过度表达的亲环素B抑制与活性氧和钙相关的细胞凋亡²⁺内质网应激后的体内平衡

亲环素B启动子中新的内质网应激反应元件

转录诱导促使我们在CypB启动子上寻找内质网应激反应元件；发现了两个推测的ERSE(图2A). 为了绘制顺式作用元件，将序列缺失的启动子区域融合到荧光素酶基因上，将合成的报告质粒瞬时导入H9C2细胞，并通过ER胁迫下荧光素酶活性监测CypB启动子的活性。Tg和Tm处理后，在含有全长CypB上游元件的构建物中观察到荧光素酶报告活性增加了三倍以上。缺失分析表明，位于−400 bp和−1000 bp之间的区域对于诱导来说是不必要的，但位于−200 bp和−400 bp之间的区域对诱导至关重要，如图2B该区域的DNA序列含有与ERSE一致序列（CCAAT-N9-CCACG，ERSE-I）类似的顺式作用元件。为了进一步验证这一点，我们使用pCypB/400荧光素酶报告质粒和一个来自CypB启动子的推测ERSE进行了诱变研究。在CypB的类共识序列中，CCACG元素的方向是颠倒的，CCAAT和CCACG之间的间隔序列是13个碱基，而不是共识的9个碱基(图2A). 每个元件内的核苷酸替换证明这两个元件对CypB启动子的内质网应激诱导至关重要(图2C). 事实上，据报道，转录因子NF-Y和ATF6分别同时与ERSE的CCAAT和CCACG部分结合(吉田等人，2001年). 总之，我们得出结论，在CypB启动子中发现的新ERSE作为内质网应激诱导CypB所需的顺式作用元件发挥作用，尽管该ERSE的转录活性略弱于ERSE一致序列ERSE-I的转录活性(图2C，第7行）。

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图2

亲环素B的启动子分析（A）使用Genomatix MatInspector程序对CypB启动子进行序列分析。CypB启动子的两个假定ERSE元件下划线。（B） CypB启动子荧光素酶报告分析。细胞在增殖条件下与1µM Tg或10µg/ml Tm孵育24小时。对照组为未经Tg或Tm处理的细胞。数据表示为五个独立实验的平均值±标准差。§P（P）<0.05与未经处理的pGL3碱性*P（P）与未经治疗的pCypB/400相比，<0.05；^#P（P）与未经处理的pCypB/400相比，<0.05。（C） ERSE共识样序列的突变分析。使用包含ERSE突变启动子的基于pCypB/400的荧光素酶报告子构建物进行荧光素素酶分析。1，pGL3基本向量；2，pCypB/400；3、CCAAg突变体构建；4、aaccT突变体构建；5、CtTGG突变体构建；6，aGTGG突变体构建；7，pCypB/400包含ERSE共识序列。数据表示为从五个独立实验中获得的平均值±标准差*P（P）与Tg治疗的pCypB/400相比<0.05；^#P（P）与Tm治疗的pCypB/400相比，<0.05。（D） 通过ATF6或XBP1激活CypB启动子。用pCypB/400和以下结构之一进行荧光素酶分析：pcDNA、非活性ATF6、活性ATF5、未分裂XBP1、拼接XBP1或ATF6-siRNA。数据表示为从五个独立实验获得的平均值±s.d*P（P）与非活性ATF6转染相比，<0.05；^#P（P）<0.05与未切割XBP1转染相比**P（P）与活性ATF6转染相比，<0.05。pcDNA作为阴性对照。所有荧光素酶数据均以相对于pCypB/400（B–d）基础活性的平均值±标准差显示。（E） CypB-ERSE基序的EMSA和超移位EMSA。将H9C2细胞的核提取物暴露于Tm 24小时或不暴露，在预孵育后用CypB-ERSE探针或突变探针（CGTtt）孵育，不含抗体或ATF6特异性抗血清。（F） 使用ATF6、XBP1或NF-Y抗体以及暴露于Tg或Tm 24小时或未暴露的H9C2细胞提取物进行ChIP分析。输入，样品代表总输入染色质的1:100稀释放大。IgG：免疫前血清。（G） 使用核提取物用抗ATF6、NF-Y或层粘连蛋白B的抗体进行蛋白质印迹。当暴露于Tg和Tm时，活性ATF6增加，而NF-Y保持不变。拉明B被用作核提取物的负荷控制。

