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分子细胞。作者手稿；PMC 2010年1月30日提供。
以最终编辑形式发布为：
分子细胞。2009年1月30日；33(2): 237–247.
数字对象标识：2016年10月10日/j.molcel.2008.12.026
预防性维修识别码：PMC2715556型
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院94249
PMID：19187764

癌基因B-RAF负调控肿瘤抑制因子LKB1促进黑色素瘤细胞增殖

Bin Zheng先生,1,2,* Joseph H.Jeong先生,三 约翰·M·阿萨拉,1,4 袁应元,1 斯科特·格兰特,5 琳达·琴,三和刘易斯·坎特利1,2,*
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补充资料

总结

LKB1–AMPK信号通路是连接能量稳态与细胞生长、增殖和生存的关键细胞传感器。然而，肿瘤细胞是如何在能量应激条件下抑制这种信号通路以获得生长优势的，目前尚不清楚。在这里，我们发现具有B-RAF V600E突变的黑色素瘤细胞中AMPK的激活被抑制，并且B-RAF信号的下调激活AMPK。我们发现，在这些细胞中，LKB1被B-RAF下游的两种激酶ERK和Rsk磷酸化，这种磷酸化破坏了LKB1结合和激活AMPK的能力。此外，LKB1磷酸化缺陷突变体的表达可激活AMPK并抑制黑色素瘤细胞增殖和锚定非依赖性细胞生长。我们的发现提供了LKB1-AMPK和RAF-MEK-ERK通路之间的分子联系，并表明B-RAF V600E对LKB1功能的抑制在B-RAF C600E驱动的肿瘤发生中起着重要作用。

介绍

RAF-MEK-ERK蛋白激酶信号级联反应是一种调节细胞生长、增殖、分化和存活的中心途径，以响应细胞外刺激(Chong等人，2003年;Wellbrock等人，2004年). RAF激酶家族成员B-RAF的体细胞突变在约6%的人类癌症中被发现(Davies等人，2002年)恶性黑色素瘤（50-70%）、乳头状甲状腺癌（～30%）、浆液性卵巢癌（～3%）和结直肠癌（～15%）发病率最高(Dhomen和Marais，2007年;加内特和马莱，2004年;Tuveson等人，2003年). 最近，B-RAF的种系突变也被证实存在于心胸皮肤综合征中(Schubbert等人，2007年). 90%以上的致癌B-RAF突变(Ikenoue等人，2003年)以V600E的形式出现，诱导组成性活性ERK信号(Wan等人，2004年). 致癌的B-RAF V600E突变已被证明对肿瘤的诱导、生长、维持和进展具有重要作用，但详细的分子机制尚待阐明(Dhomen和Marais，2007年;Gray-Schopfer等人，2005年).

抑癌基因LKB1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在常染色体显性遗传的Peutz-Jeghers综合征（PJS）中突变，PJS是一种以多组织中的良性和恶性肿瘤、胃肠道的骆驼状息肉和皮肤粘膜色素沉着风险增加为特征的疾病（有关综述，请参阅(Alessi等人，2006年;Katajisto等人，2007年). 在散发性肺腺癌中也经常观察到LKB1的体细胞突变(Sanchez-Cespedes等人，2002年)，其在小鼠体内的失活促进了转移性肺腺癌的发生(Ji等人，2007年). 遗传学研究表明，LKB1调节细胞生长、细胞增殖和细胞生存以应对应激。缺乏LKB1的小鼠胚胎成纤维细胞在培养中不能衰老(Bardeesy等人，2002年)但在能量应激下更容易发生凋亡(Shaw等人，2004b). 此外，LKB1与上皮细胞极性的控制有关，其基础是秀丽线虫和果蝇遗传学与哺乳动物细胞培养(Baas等人，2004年;马丁和圣约翰斯顿，2003年;Watts等人，2000年).

最近发现LKB1在激活AMP依赖性蛋白激酶（AMPK）中的作用(Hawley等人，2003年;Shaw等人，2004b;Woods等人，2003年)已经开始解释许多与LKB1丢失相关的现象。LKB1直接磷酸化该酶激活环中Thr-172处的AMPK，在大多数细胞环境中，AMPK的激活需要在该位置积累磷酸盐以响应细胞AMP的升高。为了解释LKB1的失效，人们援引了AMPK在能量应激下被激活的失效-/-细胞经历细胞周期阻滞，抑制蛋白质合成和其他大分子合成，以应对能量应激条件，如在肿瘤生长中观察到的情况(Inoki等人，2003年;Jones等人，2005年;Luo等人，2005年;Motoshima等人，2006年;Shaw等人，2004年a). 特别令人感兴趣的是，AMPK对块茎蛋白和RAPTOR的磷酸化已被证明在抑制mTOR信号传导以应对能量应激中发挥作用(Gwinn等人，2008年;Inoki等人，2003年;Shaw等人，2004年a). 近年来，人们发现了大量AMPK底物，其中许多底物在调节大分子合成和细胞能量方面起着关键作用(卡林，2004年;哈迪，2005;Kahn等人，2005年;Motoshima等人，2006年;Shaw，2006年). LKB1的其他靶点可能包括AMPK相关的MARK家族蛋白激酶(Lizzano等人，2004年)也导致了缺乏LKB1的细胞中细胞调节的各种缺陷。

最近对LKB1-AMPK轴在抑制细胞生长和细胞周期进入中所起关键作用的认识为药物干预通过激活该途径抑制肿瘤生长提供了有趣的可能性(哈迪，2007)同时也提出了一些问题，即肿瘤细胞如何抑制这一途径，以便在能量应激条件下继续生长。虽然LKB1的体细胞功能缺失突变在肺癌以外的人类癌症中并不常见，但抑制该途径基因表达的表观遗传机制正在被揭示(Tiainen等人，1999年). 在这里，我们探讨了抑制肿瘤细胞中LKB1-AMPK通路的翻译后机制。我们发现，在由致癌B-RAF激酶突变转化的黑色素瘤细胞中，LKB1在两个位点被磷酸化，这两个位点损害了该酶与AMPK结合并磷酸化AMPK的能力。更重要的是，我们表明这种对B-RAF转化的黑色素瘤细胞中LKB1功能的抑制在介导B-RAF的致癌活性中起着重要作用。

