整合素是一类主要的细胞粘附受体，几乎存在于每一种生物中(1). 它们是专性异二聚体（α，β），其中每个亚单位由一个大的细胞外结构域、一个单通道跨膜（TM）片段和一个小的细胞质尾部（CT）组成。整合素通过其胞外结构域与细胞外基质（ECM）蛋白质相互作用，通过其CT与细胞内蛋白质相互作用。这种相互连接允许整合素调节不同的细胞粘附过程。整合素生物学中一个尚未解决的核心问题是跨细胞膜信号传递的分子基础。大量的遗传、细胞生物学和生物化学数据表明，整合素α/β跨膜细胞质域（TMCD）的构象状态控制着整合素结合细胞外配体（内-外信号）以及聚集和形成局部粘连（外-内信号）的能力（综述见参考文献。1和2). 生化和结构证据表明，α/βTMCD通过其两个TM结合(三–6)及其CT(7–9)使整合素保持静止状态。TM或CT的分离触发受体激活和信号传导(7,10–14). 然而，TM关联存在许多不同的计算模型(三–5,11,13,15–18)CT相互作用的结构分析不一致(6–9,19). 早期的研究未能观察到胶束中TMCD的异二聚体相互作用(20)，这反映了在结构上表征这种跨膜异二聚体的技术难度(21). 在这里，我们成功地确定了包含完整αIIbβ3 TMCD序列的αIIb？TMCD异二聚体的NMR结构。在我们手稿的准备过程中，Lau等人(6)报道了含有TM和CT截短部分的αIIbβ3 TM异二聚体的结构。我们的结构与Lau等人(6)在TM组件上，但在CT部分（跨膜通信信号的中心）上差异显著(1,2). 进一步的功能分析和详细的结构比较表明，协同的构象转换过程可能是触发整合素αIIbβ3激活的原因。由于TMCD在整合素中高度保守(1)，我们的分析也可能阐明整合素跨膜信号的一般机制。
结果和讨论
αIIbβ3 TMCD复合物的结构测定。
异二聚体TM配合物的结构测定因其高度动态性而具有挑战性(21). 由于核磁共振是研究弱/动态配合物的独特工具，我们决定研究αIIbβ3 TMCD配合物的核磁共振结构。一系列同位素标记和未标记的αIIb TMCD（残基E960-E类1008)和β3 TMCD（残基K689-T型762)制备了每个都包含整个TM段和CT的构建体。αIIbβ3外畴的近期晶体结构(22)在αIIb A处结束958/β3 G690因此，我们的结构基本上完成了整合素C末端部分的剩余部分。探索了多种膜模拟溶剂，包括洗涤剂胶束、双胶束和有机化合物/水混合物，以优化αIIb/β3 TMCD相互作用的检测。在所有测试条件中，CD三中国/中国2O（1:1）混合物产生了最高质量的核磁共振波谱，并证明了定点αIIb/β3 TMCD相互作用(图S1一和B类样本条件的详细描述和理由也在SI方法). 亚单位之间的相互作用位点定位于TM和膜近端CT(图S1一和B类)，证明了特定的αIIb/β3 TMCD异二聚体化，与哺乳动物细胞膜的结果一致(14). 根据化学位移变化的程度判断，这种相互作用是适度的，但与快速可逆TM信号的需要相一致(21). 获得了令人信服的分子间NOE(图S2)，进一步证明了αIIb/β3 TMCD结合的特异性，并导致αIIbβ3 TMCD-异二聚体的明确结构（详见表S1).
αIIb/β3 TMCD复合物的总体结构。
一和B类说明了αIIb/β3 TMCD复合物的整体结构。在复合物中，αIIb TMCD显示I的α螺旋特征966至N996（31个残余物）有2个纽结，一个在G周围976(C类)另一个围绕G991( B类和D类). αIIb（R）的C末端997-E类1008)如之前所观察到的，富含酸性残留物且大部分为非结构化(7,23). β3 TMCD的螺旋线更长，I693-A类737（45个残留物）(B类). TM区域的β3螺旋曲线，在H附近有一个明显的扭结722-D类723(B类). 残留物K738-D类740也表现出一些螺旋特征，但剩余的残基序列T741-T型762，除了短螺旋转弯（P745-A类750) (B类).