接下来，我们使用改进的荧光素酶报告分析和EMSA，通过新的CypB ERSE研究了ER应激相关转录因子ATF6和XBP1与CypB启动子的结合。将ATF6基因的组成型活性形式或XBP1基因的剪接形式与荧光素酶报告质粒pCypB/400一起转染，以确定活性ATF6或剪接XBP1蛋白单独是否足以诱导荧光素酶报告基因。与活性ATF6或拼接XBP1共转染可使荧光素酶活性增加约两倍。通过western blot分析（数据未显示）评估siRNA治疗的疗效后，用非活性ATF6或未片段化XBP1转染或用ATF6-siRNA治疗沉默ATF6均不能增加荧光素酶活性(图2D).

立即跟踪EMSA以测量ATF6或XBP1与CypB ERSE序列的直接结合。从H9C2细胞中制备核提取物，用Tm处理或不处理，然后用EMSA处理，使用³²P标记的CypB-ERSE寡核苷酸探针或突变型（CGTtt）。野生型与经Tm处理的核提取物形成了两个复合物：下部带可能与NF-Y蛋白形成复合物，上部带与NF-Y+ATF6形成复合物。带有抗ATF6抗体的超移EMSA清楚地显示ATF6与CypB-ERSE的结合活性(图2E). 相比之下，突变版本仅与NF-Y和ATF6最低程度地复合，这表明CypB启动子的新型ERSE具有特异性。通过孵育100倍的未标记竞争物寡核苷酸，这些结合被消除。此外，ChIP分析也表明CypB-ERSE很容易与ATF6和NF-Y结合，但与XBP1无关(图2F). Western blot分析还表明，在对照细胞中几乎检测不到活性ATF6，但在内质网应激时升高，而NF-Y保持不变(图2G).

亲环素B过度表达抑制thapsigargin或突尼斯霉素诱导的细胞死亡

为了确定CypB在内质网应激反应中的保护作用，我们在H9C2细胞中过度表达了myc标记的CypB/wt或myc标记CypB/R62A，后者在PPIase活性方面存在缺陷。在建立CypB/wt和CypB/R62A稳定转染体后，通过免疫印迹分析CypB和其他内质网应激反应蛋白（如Bip和Grp94）的表达水平(图3A). 在我们用于研究的三个单独克隆中，过度表达的CypB似乎没有干扰其他内质网应激蛋白Bip和Grp94的表达水平。

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图3

亲环素B的过度表达可减轻内质网应激诱导的细胞死亡。（A） 通过western blotting分析所示转染体中CypB/wt或CypB/R62A的表达水平。对每个病例中的三个不同克隆进行分析，以排除克隆特异性的可能性。CypB被标记为myc。检测Bip和Grp94等ER伴侣蛋白作为参考，以监测CypB过度表达对其他ER伴侣蛋白的影响。肌动蛋白被用作加载控制。（B） 过度表达CypB的定位。在增殖状态下用Tg或Tm处理24小时后，通过显微镜检查GFP-CypB/wt或GFP-CypB/R62A在细胞中的定位。ER跟踪器用于识别ER。上部面板仅显示GFP的定位。中间面板显示GFP-CypB/wt的位置，而下部面板显示GFP-CypB/R62A的位置。ER跟踪器，蓝色；GFP，绿色。棒材，20µm。（C） MTT法测定增殖（PM）或分化（DM）条件下CypB/wt过度表达对内质网应激诱导的细胞死亡的抑制作用。注意，CypB/R62A过度表达进一步降低了细胞活力。数据表示为从五个独立实验中获得的平均值±标准差*P（P）与Tg处理的pcDNA转染细胞相比，<0.05；^#P（P）在PM和DM中分别与Tm处理的pcDNA转染细胞相比<0.05。（D） 凋亡标记抗体的Western blot：caspase 3（裂解形式），细胞色素c（c）（细胞溶质）、蛋白酶12和Bax（线粒体）。每个频带下的数字代表至少五个不同的实验，并表示为平均值±标准差*P（P）与Tg处理的pcDNA相比<0.05。（E） CypB/wt和CypB/R62A转染剂中ER驻留蛋白诱导的变化。用western blot分析细胞总提取物中的Bip、Grp94和PDI。每个频带下的数字代表至少五个不同的实验，并表示为平均值±标准差*P（P）与经Tg处理的pcDNA相比，<0.05。（F） CypB的防御作用不仅限于细胞类型。Chang和DU145细胞未感染腺病毒、Ad-GFP、Ad-CypB/wt或Ad-CypB/R62A。western blotting检测CypB的表达水平。通过GFP阳性监测其转导频率（约60%）。每个频带下的数字代表至少五个不同的实验，并表示为平均值±标准差*P（P）与未感染Chang和DU145细胞相比，分别<0.05。采用MTT法测定ER应激后各感染者的存活率。绿色荧光蛋白腺病毒；Ad-CypB/wt，CypB腺病毒；Ad-CypB/R62A、CypB/R62 A腺病毒。数据表示从五个独立实验中获得的平均值±标准差*P（P）与Tg处理的非感染细胞相比，<0.05#P（P）与Tm治疗的未感染Chang和DU145细胞相比，<0.05。