结果

B-RAF V600E致癌突变的黑色素瘤细胞损害了AMPK的激活

AICAR（5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷）是一种AMP模拟物，已被证明在几种不同的人类肿瘤细胞系中激活AMPK并抑制细胞增殖，包括MCF-7（乳腺癌）、C6（胶质瘤）、PC3和LNCaP（前列腺癌）细胞(Rattan等人，2005年;Xiang等人，2004年). 在研究AICAR对黑色素瘤细胞的潜在影响期间，我们观察到，AICAR如预期的那样，刺激了人类黑素瘤细胞系MeWo和SK-MEL-31中Thr-172的AMPK磷酸化，但未能在其他几个黑素瘤电池系SK-MEL-28、UACC62和UACC257中引起AMPK的磷酸化(图1A). 与该观察结果一致，AICAR刺激MeWo和SK-Mel-31细胞中Ser-79的AMPK底物乙酰辅酶A羧酸盐（ACC）磷酸化，但在其他三种细胞系中没有(图1A). 所有五种细胞系的AMPK总水平相似(图1A). SK-Mel-28、UACC62和UACC257-4细胞中AMPK磷酸化失败并不是由于缺乏LKB1，正如用LKB1抗体进行的western印迹所判断的那样(图1A).

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B-RAF V600E抑制AMPK活性。（A）含有WT B-RAF或V600E突变的人类黑色素瘤细胞中AMPK和ACC的磷酸化。用或不用1 mM AICAR处理细胞1小时。用细胞裂解液与所示抗体进行免疫印迹。（B）B-RAF V600E的表达减弱C140黑素细胞中AMPK的激活。用指定浓度的AICAR处理C140稳定表达的B-RAF WT或V600E突变体。

虽然MeWo和SK-Mel-31细胞表达野生型B-RAF，但SK-Mel-28、UACC62和UACC 257细胞含有B-RAF V600E突变，这增加了激活B-RAF突变可能抑制LKB1-AMPK信号的可能性。为了验证这个假设，我们制作了小鼠墨水4a/Arf稳定转染WT B-RAF或V600E突变体的空白黑素细胞C140细胞，发现转染B-RAF V600E的细胞显示AICAR诱导的AMPK磷酸化降低(图1B). 与WT B-RAF相比，B-RAF V600E转染增强了ERK1/2磷酸化，但没有影响内源性AMPK或LKB1的总水平(图1B). 在Cos-7细胞中表达B-RAF V600E突变而非WT B-RAF也抑制了AMPK对AICAR的激活(补充图S1). 这些结果共同表明，B-RAF V600E的表达抑制AMPK的活性。值得注意的是，抑制AMPK激活与黑色素瘤细胞系的B-RAF突变状态的相关性优于与ERK1/2磷酸化水平的相关性。例如，AICAR激活SK-Mel-31细胞中的AMPK，该细胞ERK1/2磷酸化升高，但缺乏B-RAF突变(图1A). 下面更详细地讨论了这一结果，表明B-RAF激活可能比其他ERK1/2激活机制更多地通过下游信号传导抑制AMPK。

下调致癌B-RAF信号刺激AMPK激活

为了进一步研究B-RAF在调节AMPK激活中的作用，我们使用RNA干扰来敲低B-RAF的表达(Hingorani等人，2003年)在含有B-RAF V600E突变的黑色素瘤细胞系中。如所示图2A如预期的那样，在SK-MEL-28细胞中使用两种不同的shRNA结构下调B-RAF表达，导致ERK1/2磷酸化降低，并导致Thr-172处AMPK磷酸化增加，进一步支持致癌B-RAF对AMPK激活的抑制作用。

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下调B-RAF信号激活AMPK。（A）RNA干扰抑制B-RAF表达激活AMPK。用pSUPER-retro中含有两种不同shRNA结构的逆转录病毒感染SK-Mel-28细胞，以对抗B-RAF或pSUPER-retro空载体。

（B）通过RNA干扰敲低MEK1表达激活AMPK。用pSM2C中含有两种不同shRNA结构的逆转录病毒感染SK-Mel-28细胞，以对抗MEK1或对照空载体。

（C）各种抑制剂对RAF-MEK-ERK信号级联的AMPK磷酸化诱导。用DMSO、20μM U0126或50μM PD98059处理SK-MEL-28细胞1小时。

为了评估B-RAF下游效应器（MEK和ERK）在AMPK调节中的作用，我们使用特异性靶向SK-MEL-28细胞中MEK1或ERK2的逆转录病毒shRNA构建物，发现MEK1和ERK2表达下调(图2B)或ERK2(补充图S5)导致AMPK激活。SK-MEL-28也观察到AMPK的类似激活(图2C)和UACC62细胞用MEK抑制剂U0126、PD98059或CI-1040（也称为PD184352）处理(补充图S3和S4). 综上所述，我们的结果表明，AMPK的活性可能通过其下游MEK-ERK激酶信号级联被致癌的B-RAF V600E突变体负调控。