整合素αIIbβ3 TMCD异二聚体的结构。(一)20个能量最低的计算结构的叠加显示了界面包含区域的主链和侧链的定义。值得注意的是，αIIb R995/β3 D723侧链聚合，短距离相互指向，允许形成盐桥。(B类)αIIbβ3 TMCD异二聚体全图的两个不同视图。注意跨膜-细胞质边界处的显著扭结，这促进了细胞质卡环的形成。(C类)TMCD异二聚体界面的详细N端半。图中还显示了不在界面中但参与细胞外膜嵌入的侧链（呈青色）。(D类). 详细的C端接口的一半。侧链不是在界面上，而是与跨膜-细胞质边界处的膜锚定有关，呈青色。αIIb K带电基团的位置989和β3 K716（如果向薄膜线性延伸）表示TM-CT边界（虚线）。
详细的二聚体界面总结于 C类和D类在细胞外膜侧，界面开始与αIIb W的相互作用968β3I环693和L697(C类). αIIb W的大芳香环968位于与αIIb I疏水侧链相同的空间区域966/W公司967和β3L694-V（V）697(C类)，表明所有这些侧链都参与细胞外膜的嵌入/锚定。我们构建的细胞外碎片（αIIb 960–965和β3 689–692）表现出短环构象，并且在空间上很接近，这与晶体结构中外结构域相关C末端腿的延伸相匹配(22) (图S3). 这使得外结构域的C末端腿与细胞外膜界面附近的TM结合紧密结合(图S3). 遵循αIIb W968/β3 I693和αIIb W968/β3 L697配对是发生在TM区域其余部分的疏水相互作用的连续网络( C类和D类). 显著的相互作用涉及αIIb G的主干972/G公司976β3 V700，男701、和我704β3 G708的侧链和主链与αIIb L的侧链979和L980分别为( C类和D类). αIIb G处的甘氨酸972/G公司976和β3 G708允许在TM的N端半部分进行紧密的螺旋间填充，并以大约30°的角度交叉αIIb和β3 TMCD螺旋(B类). 相反，C端半部分的TM填料主要充满了广泛的侧链-侧链相互作用(D类).
在TM-CT边界，αIIb K带正电基团的空间位置989/β3 K716(D类)表明它们开始于细胞质区域。然而，膜近端残基αIIb V后的侧链可能990-F类993，β3 L717-我721插入或固定在膜上(D类)这可能会稳定TM螺旋的相对方向。这些残基的插入程度可能因受体的功能/激活状态而异(6,23–25). 与细胞质αIIb/β3复合物的先前结构特征一致(7)，TMCD复合物还显示出αIIb R995/β3 D723盐桥(D类). 我们计算的大多数结构都表明了这一盐桥，即αIIb R995和β3 D723互相指向对方(一). 功能研究表明，这种盐桥在维持受体处于静息状态方面发挥着重要作用(14,26). 因此，它的存在有力地证明了我们结构的生理相关性。总的来说，αIIb KVGFFKR和β3 KLLITIHD之间的空间接触与整合素中保守的膜近端卡环相一致(7,9,23).
TM接口的线圈功能。
TM界面中缠绕的螺旋填料具有明显的右手螺旋构象(B类). 仔细检查交互界面(一)揭示了一种可以被描述为11-残基hendecad重复序列的超螺旋，它是典型的7-残基七肽重复序列卷曲线圈的变体(27). 在这种重复中，有两个不同的位置类别(B类). 在索引位置一/小时，界面残余物的侧链指向螺旋轴之间的“旋钮”。在索引位置判定元件，界面残留物的侧链朝向外围形成空穴-“孔”一/小时-索引位置可能导致分子间冲突，这些位置的残基通常采用“旋钮-孔”结构，在这种结构中，它们与判定元件指数。在αIIbβ3 TM螺旋线圈中观察到这种“旋钮到孔”的填充，特别是在存在广泛疏水相互作用的中心区域（C类).