接下来，通过共聚焦显微镜分析监测过度表达的CypB/wt和CypB/R62A的位置，以排除过度表达伪影，并确定CypB/w和CypB/R62A转染剂是否正确靶向ER。使用ER跟踪器定位细胞中的ER。图3B显示过度表达的CypB/wt或CypB/R62A与ER跟踪器共定位，因此表明过度表达的PypB/wt和CypB/R62A正确对准ER，不会产生伪影。即使细胞受到Tg和Tm处理，过表达蛋白的位置保持不变(图3B). 因此，我们得出结论，过度表达的CypB/wt主要位于内质网，尽管我们目前无法排除CypB的一小部分可能分布在其他地方的可能性。

采用MTT转化法和western blot分析凋亡分子包括裂解caspase 3、细胞溶质细胞色素c（c）、蛋白酶12和线粒体Bax。与仅pcDNA相比，CypB/wt-过表达细胞对Tg-和Tm-诱导的凋亡具有更高的抵抗力，CypB/R62A转染细胞更敏感(图3C、D). 这种从PPIase缺陷突变中获得的敏感性表明，PPLase活性可能参与保护作用。在内质网应激提高Bip、Grp94和PDI等靶分子表达的前提下，它们在CypB/wt过度表达细胞中的减少表明CypB/wt对内质网胁迫脱敏细胞的过度表达；然而，相比之下，CypB/R62A的过度表达使它们敏化，如图3ECypB过度表达通过其PPIase活性缓解内质网应激，表明CypB对内质网胁迫诱导的细胞死亡具有抗凋亡作用。此外，已知CypB由细胞分泌。为了测试分泌型CypB的作用，我们从培养基中进行了CypB免疫沉淀(补充材料图S1A)和使用CypB抗体中和抗体(补充材料图S1B). 结果表明，在仅转染pcDNA、CypB/wt或CypB/R62A的细胞中，分泌的CypB不影响内质网应激诱导的细胞死亡。

接下来，我们评估了过表达CypB/wt对Chang细胞和DU145前列腺癌细胞ER应激的抗凋亡作用，以排除细胞特异性。首先，构建单独表达GFP的腺病毒CypB/wt或CypB/R62A，并用于Chang和DU145细胞的转导(图3F). 免疫印迹分析显示外源性CypB/wt或CypB/R62A的表达水平与内源性CypB相似。在内质网应激条件下，与非感染细胞或Ad-GFP感染者相比，CypB/wt感染者在这两种细胞类型中的细胞死亡减少(图3F). 相比之下，CypB/R62A感染者的细胞死亡显著增加。总之，这些结果表明，过度表达的CypB/wt通过PPIase活性抑制内质网应激诱导的凋亡的能力并不局限于H9C2细胞。