B-RAF下游的两种激酶ERK和p90Rsk对LKB1的磷酸化作用

B-RAF信号对AMPK的负调控表明AMPK本身或其上游激酶可能是RAF-MEK-ERK蛋白激酶信号级联的靶点。因为已知AMPK上游激活物LKB1在多个位点被磷酸化体内(Sapkota等人，2002a;Sapkota等人，2002b;Sapkota等人，2001年)，我们首先研究了U0126治疗对AMPK活性的影响是否依赖于LKB1的存在。如所示图3A，不同于源自磅1+/+小鼠，U0126治疗不会导致AMPK在磅1-/-MEF公司。类似地，通过使用两种不同的shRNA结构敲低SK-Mel-28细胞中的LKB1，会削弱这些细胞中AMPK对U0126的激活(图3B)表明LKB1的存在对MEK抑制剂对AMPK活性的影响至关重要。

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U0126激活AMPK取决于LKB1的存在。

（A）U0126诱导的AMPK激活依赖于MEF中的LKB1。不朽的磅1+/+和磅1-/-MEF无血清，用20μM U0126处理2小时。

（B）U0126诱导的AMPK激活依赖于SK-Mel-28细胞中的LKB1。SK-Mel-28细胞感染慢病毒，慢病毒编码两种不同的shRNA对抗LKB1（sh2和sh3）或对照shRNA（sh1），血清饥饿，用20μM U0126处理2小时。

接下来，我们检测了RAF-MEK-ERK途径调节后LKB1磷酸化的程度。用FLAG标记的LKB1转染HEK293细胞，并在有或无U0126的情况下用佛波酯PMA（RAF-MEK-ERK级联的已知激活剂）处理。使用抗FLAG M2琼脂糖珠免疫纯化LKB1(图4A)用胰蛋白酶或糜蛋白酶消化，并进行LC-MS/MS分析以评估磷酸化状态。在经PMA处理的样品中一致发现两种含有磷酸化Ser325和Ser428的肽，但在未经处理的细胞或经U0126处理的细胞的LKB1中很少检测到这两种肽。使用总离子电流（TIC）与液相色谱洗脱峰的比值分析了含有磷酸化-Ser325和磷酸化-Ser 428的肽与其未磷酸化状态下相同肽的相对数量(Asara等人，2008年;Tsay等人，2000年). 该分析显示，用U0126处理可使Ser325和Ser428磷酸化的LKB1部分分别显著降低约80%和65%(补充图S6). 先前的研究表明，Ser428可以被PKA或p90Rsk磷酸化在体外和体内(Sapkota等人，2001年)，并且这里给出的结果表明Ser428磷酸化发生在MEK信号传导的下游，与p90Rsk是这种情况下涉及的激酶一致。尽管S428磷酸特异性抗体不够敏感，无法通过western blotting检测SK-Mel-28细胞或MEF中的内源性LKB1(补充图S7)该抗体在稳定表达FLAG-LKB1的SK-MEL-28细胞中检测到磷酸化S428，并且通过使用MEK抑制剂U0126和PD98059处理或通过RNAi敲低B-RAF表达来降低磷酸化(图4B和4C). 这些结果进一步支持Ser428是RAF-MEK-ERK信号级联的目标。

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LKB1的Ser325和Ser428分别通过B-RAF、ERK和p90Rsk的两个下游激酶磷酸化。

（A）通过LC-MS/MS分析鉴定含有Ser325和Ser428的磷酸化LKB1肽。将用FLAG-LKB1转染的HEK293细胞进行血清饥饿处理，并在添加200 nM PMA之前用或不用20μM U0126预处理2小时20分钟。使用抗FLAG M2琼脂糖珠免疫沉淀FLAG-LKB1蛋白，并进行胰蛋白酶或糜蛋白酶消化，然后进行LC-MS/MS分析。

（B）MEK抑制剂U0126和PD98059抑制LKB1 Ser325和Ser428磷酸化。用抗FLAG M2琼脂糖珠免疫沉淀SK-Mel-28稳定表达FLAG-LKB1的细胞裂解液，然后用指示的抗体进行免疫印迹。数字表示通过图像J分析量化的相对强度。

（C）B-RAF表达下调后LKB1 Ser325和Ser428磷酸化的减弱。稳定表达FLAG-LKB1的SK-Mel-28细胞感染pSUPER-retro中含有两种不同shRNA结构的逆转录病毒，以对抗B-RAF或pSUPER-retro空载体。细胞裂解物用抗FLAG M2琼脂糖珠免疫沉淀，然后用所示抗体进行免疫印迹。数字表示通过图像J分析量化的相对强度。

（D）ERK直接磷酸化LKB1在体外GST-LKB1（D194A）蛋白表达于大肠杆菌在γ存在下纯化并与活性重组ERK蛋白孵育-32P-ATP。进行放射自显影术。

（E）Ser325对ERK磷酸化LKB1至关重要在体外从HEK293细胞中免疫沉淀HA-LKB1 WT和S325A突变体，并与重组ERK蛋白孵育。检测所得蛋白和HEK293细胞裂解物分别与磷酸化S325 LKB1抗体和HA抗体进行蛋白质印迹分析。

（F）HA-LKB1与FLAG-ERK2共免疫沉淀。用HA-LKB1和FLAG-ERK2野生型或激酶死亡突变体转染HEK293细胞。细胞裂解物用抗FLAG M2琼脂糖珠免疫沉淀，然后用HA抗体进行免疫印迹。

（G）HA-ERK2与FLAG-LKB1-N共免疫沉淀，但没有FLAG-LK1-C。将HA-ERK1与全长（FL）、N（a.a 1-309）、C（a.a.310-433）或对照载体一起转染Cos-7细胞。细胞裂解物用抗FLAG M2琼脂糖珠免疫沉淀，然后用HA抗体进行免疫印迹。

（H）HA-LKB1与B-RAF V600E联合免疫沉淀，但不与WT B-RAF联合免疫沉淀。如图所示，用FLAG-BRAF、HA-LKC1或空载体转染HEK293细胞。用抗FLAG M2琼脂糖珠免疫沉淀细胞裂解物，然后用指示的抗体进行免疫印迹。