αIIb/β3 TM接口的盘绕线圈特征。(一)两个螺旋每转一圈的横截面，相互作用残基的侧链显示为杆。蓝色螺旋为β3亚单位，红色螺旋为αIIb亚单位。(B类)具有11个残基hendecad重复序列（索引）的右手螺旋线圈的螺旋轮投影一∼k个). (C类)αIIb/β3跨膜结构域序列。残留物占据一/小时索引为黄色判定元件指数为绿色。带下划线的区域显示了最强烈的分子间相互作用，并代表了经典的hendecad重复。带括号指数的残数在hendecad重复扩展中的位置略有偏移。
详细的螺旋间相互作用如下：在中心区域，G972在αIIb中占据小时-相对于V的分度位置700-M（M）701β3作为指数判定元件; G公司976和我704索引为一和小时分别在αIIb和β3中，并形成“旋钮到旋钮”的相互作用；和L979-L（左）980inαIIb驻留在判定元件-分度位置以适应残差G708-的位置一β3中。hendecad重复序列持续延伸到TM域的N端和C端。然而，残留物的位置假设一/小时延伸区域的指数在观测结构中略有偏移( 一和C类)可能是因为附近有庞大的色氨酸侧链。例如，M987inαIIb保持一位置和朝向预期的螺旋轴。然而，相应的β3残基W715带索引小时指向侧面，而不是像典型的hendecad重复序列那样指向螺旋间轴。色氨酸中庞大的吲哚基团可能需要这样的位置转移，以避免该区域可能出现的空间位阻。类似的安排可能适用于一/小时-索引L697β3和L中983单位为αIIb。这种线圈不规则性在蛋白质中很常见，通常提供对功能很重要的结构灵活性(28,29). 盘绕-线圈界面在整合素中高度保守(图S4)这可能是受体杂合物的一般特征。
TMCD界面与整合素突变数据和其他功能数据的相关性。
αIIbβ3 TMCD二聚体结构为解释先前报道的点突变对整合素激活的影响提供了模板。表S2列出了所有TMCD点突变及其功能后果。值得注意的是，在紧密排列的螺旋交叉区域αIIb G中显著增加残基大小的突变972L、 克976五十、 和β3 G708L/I应在界面上发生空间冲突，这些突变一致导致整合素显著活化。其他核心界面突变，包括αIIb L980A、 L（左）983A、 R（右）995A/D，β3 I704A、 我719A/M和D723A/H和疾病突变αIIb R995Q和β3 D723H也会破坏异二聚体并激活整合素(表S2). 与我们的结构一致，许多非界面突变，如αIIb G975L和β3 S699L对整合素的激活几乎没有影响。一些界面边缘（例如β3 A703五十） 或保守突变（例如β3 M701五十） 可能是由于有限的结构扰动或微小的界面调整，没有显著激活受体(表S2).
