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(打、击等的)一下。作者手稿；PMC 2010年7月1日发布。
以最终编辑形式发布为：
(打、击等的)一下。2009年7月；40(7): 2539–2545.
2009年5月14日在线发布。 数字对象标识：10.1161/冲程108.543991
预防性维修识别码：PMC2704258型
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院15388
PMID：19443805

重组T细胞受体配体（RTL）治疗实验性卒中

Sandhya Subramanian阶，理学硕士，†,1 张冰（Bing Zhang），医学博士，†,2,* 小坂康浩，医学博士，2 格雷戈里·巴罗斯，博士，三 马乔丽·格拉芙，医学博士，2,5 阿瑟·范登巴克，博士，1,三，4 帕特里夏·D·休恩，博士，2和哈利娜·奥夫纳，医学博士1,2,三
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

背景和目的

实验性中风诱导免疫反应的双相效应，包括外周白细胞的早期激活，随后是严重的免疫抑制和脾脏和胸腺的萎缩。同时，包括T淋巴细胞和B淋巴细胞在内的多种炎症细胞的涌入加剧了正在发展的梗死。中风的这些特征促使我们使用R（右）重组的T型细胞受体L（左）igands（RTL），部分MHC II类分子与髓磷脂肽共价结合。我们验证了RTL可以改善脑缺血结局而不会加重外周免疫系统功能缺陷的假设。

方法

在大脑中动脉闭塞（MCAO）后，向C57BL/6小鼠皮下注射每天四次的RTL，评估大脑中的病变大小和细胞组成，并评估脾脏和胸腺中的细胞数量。

结果

RTL551（I-A）治疗b条与MOG-35−55肽相关的分子）可将皮质和总卒中病灶大小减小约50%，抑制炎症细胞的积聚，尤其是巨噬细胞/活化的小胶质细胞和树突状细胞，并缓解脾脏萎缩。RTL1000（与人类MOG-35−55肽相关的HLA-DR2部分）治疗同样减少了HLA-DR1转基因小鼠的中风损伤大小。相比之下，使用非神经抗原肽或不匹配MHC II类部分的对照RTL对中风损伤大小没有影响。

结论

这些数据首次证明了在缺血后使用神经抗原特异性免疫调节剂成功治疗实验性中风，这表明了在人类中风中的治疗潜力。

关键词：中风、自身反应性T细胞、重组TCR配体、免疫治疗

简介

炎症因子的作用及其在中风组织损伤中的作用已经得到了很好的证实。重度脑缺血后，与血脑屏障（BBB）破坏相关的炎症细胞迅速积聚(1-三). 这些浸润细胞，包括中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞(4)，加重进展中的缺血性损伤。虽然淋巴细胞和适应性免疫的重要性尚未明确，但缺乏T和B细胞的小鼠比正常小鼠的梗死面积更小(5,6). 此外，脑缺血首先通过大量激活激活全身免疫系统，然后通过以脾脏和胸腺萎缩和免疫活性细胞丢失为标志的免疫抑制激活全身免疫(7-11). 因此，缺血后成功的免疫治疗需要减少炎症损伤，同时支持外周免疫的存活。

R（右）重组的T型细胞受体L（左）igands（RTL）是由连接到抗原肽的共价连接的β1和α1链组成的部分MHC II分子。这些独特的分子被设计为肽特异性T细胞TCR的最小配体。与可诱导T细胞活化和凋亡的四域MHC II分子不同(12)，RTL是部分激动剂，使自身反应性T细胞偏离非致病性(13,14). 我们之前证明RTL可以预防和/或逆转实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的临床症状(15-17)、胶原蛋白诱导的关节炎(18)和实验性自身免疫性葡萄膜炎(19). RTL551（I-A）的最新研究b条与小鼠髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白（mMOG-35−55肽）共价连接的分子显示了MOG-35–55诱导的EAE的显著逆转、致病性CNS细胞的减少、内皮细胞粘附分子（ICAM和VCAM）的下调以及CNS趋化因子/受体的广泛减少(20).

一个流行的假设是，脑缺血破坏了血脑屏障，从而暴露了中枢神经系统抗原，促进了抗中枢神经系统反应的发展(21). 最近的报告表明，通过粘膜给药髓鞘碱性蛋白（MBP）或mMOG-35−55肽诱导T细胞对CNS抗原的耐受，可以减少实验性卒中小鼠的梗死面积和CNS自身免疫，并改善临床结局(22-25). 基于这些观察结果和RTL对EAE的影响，我们假设用RTL551治疗实验性卒中会通过神经抗原特异性机制减少梗死体积。

材料和方法

动物

这项研究是根据国家卫生研究所的实验动物使用指南进行的，研究方案得到了机构护理和使用委员会的批准。所有实验均使用年龄匹配、性成熟（20−25g）的雄性小鼠（C57BL/6，Charles River；或从Chella David博士处获得的HLA-DRB1*1502小鼠，如前所述(26,27)). 根据机构指南，这些老鼠在波特兰俄勒冈州退伍军人事务医疗中心繁殖和饲养。

RTL建设和生产

RTL分子由MHC II分子的α1和β1结构域组成，表达为具有或不具有抗原氨基末端延伸的单一多肽(28,29)：RTL551=I-Ab条与小鼠MOG-35−55肽（MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK）连接；RTL553=重组I-Ab条与I-Ea-52−68（3Kp）肽（ASFEAQKAKANKAVD）连接(30,31)); RTL342M=HLA-DR2与小鼠MOG-35−55（mMOG35−五十五）肽连接；RTL1000=HLA-DR2与人类MOG-35−55（hMOG35−五十五）肽（MEVGWYRPPFSRVVHLYRNGK）相连。RTL已构建从头开始的或通过先前构建物的顺序定点突变(20). 蛋白质纯化如前所述(28,29)每升细菌细胞培养物中纯化蛋白的产量为30-40mg。