（一）BRAF V600E的表达增强了LKB1和ERK之间的联系。如图所示，用FLAG-LKB1、HA-ERK以及对照载体、FLAG-B-RAF WT或B-RAF V600E构建体转染HEK293细胞。细胞裂解物用抗HA抗体进行免疫沉淀，然后用指示的抗体进行免疫印迹。

之前还发现小鼠LKB1中的Ser325被磷酸化(Sapkota等人，2002a)，但没有鉴定出负责的激酶。Scansite的序列分析(Yaffe等人，2001年)表明Ser325是脯氨酸依赖性激酶（如细胞周期素依赖性激酶）和MAPK（包括ERK）的候选磷酸化位点。此外，Scansite预测LKB1包含两个假定的ERK对接D结构域和一个ERK1结合结构域。这些预测以及Ser325磷酸化对MEK抑制剂的敏感性意味着LKB1可以被Ser325上的ERK直接磷酸化。测试ERK是否能直接磷酸化LKB1在体外，GST标记的LKB1在大肠杆菌在γ存在下纯化并与活性重组ERK蛋白孵育-32P-ATP。避开背景32使用LKB1的激酶死亡突变体（D194A）LKB1的自磷酸化引起的P掺入。如所示图4D，ERK蛋白磷酸化重组LKB1蛋白在体外此外，ERK被发现磷酸化HEK293细胞中HA标记的LKB1免疫沉淀，Ser325突变为Ala后，磷酸化作用消失(图4E).

进一步表征LKB1 Ser325的磷酸化体内，产生了抗LKB1磷酸化-Ser325的抗体。该抗体识别过表达的HA-LKB1 WT，但不识别HA-LKB1S325A突变体，U0126处理后对HA-LKB1的反应性大大降低(补充图S8). 同样，SK-MEL-28稳定细胞系中FLAG-LKB1的Ser325磷酸化也对U0126和PD98059的处理或通过RNA干扰抑制BRAF表达敏感(图4B和4C). 此外，HA-LKB1与FLAG-ERK2在HEK293细胞中共同免疫沉淀(图4F). 进一步的定位实验表明，LKB1的激酶结构域而非LKB1 C末端区域介导其与ERK2的关联(图4G). 总之，这些结果表明LKB1 Ser325是ERK的直接磷酸化靶点。

RAF-MEK-ERK信号对AMPK激活的抑制作用仅在具有B-RAF V600E突变的黑色素瘤细胞株中观察到，而在具有WT B-RAF突变的黑素瘤细胞系中未观察到(图1A). 为了研究突变体B-RAF这种特异性作用的潜在机制，我们在HEK293细胞中共同表达了FLAG-tagged WT B-RAF或V600E突变体以及HA-LKB1，发现HA-LKC1与FLAG-B-RAF V600E共同免疫沉淀，而不是FLAG-BRAF WT(图4H)，表明LKB1优先与B-RAF V600E关联。为了进一步研究B-RAF V600E是否能将ERK活性传导至LKB1，我们测试了B-RAF V100E表达对LKB1和ERK之间关联的影响图4I与表达WT B-RAF或对照pCDNA3载体的细胞相比，表达B-RAF V600E的细胞中与HA-ERK2共免疫沉淀的FLAG-LKB1显著增加。这些结果进一步支持了BRAF V600E突变促进ERK靶向LKB1的观点。

Ser325和Ser428的磷酸化对LKB1调节AMPK活化至关重要

为了解决LKB1在Ser325和Ser428磷酸化的功能后果，我们评估了LKB1 WT和磷酸化缺陷突变体激活内源性AMPK的能力。如所示图5ALKB1 S325A、S428A或S325A/S428A（AA）双突变体在磅1-/-与WT LKB1的表达相比，MEF导致AMPK磷酸化增强。这种差异在没有AICAR的情况下尤为明显。在表达LKB1磷酸化缺陷突变体的细胞中也观察到ACC磷酸化增强。这些结果表明，Ser325或Ser428的磷酸化抑制LKB1激活AMPK的能力。当这些不同的结构在HeLa细胞中表达时，也得到了类似的结果(补充图S10)，缺少LKB1(Tiainen等人，1999年).

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Ser325和Ser428上LKB1的磷酸化参与了LKB1对AMPK活化的调节。

（A）LKB1的Ser325或Ser428突变为Ala可增强其对AMPK激活的活性。磅1-/-MEF感染含有载体对照物WT LKB1、S325A、S428A或S325A/S428A LKB1的逆转录病毒，并用1 mM AICAR处理1小时。用细胞裂解物与指示抗体进行免疫印迹。

（B）LKB1 S325A/S428A突变体的表达刺激SK-MEL-28细胞中的AMPK。SK-MEL-28细胞感染含有WT LKB1、S428A、S325A或S325A/S428A（AA）LKB1突变体的逆转录病毒。细胞裂解物用于带有指示抗体的蛋白质印迹分析。

（C）Ser325和Ser428突变为Ala增强了LKB1与AMPK结合的能力，但不增强STRAD和MO25的结合能力。用GST-AMPKα1、Omni-STRAD、FLAG-MO25和HA-LKB1的WT或S325A/S428A（AA）突变体转染HEK293细胞。用所示抗体免疫沉淀细胞裂解物，或用GSH琼脂糖珠孵育2小时，然后用所示的抗体免疫印迹。

（D）将Ser325和Ser428突变为丙氨酸或U0126处理可增强LKB1与SK-Mel-28细胞内源性AMPK相关的能力。用DMSO或20μM U0126处理稳定表达FLAG-LKB1 WT或AA突变体的SK-Mel-28细胞2小时。用M2抗FLAG琼脂糖珠培养细胞裂解液2小时，然后用指示的抗体进行Western blotting。