亲环素B过度表达抑制钙²⁺内质网渗漏、活性氧生成和线粒体膜电位去极化

钙²⁺在ER中被报道在细胞凋亡中起重要作用(Mattson和Chan，2003年;Benali-Furet等人，2005年). 因此，我们评估了过度表达的CypB/wt或CypB/R62A对ER-Ca的影响²⁺平衡。在任一钙中培养后²⁺-包含(图4A)或Ca²⁺-游离介质(图4B)，细胞接种Tg。游离Ca²⁺按照材料和方法中的描述进行可视化。在两个加州²⁺-含钙²⁺-自由介质，Ca少得多²⁺与pcDNA或CypB/R62A转染细胞相比，Tg处理后释放到CypB/wt转染剂中的细胞液中。有趣的是，CypB/R62A的过度表达导致了更大的Ca²⁺与pcDNA转染细胞中观察到的ER释放相比。这些观察结果表明，过度表达的CypB/wt减轻，而过度表达的CypB/R62A加重，Ca²⁺ER应力期间ER泄漏。

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图4

过度表达的亲环素B抑制钙²⁺因内质网应激而从内质网中释放。胞浆钙的相对变化²⁺所示转染剂中的水平(n个=20）显示在左侧面板中，并在右侧面板中绘制。（A） 绿色代表细胞内钙²⁺。红色箭头（左侧面板）和虚线（右侧面板）。（B） 每个转染体用4 mM EGTA处理以减少细胞外背景钙²⁺在用1µM Tg处理之前。在A和B中，红色箭头（左图）和虚线（右图）表示Tg处理点。在B中，蓝色箭头（左侧面板）和虚线（右侧面板）表示EGTA治疗点。

长时间内质网应激下未折叠蛋白反应（UPR）产生的活性氧（ROS）积累导致细胞死亡(Haynes等人，2004年;Xue等人，2005年). 我们使用DCF-DA测定ROS水平(图5A)，通过荧光测量DCF氧化来检测细胞内ROS。将DCF-DA加载到pcDNA转染细胞上表明，在Tg存在下，ROS积累。Tg内质网应激积累的ROS被CypB/wt的过度表达或过氧化氢酶处理减弱。相比之下，在使用相同Tg浓度的CypB/R62A转染剂中观察到大量ROS，表明CypB通过PPIase活性至少部分缓解了ROS生成。

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图5

嗜环蛋白B过度表达抑制ROS生成、线粒体膜损伤和染色体DNA断裂，以应对内质网应激。（A） 活性氧测量及其定量分析。虚线表示细胞中ROS的基本水平。数值为从五个独立实验中获得的平均值±标准差。（B） 基质金属蛋白酶测定及其定量分析。箭头表示线粒体受损的细胞。M1和M2分别是线粒体受损和未受损的细胞。（C） MTT法测定细胞活力。Con，未经处理；Tg，1µM Tg处理；Tg+过氧化氢酶，在Tg处理前用2000 U/ml过氧化氢酶预处理。数据是从五个独立实验中获得的平均值±标准差*P（P）与Tg处理的pcDNA相比<0.05；^#P（P）与Tg治疗的CypB/R62A相比，<0.05。（D） TUNEL分析及其定量。顶部面板中的绿色箭头表示TUNEL阳性细胞。数据表示为从五个独立实验中获得的平均值±标准差*P（P）与Tg处理的pcDNA相比<0.05；^#P（P）与CypB/R62A的Tg治疗相比，<0.05。

线粒体膜电位（MMP），与内质网应激诱导的细胞死亡相关(Chae等人，2004年)暴露于Tg 24小时后，pcDNA转染细胞中的(图5B). 从M2区测得的Tg对MMP的减少在CypB/wt或过氧化氢酶处理中几乎完全被抑制，但在CypB/R62A转染剂中加剧。MTT测定的细胞存活率(图5C)TUNEL分析检测到DNA片段(图5D)与ROS和MMP测量结果一致。总之，这些结果强烈表明，CypB/wt过度表达通过抑制Ca²⁺ER的耗竭以及减少ROS的产生和线粒体损伤。

亲环素B缺陷细胞对内质网应激诱导凋亡的敏感性增加

为了更详细地评估CypB在内质网应激反应中的生理作用，我们使用小干扰RNA（siRNA）进行了RNA干扰实验，以击倒CypB。当通过western blot分析进行评估时，CypB的表达几乎被特异性siRNA干扰完全抑制，并且未观察到CypB-siRNA对其他蛋白质（如Grp94和Bip）表达的影响(图6A). MTT法、western印迹分析和TUNEL法表明，CypB敲低导致ER应激诱导的细胞凋亡显著增加(图6B、C). 与未经处理或对照siRNA-转染细胞相比，我们还检测到Tg和Tm处理的CypB敲除细胞中ROS水平较高，MMPs较低（数据未显示）。当添加通用caspase抑制剂z-VAD-fmk以抑制凋亡时，内质网应激诱导的凋亡在CypB敲除条件下部分被挽救，从而表明CypB介导的内质网逆境保护可能部分依赖于caspase(图6D).