在解释TM-CT边界和其他CT区域的突变数据时需要格外小心。这些区域的突变可能会产生多种后果，如异二聚体的破坏、TM膜嵌入的改变或与潜在细胞质调节剂的结合。例如，αIIb F992A或F993发现一个突变激活αIIbβ3(26). 根据我们的结构，F992A可能部分损害卡环结构，而F992A和F993A可能损害αIIb TM的膜锚定。然而，F992A和F993A也被证明会削弱αIIb与CIB1的结合(30)-αIIbβ3活化的负调节因子(31). 因此，F/A突变可能通过这些效应的组合特异性激活αIIbβ3。相反，GFFKR保守基序中的FF/AA突变对另一整合素αVβ3的激活几乎没有影响(32). 这些数据表明，TM-CT边界对整合素的激活有不同的调节，这可能是由于该区域的构象复杂性。另一个与TMCD界面破坏无关的例子是β3 CT膜远端的突变749发现一个突变激活αIIbβ3(33)而S752P突变抑制受体活化。这些不能用TMCD界面破坏来解释，可能是由于β3远端CT膜锚定的改变(23)或对监管机构具有约束力。
为了进一步了解TMCD界面扰动和整合素激活，我们通过CT卡环和TM核心界面的突变来检测αIIbβ3激活的程度(一)αIIb R995D和(b条)β3 I704A.虽然这些突变之前已经被证明激活了受体(11,14,34)，没有考虑对它们的个体效应及其组合进行系统的定量比较。一表明αIIb R995D适度激活受体和β3 I704A的作用较弱。值得注意的是，这两个突变的结合产生了强大的协同效应，显著增强了整合素的活化(一). 同样，另一个TM核心界面突变β3 G708N弱激活受体，但与αIIb R结合995D具有协同作用(一). 核磁共振结合实验证明αIIb R995D大大减少了TMCD关联(B类)及其与β3I的结合704A取消了互动(C类)证明TM和CT必须解离才能触发有效的整合素激活。解离可能由多种因素介导，其中之一涉及塔利班(7,10,14,35,36).表示β3（H）的叠加722-A类737)绑定到塔林(35)αIIbβ3 TMCD复合物中的含量。它提供了塔利班如何在CT界面周围引起空间碰撞和电荷斥力，从而促进TMCD分离的观点。
CT和TM突变对整合素激活的结构和功能影响。(一)野生型α活化的定量比较IIb类β三与含有αIIb R的突变体995D、 β3 I704A、 β3 G708N、 和双突变αIIb R995D/β3 I704A和αIIb R995D/β3克708N.活化程度由FACS测量的PAC1（活化特异性单克隆抗体）与2G12（αIIbβ3反应性单抗）结合的比率确定。WT的这个比率被赋值为1，并且将每个突变体的激活状态与WT进行比较(34). 给出的结果是3个独立实验的平均值±SD。**，P（P）<0.01（与单一突变相比）t吨测试。(B类)2D的代表区域1H（H）-150.1 mM的N个HSQC光谱15在不存在（黑色）和存在0.3 mM WTαIIb TMCD（红色）和0.3 mMαIIb R的情况下，N-标记的β3 TMCD995D突变体（绿色）表明，根据显著减少的化学位移变化判断，该突变显著削弱了αIIb/β3 TMCD关联。(C类)2D的代表区域1H（H）-150.1 mM的N HSQC光谱15N标记的β3 TMCD I704A在无（黑色）和存在0.4 mMαIIb R时995D（红色）表明，突变降低了αIIb/β3 TMCD的相关性，因为几乎没有发生化学位移变化。
塔林通过空间碰撞和电荷排斥破坏CT卡环。β3膜近端区域（与talin F3，PDB ID结合2小时7秒)（H）722-A类737) (35)与αIIbβ3异二聚体中的相同片段重叠，显示了talin F3 K322/K324如何直接干扰αIIb K994/R995。
与其他整合素TM或CT结构的比较。