（E）B-RAF表达的下调增强了LKB1与SK-Mel-28细胞内源性AMPK相关的能力。用pSUPER-retro中含有两种不同shRNA结构的逆转录病毒感染稳定表达FLAG-LKB1 WT的Sk-Mel-28细胞，以对抗B-RAF或pSUPER-retro空载体。细胞裂解物用抗FLAG M2琼脂糖珠免疫沉淀，然后用所示抗体进行免疫印迹。

为了证实Ser325和Ser428上LKB1的磷酸化介导含有致癌B-RAF V600E突变的人类黑色素瘤细胞中AMPK活性的抑制，我们生成了稳定表达LKB1野生型、S325A、S428A或LKB1 AA双突变体的SK-MEL-28细胞。如所示图5B与表达野生型LKB1的细胞相比，表达LKB1 AA突变体的SK-Mel-28细胞的磷酸-AMPK增加。在这些细胞中，带有单点突变的LKB1的表达对AMPK磷酸化只有中等影响，这表明LKB1在任一位点的磷酸化可能不足以抑制活性。在UACC67细胞中也获得了类似的结果，这是另一个含有B-RAF V600E的黑色素瘤细胞系(补充图S11).

LKB1的全部活性需要与两个调节亚单位STRAD和MO25相互作用(Hawley等人，2003年). 此外，LKB1已被证明与AMPK相关(Shaw等人，2004b). 为了深入了解LKB1磷酸化对AMPK激活影响的机制，我们比较了LKB1 WT和磷酸化缺陷AA突变体与AMPK、STRAD和MO25相关的能力。如所示图5C在HEK293细胞中，HA标记的WT LKB1和AA突变体都与Omni-STRAD和FLAG-MO25结合。然而，有趣的是，LKB1 AA突变体与GST-AMPK的相关性强于WT LKB1(图5C). 同样，在SK-Mel-28稳定细胞系中，与WT LKB1相比，用FLAG标记的LKB1 AA突变体免疫沉淀的内源性AMPK更多(图5D). 此外，U0126处理增强了AMPK和WT LKB1之间的相互作用，但对AA突变体没有额外的影响(图5D). 同样，在稳定表达LKB1的SK-Mel-28细胞中，用两种不同的shRNA结构敲低B-RAF的表达也增强了AMPK和LKB1之间的相互作用(图5E). 这些结果表明，Ser325和Ser428上LKB1的磷酸化抑制了其与AMPK结合的能力，从而解释了AMPK磷酸化降低的原因。

LKB1磷酸化缺陷突变体的表达抑制黑色素瘤细胞的增殖和锚定非依赖性生长

为了检测LKB1在Ser325和Ser428磷酸化的生物学效应，我们对稳定表达LKB1 WT或磷酸化缺陷AA突变体的SK-MEL-28细胞进行了细胞增殖测定。我们发现，与表达WT LKB1的细胞相比，表达LKB1 AA突变体的细胞的增殖率显著降低，这表明在表达BRAF V600E的黑色素瘤细胞中，Ser325和Ser428的LKB1磷酸化对细胞增殖很重要(图6A).

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Ser325和Ser428上LKB1的磷酸化对细胞增殖和凤尾鱼非依赖性生长至关重要。

（A）LKB1 S325A/S428A（AA）突变体的表达抑制细胞增殖。测定稳定表达WT LKB1或AA突变体的SK-MEL-28细胞的细胞增殖曲线。显示了三个独立实验中的一个代表。

（B）LKB1 S325A/S428A（AA）突变体的表达抑制细胞转化。稳定表达LKB1 WT LKB1或AA突变体的SK-MEL-28细胞用于沙发琼脂试验。菌落生长28天后进行拍照。误差条表示SD。显示了三个独立实验中的一个代表。

（C）人类黑色素瘤样本中磷酸-ERK和磷酸-AMPK活性之间的反向相关性。免疫组化分析中用磷酸-AMPK或磷酸-ERK抗体染色的人类黑色素瘤样本的代表性图像。

（D）含有B-RAF V600E突变的人类黑色素瘤细胞中磷酸-ERK和磷酸-AMPK活性之间的反向相关性。将来自几个人类黑色素瘤细胞系的总细胞裂解物与所示抗体一起用于蛋白质印迹分析。

（E）含有B-RAF V600E突变的人类黑色素瘤细胞中LKB1 Ser325和Ser428的磷酸化水平。用pBabe-FLAG-LKB1 WT稳定转染各种黑色素瘤细胞系，用抗FLAG M2琼脂糖珠免疫沉淀细胞裂解物，然后用指示的抗体进行免疫印迹。

为了确定磷酸化在凤尾鱼非依赖性细胞生长中的作用，我们对表达WT或LKB1 AA突变体的SK-MEL-28细胞进行了软琼脂试验。如所示图6B表达LKB1 AA突变体的细胞形成的集落少于表达WT LKB1的细胞，这表明Ser325和Ser428的磷酸化对表达B-RAF V600E的黑色素瘤细胞的细胞转化很重要。

原发性人类黑色素瘤标本和黑色素瘤细胞系中P-AMPK活性和P-ERK活性的关系

为了评估RAF-MEK-ERK信号对人类黑色素瘤样本中AMPK活性抑制的相关性，我们检测了人类黑色素肿瘤免疫组织化学研究中磷酸-ERK和磷酸-AMPK的水平。我们发现，在五个显示强磷酸化-ERK染色的原发肿瘤样本中，其中一个显示中度，三个显示弱磷酸化-AMPK染色，一个显示阴性(图6C). 相反，在四个表现出强烈磷酸-AMPK染色的肿瘤中，其中一个表现为中度磷酸-ERK染色，三个表现为阴性磷酸-ERK染色，这表明人类黑色素瘤中磷酸-AMPK和磷酸-ERK-活性呈负相关（卡方检验，第页= 0.028). 此外，在含有BRAF V600E突变的几个人类黑色素瘤细胞系的免疫印迹分析中，也观察到磷酸-AMPK和磷酸-ERK水平之间存在类似的负相关趋势(图6D). 我们在这些细胞系的一个子集中稳定表达FLAG标记的野生型LKB1，免疫沉淀LKB1并检测Ser325和Ser428的磷酸化。磷酸化-AMPK水平最高、磷酸化-ERK1/2水平最低的细胞株（WM88）在任一位点均未检测到LKB1的磷酸化，而磷酸化-AAMK水平最低、磷酸化ERK1/2水平较高的细胞系（UACC62）在两个位点均表现出高磷酸化。UACC267和M14细胞表现出中等水平的LKB1磷酸化和AMPK磷酸化。