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图6

亲环素B的siRNA敲除增强内质网应激诱导的细胞死亡。（A） 通过western blotting测定CypB-siRNA的敲除效率。检测Grp94、Bip和PDI等ER伴侣蛋白，作为监测CypB-siRNA对其他ER伴侣蛋白影响的参考。（B） MTT检测。基于con-siRNA转染的细胞活力，显示了每个细胞系的相对细胞活力。数据是从五个独立实验中获得的平均值±标准差*P（P）与Tg处理的con-siRNA相比<0.05；^#P（P）与经Tm处理的con-siRNA相比，<0.05。（C）用凋亡标记抗体进行免疫印迹：caspase 3（裂解形式）和Bax。在con-siRNA和CypB-siRNA转染Tg治疗24小时后进行TUNEL分析。绿色箭头表示TUNEL阳性细胞。每个频带下的数字代表至少五个不同的实验，并表示为平均值±标准差*P（P）与Tg处理的con-siRNA转染相比，<0.05。（D） CypB的防御作用部分依赖于半胱天冬酶。在Tg治疗之前，用50µM z-VAD-fmk培养PcDNA-、CypB/wt-和CypB-siRNA-转染细胞。用MTT法测定活细胞的百分比。数据表示为从五个独立实验中获得的平均值±标准差*P（P）与经Tm处理的pcDNA转染剂相比，<0.05；^#P（P）与经Tm处理的CypB-siRNA转染剂相比，<0.05。

逆转录聚合酶链反应

H9C2细胞与放线菌素D（2µM）和Tg（1μM）或Tm（10µg/ml）共同处理48小时。对于RT-PCR，根据制造商的方案，使用TRIzol试剂分离总RNA（2µg）。用逆转录酶合成cDNA。进行了32个周期的PCR。CypB转录物扩增引物如下：；正向，5′-GCATGAAGGTG CCCC-C-TCTTCGCC-3′；背面为5′-GCCTCTTGGCAATGGCAAAGG-3′。用引物（5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′和5′-GAGA-TGTGATGGTTC-3′）扩增GAPDH，作为RT-PCR的内部对照。

质粒

使用正向引物5′-GC，通过RT-PCR从总RNA制备物中扩增野生型大鼠CypB基因（CypB/wt）AAGCTT公司ATGAAGGT GCCC-CCCTCTTCGCC-3′(后面的三） 和反向引物5′-GCGGATCC公司CTCCTT-GGCAATGGCAAAGG-3′(巴姆HI）。利用以下引物将精氨酸残基（R62）突变为丙氨酸（A），制备PPIase缺陷突变基因（CypB/R62A）：5′-AAGTTCCAT全球气候变化GTCATCAAGGAC-3′和5′-GTCCTTGAC自动增益控制ATGGAACTT-3′。然后将PCR产物插入到pcDNA 3.0哺乳动物表达载体（Invitrogen）中，以生成pcDNA/CypB/wt或pcDNA/CypB/R62A。CypB/wt或CypB/R62A在C末端用myc标记表达。对于荧光素酶分析，通过PCR将1000 bp的CypB启动子序列连续删除200 bp。然后将删除的片段克隆到pGL3基本载体（Promega）中千磅我和Xho公司I.CypB启动子上假定的NF-Y或ATF6结合位点通过基于PCR-的定点突变突变。利用含有CypB/wt或CypB/R62A cDNA的pEGFP NI（Clontech）在细胞中定位CypB/w或CypB/R62A。对于GST下拉实验，通过基于PCR的克隆构建了含有CypB/wt或CypB/R62A的pGEX-KG（GE Healthcare）。对于酵母双杂交实验，将CypB或CypB/R62A克隆到生态RI和巴姆pGBKT7.0（Clontech）的HI限制位点。使用适当的酶将Bip或Grp94克隆到pGADT7.0（Clontech）中。荧光素酶分析中使用了ATF6非活性形式、ATF6活性形式、XBP1非片段形式和XBP1剪接形式质粒(Lee等人，2002年).