如引言中所述，当我们的手稿正在准备中时，报告了在双子叶植物中测定的αIIb/β3TM络合物的核磁共振结构(6). 与包含完整αIIb/β3 TM和CT序列的结构相比，Lau等人(6)缺少大部分CT部分（αIIb在P处截断998和β3在F处截断727). TM部分的比较（αIIb L966-周988/β3 I693-W公司715)揭示出这两种结构非常相似，主干的rmsd约为2.0Å(图S5)，表示两张CD三中国/中国2O混合物和双电池为TM复杂组件提供了兼容的环境。人们提出了许多不同的整合素TM复合物计算模型(三–5,11,13,15–18)，但最近的两个(17,18)发现与Lau等人的结构相似。（参考。6; 参考文献中进行了详细讨论。18). 因此，使用不同方法的最新独立研究（包括我们的研究）对整合素TM组装有一个普遍的一致性。
在细胞质区，αIIb989KVGFFKR在我们的结构中显示出螺旋构象，其中αIIb990VGF弱接触β3 I719和αIIb R995与β3 D形成盐桥723相反，Lau等人(6)，螺旋线在αIIb V处结束990接着是一次不寻常的左转(图S5)导致αIIb F的膜插入和紧密填充992/F类993带αIIb TM M的芳香环987和β3 TM L712/我719(6). 使用计算建模程序，memble-Rosetta，Zhu等人(17)还预测了αIIb-GFF区域的反转构象。为了进一步检查这一点，我们使用了Rosetta的一个强大的修改，CS-Rosetta(37)，其中包括来自CD的指定主干化学位移三中国/中国2O培养基作为实验约束条件，以便根据已知的蛋白质结构数据库更好地预测蛋白质结构。CS-Rosetta预测了大多数最低能量构象的GFF反转(图S6)只有少数低能构象具有GFF螺旋构象(图S6). 这一预测与我们仅检测到后者的核磁共振数据不一致，没有观察到定义反转和反转介导卡环构象的NOE。然而，CS-Rosetta数据和双子座中GFF反转的检测(6)这表明两种构象都可能存在，其中一种构象可能占主导地位，这取决于细胞环境。在这方面，我们注意到αIIb F之间的亚单位间NOE992/F类993芳香环和β3L712/我719侧链，例如I719CδH3（参见参考文件中的图S4。6)，这是基于反向旋转介导卡环构造(6)，表明这种构象是高度动态或瞬态的。由于TM填充在2个NMR结构之间非常相似(图S5)，不同的CT扣(图S5)涉及αIIb KVGFF反向转弯或螺旋线的情况不能是由于缺乏Zhu等人所述的TM(17). 相反，不同的溶剂系统（CD三中国/中国2O vs.bicelles）在这两项研究中可能捕捉到了一个内在灵活区域的两种不同构象状态。CD中确定的CT卡环的总体拓扑三中国/中国2发现O与水溶液中测定的O相似(图S5) (7)这表明该卡环代表了水样细胞质中的天然构象。这种暴露于细胞质的卡环在生理上很重要，因为它可以接触细胞质结合蛋白，如CIB1(30)和丝胺(38)两者都对整合素的激活起负调节作用(31,39,40). Lau等人中的膜嵌式卡环(6)这些细胞质蛋白显然无法进入，因此我们认为它可能代表整合素激活期间从细胞质蛋白分离后的中间状态。
整合素内外跨膜信号转导机制。
我们已经确定了包含完整TM和CT序列的整合素αIIbβ3 TMCD异二聚体的结构。多种证据表明，我们的结构与生理相关，并对整合素激活的机制提供了重要的见解：(我)TM区域与广泛的突变数据密切相关(表S2); (ii（ii）)CT区域与之前确定的水溶液中的CT卡环相似(7)并显示功能重要的αIIb R995/β3 D723盐桥；(三)CT区与talin/β3复合物的叠加(35)显示了塔利班如何立体破坏涉及盐桥的CT卡环()，这解释了之前的竞争数据(7,23)和功能分析(10,14); (iv（四）)基于我们的结构的双TM/CT突变(一)与我们的核磁共振结合数据关联良好( B类和C类)证明TM和CT都必须解离才能激活整合素(5,6,14).