讨论

LKB1-AMPK信号轴在连接细胞代谢传感和细胞生长、增殖和存活的调节中起着中心作用(哈迪，2005;Luo等人，2005年;Motoshima等人，2006年;Shaw，2006年). AMPK的活性由细胞溶质AMP与ATP的比率调节，这影响Thr172的磷酸化。磷酸化-Thr172的稳态水平由激酶磷酸化和磷酸酶去磷酸化的相对速率决定。最近的研究表明，AMP与AMPK的γ亚单位结合可降低Thr172的去磷酸化速率，导致AMPK活化增加(Steinberg等人，2006年). 我们在这里提出的结果表明，B-RAF下游激酶对LKB1的磷酸化会削弱LKB1与Thr172处AMPK结合并磷酸化的能力，从而阻断AMPK的激活，即使在AMP升高的情况下也是如此。ERK和p90RSK对LKB1的磷酸化以及随后对其磷酸化和激活AMPK的能力的抑制可能部分介导BRAF V600E的致癌作用，因为LKB1磷酸化缺陷突变体（S325A/S428A）的表达抑制了黑色素瘤细胞的增殖(图7). 该模型提供了一种通过翻译后修饰下调肿瘤细胞中抑癌基因LKB1的细胞活性的机制。

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BRAF V600E信号负调控LKB1/AMPK活性的模型。

LKB1包含一个中央丝氨酸-三氢嘌呤激酶结构域、一个具有核定位信号的N末端区域和一个C末端调节区域(Alessi等人，2006年). LKB1的Ser325和Ser428都位于C端子区域。尽管Ser428先前被证明在不同刺激下被p90Rsk和PKA磷酸化，但没有证据表明这种磷酸化影响体内或在体外LKB1的功能(Sapkota等人，2001年). 先前也检测到Ser325的磷酸化，但未确定负责此磷酸化的激酶(Sapkota等人，2001年). 在本报告中，我们表明Ser325和Ser428突变为Ala增强了LKB1与AMPK的关联，但没有改变与STRAD或MO25的关联。这一观察结果与之前的发现一致，即LKB1的C末端区域参与AMPK相互作用(Forcet等人，2005年)而激酶结构域介导与STRAD和MO25的相互作用(Boudeau等人，2004年). 这些残基的磷酸化是否会调节LKB1和其他LKB1下游激酶之间的相互作用，尚待观察。

有趣的是，在一例PJS患者的生殖系和一例散发性癌中，在密码子324（Pro-to-Leu）处发现了LKB1的功能缺失错义突变(Alessi等人，2006年). 生化研究表明，这种突变削弱了LKB1激活AMPK及其下游信号的能力(Forcet等人，2005年)支持AMPK信号调节对该LKB1突变体的活性至关重要的观点。Pro324与Ser325 ERK磷酸化位点相邻，根据ERK2的磷酸化基序，预测Pro-to-Leu的变化将使LKB1成为ERK2更好的底物(Yaffe等人，2001年)这与该LKB1突变体对AMPK激活的活性较低一致(Forcet等人，2005年). 此外，该区域可能需要特定的局部构象才能与AMPK结合，Ser325的磷酸化或Pro324突变为Leu可能会破坏这种相互作用所需的局部结构。

在本研究中，我们观察到携带B-RAF V600E突变的黑色素瘤细胞中ERK和AMPK活性之间存在负相关(图1A和图6). 然而，一些缺乏B-RAF突变的黑色素瘤细胞系，即SK-Mel-31细胞，磷酸化-ERK升高，而AMPK激活没有受到主要抑制(图1A). 因此，在黑色素瘤细胞中，抑制AMPK激活与B-RAF突变的相关性比与总ERK激活的相关性更好。有趣的是，我们发现LKB1与B-RAF V600E突变体共免疫沉淀，但与WT B-RAF不共免疫沉淀，并且B-RAF V600E的表达显著增强了LKB1和ERK之间的关联(图4H和4I). 这些结果强烈表明，在含有B-RAF突变的黑色素瘤细胞中，激活的ERK更有效地传导到底物LKB1。与这一概念一致，以前的研究表明，有B-RAF突变的黑色素瘤和没有B-RAF变异的黑色素癌在RAS-RAF-MEK-ERK信号网络的调节方面存在差异，具有Ras突变的黑色素瘤已被证明利用C-RAF而不是B-RAF来激活ERK，其结果是Ras突变黑色素瘤中cAMP信号的破坏(Dumaz等人，2006年). 此外，尽管Ras突变和B-RAF突变都激活ERK并引起细胞转化，但MEK抑制剂仅抑制B-RAF突变体细胞系的生长(Solit等人，2006年). LKB1和AMPK在能量应激条件下均能抑制细胞生长和增殖。可以想象，肿瘤细胞必须关闭这种信号通路才能获得生长优势。抑制LKB1-AMPK信号的机制包括通过上调HIF-1和随后参与葡萄糖摄取和糖酵解依赖性ATP合成的基因的转录激活来维持高水平的细胞ATP(阿什拉斐安，2006年;Gatenby和Gillies，2004年;Shaw，2006年). 第二种机制涉及LKB1基因的缺失或功能丧失突变，如PJS和非小细胞肺癌(Sanchez-Cespedes等人，2002年)恶性黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌和脑癌的发病率较低(Alessi等人，2006年;Guldberg等人，1999年;Katajisto等人，2007年;Rowan等人，1999年). 我们的研究结果表明，LKB1的磷酸化代表了一种“超越”LKB1和AMPK设置的能量刹车的新方式。我们表明，通过磷酸化和LKB1失活，AMPK在B-RAF V600E转化细胞中持续受到抑制，而通过药物抑制剂或RNA干扰下调B-RAF信号可以缓解这种抑制。研究通过对LKB1或AMPK的翻译后修饰来抑制LKB1-AMPK信号的类似机制是否在其他由其他机制驱动的癌细胞中发生，将是一件有趣的事情。

