能是LXR调节LDLR丰度的能力的基础。在人类HEK293T肾细胞中使用共转染系统，我们发现Idol表达将LDLR-GFP从质膜重新分配到细胞内隔间()并以剂量依赖的方式降低LDLR-GFP蛋白水平(). 事实上，即使Idol蛋白水平过低，我们的抗体也无法检测到，这也是有效的。相比之下，Idol在催化RING结构域中携带点突变（C387A）(26)对LDLR没有影响(和S4A）。偶像水平很低，即使是来自外源性载体，也表明偶像是一种不稳定的蛋白质。为了支持这一观点，当RING域发生突变时，Idol的水平大大提高，增加了Idol可能催化自身降解的可能性（图S4A）。
Idol对膜蛋白的影响似乎对LDLR具有选择性。转染的LRP1-GFP或APP-GFP蛋白的水平均受到Idol表达的影响，这两种蛋白均经历类似于LDLR的调节性内吞作用（图S4A）。同样，Idol也不影响ABCA1-GFP、内源性转铁蛋白受体、内源性肌球蛋白调节轻链或LDLR家族成员Lrp4和SorLA的蛋白质水平（图S4A，B）。这位关系非常密切的家庭成员ApoER2受到了《美国偶像》的轻微影响。腺病毒介导的Idol表达降低了原代肝细胞、HepG2细胞和McR-H7777大鼠肝细胞中的LDLR蛋白水平()并降低MEF和McR-H7777细胞的LDL摄取().
为了探讨内源性Idol在LDLR调节中的作用，我们开发了靶向Idol的shRNAs（图S5）。偶像特异性shRNAs增加MEF中的LDLR蛋白水平()和McR-H7777细胞()，不影响低密度脂蛋白受体或LXR或SREBP2靶mRNA(和S5），表明偶像活动是调节LDLR丰度的生理机制。为了支持这一观点，Idol-specific shRNAs增加了两个成纤维细胞的LDL摄取()和McR-H7777细胞(). 最后，Idol shRNA降低了LXR配体降低LDLR蛋白水平的能力，这与Idol对LXR依赖性LDLR的调节有关().
偶像敲低可诱导低密度脂蛋白的表达并促进低密度脂蛋白的摄取。（A） 用对照组（shLamin）或两个独立的腺病毒Idol shRNA构建物感染LXRαMEF，并在甾醇缺乏培养基中培养。细胞裂解物通过免疫印迹分析。（B） 对A处理的McRH7777细胞裂解产物进行免疫印迹分析。（C）通过实时PCR分析在A处理的LXRαMEF中的基因表达(N个=3). （D） 在感染Ad-shLAMIN、Ad-shIdol2或Ad-shIdol4后，测定LXRαMEF的BODIPY-LDL结合和摄取(N个= 3). （E） 用Ad-shLAMIN或Ad-shIdol2感染McRH7777细胞，然后用二甲基亚砜或GW（1μM）治疗，测定其对BODIPY-LDL的摄取(N个= 4). （F） 用Ad-shLAMIN或Ad-shIdol2感染LXRαMEF 24 h。随后，用DMSO或GW处理细胞，然后在甾醇耗尽培养基中培养。所有印迹均代表至少3个独立实验***P（P）< 0.001.