在我们的研究中，一个特别出乎意料的发现是，我们结构中的CT卡环与Lau等人的卡环大不相同(6) (图S5). 如上所述，这种差异可能与整合素内外信号的调控途径有关。我们认为，这一途径不是先前提出的简单的CT松解/TM解离过程(6). 相反，它涉及一个高度合作的过程，包含多个能量驱动的构象转换步骤，如在受体的静息状态下（步骤1），含有αIIb KVGFF螺旋的卡环暴露在细胞质中，并可接触/结合细胞溶质调节剂。第二步是一个中间状态，但仍处于静止状态，负调控因子被细胞触发物赶走。步骤3是另一个中间状态，其中夹子包括αIIb KVGFF和β3 KLLITI嵌入膜中。这一步伴随着GFF螺旋到反转的转变和TM螺旋嵌入/倾斜的改变。在这一步骤中，膜远端的β3 CT也可能发生结构转变，例如从与丝胺结合的β链(39)固定在膜表面的α-螺旋(23). 在最后的步骤4中，talin在激活时暴露其F3域(36)，驱动TM线圈线圈复合体的CT松开和随后的放卷。这些步骤是快速的、高度协作的，并最终导致有效的受体激活。
整合素内-外TM信号传导模型。(一). 步骤1：膜近端卡环与一个抑制剂（红色椭圆阴影）结合，该抑制剂将整合素维持在静息状态。(B类). 步骤2：细胞信号将抑制剂从卡环中分离出来，导致整合素TMCD异二聚体的中间状态。(C类). 步骤3：释放抑制剂插入物或锚定在膜上时，细胞质暴露出疏水残基（以青色表示），导致卡环的改变和膜嵌入（以青紫表示）。(D类). 步骤4：整合素调节因子，如talin（绿色），进一步干扰卡环，导致卡环解离，随后TM卷曲线圈展开。我们注意到，在步骤1中，talin也可能与抑制剂竞争，以使其与卡环结合，但其他调节器，如migfilin(40)可以协同作用，更有效地促进抑制剂的释放。
TM线圈解卷效应如何与整合素外结构域的膜旁区域耦合？以前的EM和蛋白质工程实验(41)表明在整合素结扎过程中，整合素外结构域的C末端腿分开。由于外结构域的C末端腿通过短的空间闭合环与TM界面的结构相连(图S3)，我们现在可以在原子水平上理解C末端分支分离是如何受到TM关联的紧密约束的。很明显，TM线圈的解绕释放了对外结构域的约束，允许配体诱导的构象变化发生，包括C末端腿的分离。TM线圈的解卷可以进一步驱动胞外域细胞外腿的脱离，这一过程可能与配体结合同步发生。
实验程序
整合素αIIb/β3跨膜细胞质（TMCD）结构域的表达和纯化。
人整合素αIIb TMCD残基E的表达与纯化960-E类1008和R995D突变体和β3 TMCD残基K689-T型762和I704A突变体SI方法.
核磁共振样品制备、光谱和结构计算。
使用0.1 mM进行初始样品条件筛选15N标记的αIIb TMCD和0.2 mM未标记的β3 TMCD，反之亦然。我们努力探索高分辨率核磁共振研究的合适样品条件（参见SI方法); 50%/50%CD三库存/小时2O给出了极好的核磁共振谱，并允许对2个亚基之间的特定相互作用进行详细的结构表征(图S1).
在50%/50%CD中制备了四组核磁共振样品用于三重共振核磁共振实验三中国大陆：H2操作：(一)0.2毫米15N个/13在不存在和存在0.6 mM未标记的β3 TMCD的情况下，C标记的αIIb TMCD；(b条)0.2毫米15N个/13在0.6 mM未标记αIIb TMCD存在和不存在的情况下，C标记的β3 TMCD；(c（c）)0.4米15N/100%2存在和不存在1.2 mM未标记β3 TMCD时，H标记的αIIb TMCD；(d日)0.4米15N/100%2在不存在和存在1.2 mM未标记αIIb TMCD的情况下，使用H标记的β3 TMCD。详细的核磁共振实验和结构测定程序见SI方法.
定点突变、转染和整合素激活试验。
将人αIIb和β3的cDNA克隆到哺乳动物表达载体pcDNA3.1（Invitrogen）中。将包含αIIb和β3胞质尾部的3′核苷酸序列亚克隆到pBluescript II SK（+）载体中。使用QuikChange定点突变试剂盒（Stratagene）将取代物引入αIIb和β3。所有突变体的核苷酸序列均得到确认。使用脂质体将αIIb和β3 cDNA的不同组合共转染到CHO-K1细胞TM（TM）2000（Invitrogen）。在进一步分析之前，将转染细胞培养至少24小时。使用PAC1（αIIbβ3活性构象的特异性单克隆抗体）测量αIIb？3的活化，如参考文献所述。34.