针对RAF-MEK-ERK通路的药物，如MEK和RAF抑制剂，正在加紧研发，并正在对各种人类癌症进行临床试验，如黑色素瘤、肾细胞癌和结直肠癌(Beeram等人，2005年;Gray-Schopfer等人，2007年;Schreck和Rapp，2006年;汤普森和里昂，2005年). 同时，目前用于治疗代谢紊乱的几种处方药物，如二甲双胍和噻唑烷二酮类，被发现可以激活LKB1-AMPK通路(哈迪，2007;Shaw，2006年;Shaw等人，2005年). 本文报道的RAF-MEK-ERK和LKB1-AMPK信号通路之间的分子联系对这些药物在治疗癌症和代谢紊乱方面的潜在用途具有多方面的意义。首先，AMPK激活剂被提议用于癌症治疗(哈迪，2007;Motoshima等人，2006年). 我们的研究结果表明，AMPK激活剂和MEK/RAF抑制剂在抑制B-RAF V600E转化的肿瘤细胞增殖方面可能具有协同作用。其次，我们的研究结果表明，当存在完整的LKB1等位基因时，MEK和RAF抑制剂可能通过激活LKB1来治疗PJS。最近的研究表明，LKB1的单倍体不足足以在小鼠模型中形成错构瘤性息肉，有证据表明，在PJS患者的恶性息肉中可以发现LKB1野生型等位基因(Hernan等人，2004年). 最后，除了直接的AMPK激活剂外，基于调节LKB1翻译后修饰的策略，如MEK和RAF抑制剂，间接激活AMPK，也可以考虑用于代谢障碍的治疗。

总之，我们的发现揭示了LKB1-AMPK和RAF-MEK-ERK这两种与癌症有关的重要蛋白激酶信号通路之间有趣的分子联系。人类癌症基因组体细胞突变模式的最新调查(Greenman等人，2007年)BRAF和LKB1/STK11被列为第二和第三种在癌症中突变的蛋白激酶（根据基因特异性选择压力）。进一步了解这种分子链在肿瘤发生中的作用可能为癌症治疗提供巨大的治疗机会。

实验程序

材料

抗磷酸-AMPK（Thr172）、抗AMPK、抗磷酸-ERK1/2（Thr202/Tyr204）、ERK、抗磷酸-ACC和抗磷酸-LKB1（Ser428）抗体购自Cell Signaling Technology。细胞信号技术产生了抗磷磷-LKB1（Ser325）抗体。抗-FLAG M2亲和凝胶、抗FLAG M2单克隆抗体和U0126购自Sigma。抗羊膜抗体、抗B-RAF抗体和抗CRAF抗体均来自圣克鲁斯生物技术公司。抗-HA（11）和抗LKB1（Ley37D/G6）单克隆抗体分别购自Covance和Abcam。AICAR从多伦多研究化学公司（加拿大安大略省Downview）获得。PD98059来自Cell Signal Technology。LKB1和AMPK cDNA结构已经在前面描述过(Shaw等人，2004b;Zheng和Cantley，2007年). 通过PCR诱变产生LKB1 S325A、S428A和S325/S428A突变体，并通过测序进行验证。FLAG-ERK2构造由Melanie Cobb博士善意提供。

细胞培养、转染和逆转录病毒感染

在含有10%胎牛血清（FBS）（Gemini Bio-products）的RPMI培养基（MediaTech）中培养SK-Mel-28、UACC62、UACC257、SK-Mel-31和MeWo细胞。稳定表达B-RAF WT或V600E突变体的C140细胞(Kim等人，2006年)在含有10%FBS和2μg/ml强力霉素（Clontech）的RPMI培养基中培养。永生野生型和LKB1缺陷型MEF是Nabeel Bardeesy博士（马萨诸塞州总医院）赠送的，并在含有10%FBS的DMEM培养基中培养。Cos-7和HeLa细胞是从ATCC中获得的，并培养在含有10%FBS的DMAM培养基中。对于逆转录病毒转染，如前所述生成两栖逆转录病毒(Zheng和Cantley，2007年). 当需要时，通过使用2μg/ml嘌呤霉素（Sigma）进行选择，获得并保持稳定的种群。对于B-RAF RNA干扰，包含针对B-RAF的短发夹RNA（Mu-A和com-4，sh1和sh2）的pSuper-retro从David Tuveson博士处获得，如前所述(Hingorani等人，2003年). 对于MEK1和ERK2基因敲除，含有shRNAs的pSM2C是Stephen Elledge博士的礼物。对于LKB1干扰，从Sigma购买含有抗人LKB1 shRNAs的pLKO构建物。在药物治疗中，如图所示，在添加各种药物之前，用新鲜培养基替换细胞。