脉冲相位标记研究表明Idol并没有阻断低密度脂蛋白受体mRNA翻译或未成熟蛋白（p）的出现，但它完全阻止了成熟（m）糖基化形式的出现(). 鉴于RING域的突变使Idol失活，我们的数据最简约的解释是Idol作为E3连接酶触发LDLR本身的泛素化，从而标记其降解。我们发现，活性但非突变Idol的表达显著增强了转染LDLR在293T细胞中的泛素化(). 对一系列在成熟或循环途径的不同阶段被捕获的LDLR受体突变体的分析表明，Idol能够在内质网中发挥作用。LDLR G546D不能退出内质网(27)，仍可能被《偶像》降级(). 用灯盏花素A（brefeldin A）处理细胞，可阻止蛋白质从内质网外运输，但不能抑制WT LDLR（图S6A）或G546D突变体（图S6B）的泛素化。氯化铵（溶酶体pH值的破坏剂）处理抑制了LXR诱导的内源性LDLR降解（图S6C）。这些数据表明，《美国偶像》可以在内质网中泛素化前体LDLR，随后被贩运到溶酶体是降解所必需的。重要的是，我们还观察到原代巨噬细胞内源性LDLR的LXR配体依赖性泛素化()原代肝细胞内源性LDLR的Idol依赖性泛素化(). GW3965在4小时内触发LDLR泛素化，与LDLR降解的时间进程一致(，参见。).
Idol通过其细胞质域中保守残基的泛素化降低LDLR蛋白的表达。（A） Ad-LacZ或Ad-Idol HepG2-LDLR-GFP感染24小时后，用[35S] 蛋氨酸和[35S] 半胱氨酸15分钟，并按指示进行追踪。样品在标记后的指定时间点进行免疫沉淀。（B） 用LDLR-GFP、Idol和HA-ubiquitin表达质粒共转染HEK293细胞。36小时后，对裂解产物进行免疫沉淀和免疫印迹。（C） 在用Idol和WT或突变的LDLR表达质粒共转染48小时后，通过免疫印迹分析总的HEK293细胞裂解物。（D） 腹腔巨噬细胞在固醇耗尽培养基中培养，并用1μM GW3965处理4小时。用抗泛素免疫沉淀总裂解物，然后免疫印迹LDLR。（E） 用Ad-GFP或Ad-Idol感染原代小鼠肝细胞，并在甾醇耗尽培养基中培养。24小时后，用抗泛素抗体对裂解产物进行免疫沉淀，然后进行LDLR免疫印迹。（F） LDLR细胞内结构域的进化保护。指出了潜在的泛素化位点。（G） HEK293总细胞裂解物的免疫印迹分析与对照或Idol表达质粒以及指示的突变LDLR构建物共同转染。LDLR构造中的编号是指1F。（H） 如图所示，用LDLR、突变LDLR（K6R/K20R/C29A）、Idol和HA-Ubiquitin表达质粒共同转染HEK293细胞。随后，用载体或25μM MG132处理细胞6小时。印迹代表至少2个独立实验。
我们使用突变分析确定了Idol-dependent LDLR降解的结构要求。Idol对缺乏整个50氨基酸胞内结构域的LDLR没有影响（图S6D）。LDLR胞内结构域包含3个高度保守的赖氨酸和一个半胱氨酸，可能是泛素化的潜在位点() (28). 任何这些残基的单一突变或所有三个赖氨酸残基的联合突变都不能阻止Idol降解LDLR(和S6E）。然而，在含有两个或三个突变赖氨酸的构建物上叠加半胱氨酸突变，使LDLR对降解不敏感。额外的突变表明，Idol介导的降解需要完整的K20或完整的C29(和S6E）。最后，K20和C29残基的联合突变不仅阻止了Idol对LDLR的降解，还阻止了泛素化(). 有趣的是，蛋白酶体阻断剂MG132尽管稳定了Idol蛋白，但并没有稳定LDLR，这与先前关于LDLR在溶酶体中发生降解的报道一致() (29,30).
研究LXR-Idol通路的激活是否影响LDLR的表达体内，我们用GW3965治疗小鼠。LXR激动剂以组织选择性方式降低LDLR蛋白水平，与Idol诱导程度一致(，参见。). 虽然在肠和腹腔巨噬细胞中观察到显著的作用，但LXR配体对肝脏中Idol mRNA和LDLR蛋白水平的影响最小。值得注意的是，当我们分析LXR-Idol通路不活跃的小鼠时，我们观察到了对常驻巨噬细胞和肠道中LDLR蛋白水平的相互影响(). 与野生型对照组相比，LXRαβ-/-小鼠巨噬细胞和肠道中的LDLR蛋白水平显著升高。肝脏中的LDLR水平也稍高。因此，LXR-Idol活性的增加或减少会影响LDLR的表达体内.