蛋白质印迹

抗CypB、Bip、Bax、细胞色素c、Grp94、PDI、caspase 3、procaspase 12、actin、β-微管蛋白和myc的抗体来自Abcam、Santa Cruz Biotechnology和StressGen Biotechtologies。除非另有规定，否则应对肌动蛋白进行免疫印迹，以标准化样品蛋白质的数量。

启动子分析和荧光素酶分析

使用Genomatrix MatInspector分析CypB启动子序列(网址：http://www.genomatix.de). 一个ERSE候选基因位于−243 bp，距离CypB ORF约−225 bp，另一个位于−693bp，约−673 bp。将0.2µg pGL3碱性衍生质粒与内部对照质粒pCMV-Lac（Promega）一起转染H9C2细胞。使用微孔板阅读器（Bio-Rad），使用50µl每个细胞裂解液测量荧光素酶和β-半乳糖活性（未显示），并根据β-半乳糖活性标准化荧光素酶活性。

电泳迁移率变化分析（EMSA）

用Tm（10µg/ml）处理H9C2细胞24小时。为了分离经Tm处理或未经处理的细胞（约80%融合）中的核部分，将细胞胰蛋白酶化并在220℃下离心克持续10分钟。去除上清液后，用低渗缓冲液（10 mM Hepes pH，7.9，1.5 mM MgCl）重新悬浮总细胞₂，10 mM KCl，0.2 mM PMSF，0.5 mM DTT，1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒），并在4°C下培养5分钟。细胞在1550时离心克在4°C下保持20分钟。为了分离核提取物，将沉淀物与低渗缓冲液：高盐缓冲液（20 mM Hepes pH，7.9，25%甘油，0.4 M KCl，1.5 mM MgCl，0.2 mM EDTA，0.2 mM PMSF，0.5 mM DTT；1:1，v/v）在4°C下孵育15分钟。为了清除碎片，细胞在9300℃下离心克在4°C下保持20分钟。核蛋白浓度通过Bradford分析测定。寡核苷酸（CypB-ERSE，5′-CCTAT中国民航总局GAGAGGGCTGTAA公司CGTGG公司C-AGC-3′；CGTtt，5′-CTAT中国民航总局GAGAGGGCTGTAA公司CGTtt公司CAGCACCCCGCA-3′；下划线残基表示NF-Y1-结合基序，小写残基表示ATF6结合基序）标记有[γ-³²P] 使用T4多核苷酸激酶（Promega）的ATP（Amersham Biosciences）。使用或不使用10µg/ml Tm和放射性标记探针（CypB-ERSE或CGTtt）处理的核提取物（15µg）在5×结合缓冲液[25%甘油、50 mM Tris、pH 7.5、250 mM NaCl、5 mM DTT、5 mM-EDTA、20µg/ml聚（dI-dC）]存在下孵育1小时。在竞争性分析中，每个样品都用100倍的未标记竞争性寡核苷酸进行处理。利用兔抗大鼠ATF6抗体（圣克鲁斯生物技术公司）进行超转移试验。将核提取物（15µg）加载到非变性TBE-聚丙烯酰胺凝胶（4%）上，以分解蛋白质和γ-³²P标记的CypB探针复合物。使用120 V将非变性TBE-聚丙烯酰胺凝胶运行6小时。干燥凝胶用X射线胶片曝光36小时。

染色质免疫沉淀（ChIP）

如前所述进行常规染色质IP(Luo等人，2003年)除了交联的H9C2染色质受到抗ATF6、XBP1或NF-Y（圣克鲁斯生物技术）抗体的免疫沉淀。使用引物（5′-ATCCCACACGCCTTCCGC-3′和5′-AAGCAATGGAGTGGTTAGG-3′）扩增出含有ATF6和NF-Y结合位点的CypB-ERSE。以引物（5′-ACTACAGAGAGGCCTTA-3′和5′-CCTTGCTGGGACCGGAG-3′）作为阴性对照扩增非ERSE。