蛋白质印迹和免疫沉淀

使用含有HEPES pH 7.0、150 mM NaCl、1%NP-40、1 mM EDTA、50 mM NaF、10 mMβ-甘油磷酸、10 nM花萼蛋白A、1 mM-Na的裂解缓冲液制备细胞裂解物三VO4和蛋白酶抑制剂，并使用Bradford方法（Bio-Rad）通过蛋白质浓度进行标准化。对于蛋白质印迹，蛋白质样品在8%-12%的SDS-PAGE上分离，并转移到PVDF膜（Millipore）上。将膜封闭在含有5%脱脂乳的TBST中，根据抗体制造商的说明与初级抗体孵育，然后与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔或抗小鼠IgG（Chemicon）孵育，并增强化学发光检测（Perkin Elmer）。对于免疫沉淀，细胞裂解物与一级抗体或抗FLAG M2亲和凝胶在4°C孵育过夜，然后与蛋白A/G琼脂酶在4°C孵育额外1小时（如适用）。用裂解缓冲液洗涤珠子三次，并在Laemmli样品缓冲液中煮沸，通过SDS-PAGE和Western blotting分析免疫复合物。对于GST下拉，细胞裂解物与GSH琼脂糖珠（法玛西亚）孵育过夜。

质谱法

切除用不同处理从HEK293细胞中分离的含有FLAG-LKB1的考马斯染色的SDS-PAGE凝胶带，并使用LTQ 2D线性离子阱质谱仪（ThermoScientific）在数据依赖性采集和正离子模式下进行凝胶内消化和反相微毛细管LC/MS/MS。使用Sequest（蛋白质组学浏览器，ThermoScientific）对串联靶点和诱饵（反向）Swiss-Prot蛋白质数据库进行MS/MS光谱搜索，并对Ser/Thr/Tyr磷酸化（+79.97）和样品处理伪影Met氧化（+15.99）和Cys烷基化（+57.02）进行差异修改。如果磷酸化和非磷酸化肽序列最初通过以下Sequest评分阈值，则对其进行鉴定：1+离子，Xcorr≥2.0 Sf≥0.4，P≥5；2+离子，Xcorr≥2.0，Sf≥0.4，P≥5；靶蛋白数据库中的3+离子，Xcorr≥2.60，Sf≥0.4，P≥5。手动检查通过的MS/MS光谱，以确保b条-和年-碎片离子与指定的序列和修饰位点对齐。使用GraphMod软件（蛋白质组学浏览器）辅助确定磷酸化的确切位点。对于磷酸化肽信号水平的相对定量，使用无同位素（无标签）方法，首先在靶离子MS/MS（TIMM）实验或数据依赖性采集期间整合每个MS/MS测序事件的总离子计数（TIC）。对于每个磷酸化位点（Ser325和Ser428），根据以下方程计算来自PMA和U0126处理的样品的磷酸化肽信号（磷酸化形式的TIC）与总肽信号（磷酸化形式的TIC+非磷酸化形式的TIC）的比率：

技术信息C类PO4（PO4）/（技术信息C类PO4（PO4）+技术信息C类非PO4)=磷酸肽信号比率

然后根据以下等式将PMA处理样品中的Ser325和Ser428位点的比率与未处理样品和U0126处理样品中相同的磷酸肽比率进行比较：

[(R（右）PO4（PO4）U型0126/R（右）PO4（PO4）PMA）-1]×100=治疗后磷酸化水平变化的%

虽然由于总蛋白水平和样品环境不同，直接比较不同实验之间的磷酸肽信号并不准确，但比较磷酸化和非磷酸化肽形式的比率是对总肽信号（修饰和未修饰）以来信号水平变化的准确测量已测量。上述计算是使用Microsoft Excel和内部开发的自动化软件Protein Modification Quantifier v1.0（马萨诸塞州波士顿Beth Israel Deaconess医疗中心）手动进行的。

体外MAP激酶测定

表达重组GST-LKB1（D194A）蛋白，纯化自大肠杆菌，并在γ存在下与重组活性ERK蛋白（Stratagene）孵育-3237°C下P-ATP 30分钟。对于使用HA-LKB1进行的激酶分析，HEK293细胞转染HA-LKB1-WT或S325A构建物，并且在激酶分析中使用免疫沉淀的HA-LKB1蛋白。

细胞增殖和软琼脂分析

用于细胞增殖分析，2×105将细胞接种在6孔板上，一式三份，并在全培养基中生长。以24小时间隔4天，对细胞进行胰蛋白酶消化，并通过库尔特计数器对每个孔中的细胞数量进行计数。对于软琼脂分析，细胞悬浮在完全培养基中0.3%的琼脂糖中，并在6孔培养板（3×104细胞/孔）。3周后，用碘硝基四氮唑（Sigma）对菌落进行染色并拍照。使用NIH图像软件对菌落数量进行计数。

免疫组织化学分析

人类黑色素瘤组织芯片来自美国Biomax（Rockville MD）。福尔马林固定石蜡包埋组织芯片在二甲苯中脱蜡并在一系列分级醇中水合。在高压锅中使用柠檬酸盐缓冲液进行热诱导表位抗原检索。染色采用DAKO LSAB+碱性磷酸酶检测系统，以永久红为色原。病理学家斯科特·格兰特博士对结果进行了评估。磷酸化ERK和磷酸化AMPK的免疫反应性在阴性、弱、中度和强染色的0至3+范围内进行评分。

补充材料

01

单击此处查看。（11M，pdf）

致谢

我们感谢Reuben Shaw博士、Nabeel Bardeesy博士、David Tuveson博士和Melanie Cobb博士提供的试剂、Lisa Freimark提供的质谱分析协助、Li Zhang和Szexian Lee提供的技术协助、Yang Qing Xu博士和Cantley实验室成员进行的有益讨论。我们还要感谢Shailender Nagpal帮助创建定量质谱分析软件。B.Z.由美国银行联合信托公司Charles a.King Trust的Charles a.King Trust博士后奖学金资助。这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款GM56203和CA102694至L.C.C、K99CA133245至B.Z.以及UO1 CA84313和RO1 CA93947至L.C.的支持。

脚注

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

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