偶像表达调节LDLR表达并影响血浆胆固醇和LDL水平体内（A）C57BL/6小鼠经口灌胃给予40 mpk GW3965治疗3天。通过免疫印迹法分析常驻腹腔巨噬细胞、小肠（回肠）和肝脏的总裂解物的蛋白质水平。从腹膜腔中分离出巨噬细胞，并在没有在体外文化。（B） 用免疫印迹法分析WT和Lxrαβ-/-小鼠巨噬细胞、小肠（回肠）和肝脏的总裂解物。巨噬细胞是从腹膜腔中分离出来的，处理时没有在体外文化。（C） 用Ad-β-半乳糖或Ad-Idol转导C57BL/6小鼠6天后血浆胆固醇的分析。(N个=8只小鼠/组。）（D） 感染Ad-β-半乳糖或Ad-Idol的小鼠的尺寸分馏脂蛋白的胆固醇含量。（E） 肝总裂解物的免疫印迹分析。数据代表至少两个独立实验***第页< 0.001.
由于Idol在肝脏中不受强烈的LXR调节，我们采用了一种替代策略来测试它在该组织中的功能。我们用编码β-半乳糖苷酶或小鼠Idol的腺病毒载体感染小鼠。偶像的表达增加了血浆总胆固醇和非酯化胆固醇的水平，而甘油三酯、游离脂肪酸和葡萄糖的水平没有显著改变(和S7A）。血浆脂蛋白的分馏表明，Idol的表达引起了一种与Ldlr公司(–/–)小鼠，对照小鼠中没有出现显著的低密度脂蛋白峰值(和S7B）。在Idol转基因小鼠中，血浆apoB蛋白水平大约增加了3倍，PCSK9水平没有差异（图S7C，D）。与我们的一致在体外结果，LXR和SREBP-2靶基因的肝脏表达不受Idol表达的影响（图S7E），但LDLR蛋白水平显著降低(). 相反，《偶像》并没有改变转铁蛋白受体的水平。最后，Idol腺病毒对患者的血浆胆固醇水平（图S8A）或脂蛋白谱（图SHB）没有影响Ldlr公司(–/–)小鼠，证明Idol需要LDLR表达才能产生这些效果。
总之，我们已经证明，固醇敏感核受体LXR通过独立于SREBP的途径调节LDLR依赖的胆固醇摄取。LXR诱导Idol的表达，Idol反过来催化LDLR的泛素化，从而将其靶向降解。这些结果为早期的观察提供了一个潜在的解释，即体外表达的LDLR仍然可以由甾醇调节(31). Idol-LDLR通路的识别填补了我们对LXR如何控制胆固醇稳态的理解上的空白。LXR通过ABC转运体促进外排对过量细胞胆固醇作出反应的能力已被广泛记录(14). LXR-Idol-LDLR途径提供了一种同时限制低密度脂蛋白胆固醇摄取的机制。Idol和ABCA1由LXR以细胞类型选择性的方式协调调节，与此功能联系一致。
有趣的是，LXR-Idol通路在巨噬细胞、肾上腺和肠道等外周细胞中最为活跃。然而，与此同时，Idol在肝脏中组成性表达，培养肝细胞中Idol功能的获得或丧失调节LDLR蛋白水平并影响LDL摄取。偶像在肝脏中的强制表达体内显著降低LDLR水平，进一步表明Idol能够降解该组织中的LDLR。
LDLR降级是否需要Idol表达式体内是一个有待解决的关键问题。如果需要的话，那么可以想象Idol通路可以在药理学上被靶向，从而提高LDLR水平并提高LDL清除率。