亲环素B的位置

为了确定CypB的位置，将GFP、GFP-CypB/wt或GFP-CypB/R62A构建物转染到H9C2细胞中。用盖玻片上的Tg或Tm处理或未处理的转染剂加载1µM ER跟踪器白蓝色DPI（分子探针）30分钟，然后在室温下在4%甲醛中固定15分钟。用LSM510共焦激光显微镜（卡尔蔡司）监测染色细胞。

MTT转化分析

在12孔板中使用MTT还原转化试验评估细胞活力。在550 nm的微孔板阅读器（Bio-Rad）中评估光密度。细胞存活率表示为吸光度相对于未处理细胞的百分比。

Hoechst 33342染色和TUNEL分析

用Tg和Tm处理后，将H9C2细胞与Hoechst 33342（Molecular Probes）负载染料孵育30分钟，并在冰冷的1×PBS中洗涤三次。使用LSM510共聚焦激光显微镜（Carl Zeiss）监测染色的细胞。

使用ApopDIRECT™DNA片段试剂盒（MBL）进行TUNEL分析。使用共焦显微镜评估阳性凋亡细胞核。

重组腺病毒

将CypB/wt或CypB/R62A克隆到pCA14中。对于同源重组，将pCA14-CypB/wt或pCA14-CypB/R62A转化为大肠杆菌BJ 5183以及vmRL-H5dl324Bst。重组腺病毒在HEK293细胞中增殖。采用Ad-GFP或未感染细胞作为CypB表达的阴性对照。

细胞内钙的测定²⁺水平

将CypB/wt和CypB/R62A转染剂接种到含有10%血清的DMEM-F12中的25mm盖玻片上。用Ca加载40分钟后²⁺-敏感染料10µM Fluo-4（分子探针），在无血清培养基中冲洗细胞两次，并用二甲基亚砜或1µM Tg刺激²⁺，在Tg处理之前用4µM EGTA（Sigma-Aldrich）预培养细胞。30秒后，细胞溶质Ca²⁺评估了水平(n个=20）使用LSM510共焦显微镜（卡尔蔡司）。

活性氧（ROS）和线粒体膜电位（MMP）分析（Δψm）

用10µM DCF-DA（分子探针）培养后，使用流式细胞仪分析细胞的活性氧。对于MMP分析，在与40 nM DiOC6（分子探针）孵育后使用流式细胞术。

RNA干扰

siRNA靶序列如下：CypB-siRNA（sense，5′-UCCAGAGAGACUCAAdTdT-3′；antisense，5′-UUGAGUUCAUCUG-GGAdTdT′）、ATF6-siRNA（sense，5’-GGGUUCAGAGAUUGCCGUdT—3′；反义：5′-UACGGCAAUAUCAACCCdGdT—3'）和control-siRNA 3′）。用western blotting分析CypB或ATF6的siRNA干扰。

实验

如前所述制备pGEX-KG/CypB（GST-CypB/wt）和pGEX-KG/CypB/R62A（GST-CypB/R62A）的融合蛋白(Bourdoncle等人，2005年). 将亲和珠与500µg H9C2总细胞提取物孵育24小时，分别加入或不加入Tg和Tm。用western blot分析检测珠上保留的蛋白质。

协同免疫沉淀

使用或不使用1µM Tg和10µg/ml Tm处理的H9C2细胞提取物（500µg）与非免疫血清偶联蛋白g或A Sepharose珠或抗CypB抗体偶联蛋白g和A Sepharo珠孵育。免疫沉淀物进行western blot分析。

酵母双杂交分析

将CypB/wt或CypB/R62A连接成pGBKT7编码的GAL4 DNA结合域（BD）。将Bip或Grp94基因克隆到编码激活域（AD）的pGADT7中。为了评估CypB和Bip或Grp94之间的结合，按照前面的描述进行了实验(Chen等人，2004年).

这项工作得到了韩国科学与工程基金会（编号：R13-2002-020-02001-0（2007））对S.S.K.的资助，首尔RNBD项目（编号：11062）对大韩民国WC的资助，以及NIH向霍华德·休斯医学院研究员R.J.K.R.J.K的DK42394资助。