RTL治疗

将小鼠随机分为RTL 551 0.1 ml（1mg/ml，在再灌注开始时皮下注射，然后在再灌注24、48和72小时时给药，共4个治疗组）、RTL553、RTL342M、RTL1000或载体（Tris-HCl，pH=8.5）。为了确定RTL 551是否改变了动脉血压或血气，分别对各组小鼠进行RTL 553或载体（n=3）给药，然后连续监测两小时。治疗后两小时，在这些队列中测量动脉血气、渗透压和电解质。

短暂性大脑中动脉闭塞（MCAO）模型

如前所述，在异氟醚麻醉的雄性小鼠中使用60分钟的管腔内灯丝阻断进行短暂MCAO(6,7). 在整个MCAO手术过程中，颞肌温度保持在35.5−37.5°C，并配有加热灯。缺血内激光多普勒血流仪（英国牛津摩尔仪器有限公司）证实了闭塞的充分性。假手术小鼠经历了相同的手术过程，不包括血管开放和纤维插入。在再灌注96小时的深度麻醉下采集组织。如前所述，通过标准三苯基四唑氯化物（TTC，Sigma-Aldrich）染色测定脑梗死面积，并通过Sigma Scan Pro5软件（Jandel，San Real，CA，USA）进行数字量化(7). 在其他实验中，小鼠通过升主动脉进行盐水灌注，以去除非实质性细胞。大脑被分为缺血的右半球和非缺血的左半球，然后通过150米的屏幕进行机械分离。如前所述，通过Percoll梯度离心分离CNS单核细胞(32).

脾、胸腺和血液中细胞的分离

从溶媒和RTL处理的假小鼠和中风小鼠中分离出脾脏和胸腺。将组织通过100μm尼龙网筛制备单细胞悬浮液。使用RPMI清洗细胞，并使用1X红细胞裂解缓冲液（加州圣地亚哥eBioscience）裂解红细胞。将细胞清洗两次，计数并重新悬浮在含有10%FBS的刺激培养基中。对于实时聚合酶链反应，将脾细胞制粒，快速冷冻并储存在−80C下，直到测试。对于FACS染色，在添加特定抗体之前，用染色介质（1X PBS、0.5%BSA、0.02%叠氮化钠）清洗细胞。在3mg/ml EDTA中采集心脏血，红细胞溶解后造粒，洗涤、计数，并在染色介质中再次悬浮用于FACS染色。

用FACS分析细胞群

进行四色（FITC、PE、PI、别藻蓝蛋白）荧光流式细胞术分析，以确定大脑和血液单核细胞的表型。用染色介质清洗细胞，并用以下单克隆抗体的组合在冰上染色20分钟：CD3e（145−2C11）、CD4（L3T4）、CD8（Ly-2）、CD11b（M1/70）、CD11 c（HL-3）和CD19（1D3）。用单克隆抗体培养后，用FACSCalibur（BD Biosciences）获得细胞。选择正向和侧向散射参数来识别淋巴细胞。使用碘化丙啶鉴别法将死细胞选通。使用FCS express软件（De Novo）分析数据。在每次实验中，用适当的同型对照抗体对细胞进行染色，以建立背景染色，并在计算阳性细胞百分比之前设置象限。

统计分析

通过Student t检验确定车辆组和RTL组评估参数之间的统计差异。p≤0.05的值被认为是显著的。数据以平均值±SD表示。

结果

RTL551治疗显著减少再灌注96小时后梗死面积

RTL 551治疗在两个小时的观察窗内没有改变动脉血压，两小时时与车用小鼠（Veh）相比没有差异（RTL 80±6 mmHg；Veh 75±8，n=3/组）。同样，动脉血pH值（RTL 7.33±0.03；Veh 7.34±0.02）、pCO2（RTL 49±5 mmHg；Veh 41±5）或pO2（RTL 160±17 mmHg，Veh 178±4）也没有差异。RTL组与溶媒治疗组的血浆电解质、葡萄糖和渗透压也没有差异（数据未显示）。每天用RTL551治疗四次，导致皮质梗死体积减少约50%（49.1±12.6，溶媒vs.25.6±18.4，RTL治疗小鼠，p=0.009），但纹状体梗死体积没有减少(图1A). RTL551治疗组小鼠的总梗死面积为26.5±12.4，而对照组为39.7±11.0（p=0.04）。这些数据表明，当在MCAO诱导后给药时，RTL551可以成功地减少皮层和总中风病变体积。

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RTL治疗对再灌注96h后MCAO诱导的梗死体积的影响。短暂性MCAO后，每天用溶媒（TRIS-HCl）或100μg RTL治疗四次，梗死体积以非缺血对侧半球的百分比进行量化。注意，RTL551（A）治疗的C57BL/6小鼠梗死体积显著减少（*），但RTL553（B）或RTL342M（C）治疗的小鼠梗死体积没有显著减少，而RTL1000（D）治疗的DRB1*1502（DR2）小鼠梗死体积明显减少。数据以单个小鼠的平均值±SD表示。

中风的RTL治疗需要一种神经抗原肽和匹配的MHC部分

为了评估肽的特异性，用RTL553治疗C57BL/6小鼠，RTL551具有与RTL552（I-A）相同的MHC部分b条)但与非神经抗原肽（I-Ea-52−68）相连。如所示图1BRTL553对MCAO小鼠的皮层或纹状体梗死体积无影响（皮层为39.8±23.4，纹状体为93.1±9.0）。为了解决RTL MHC II结构域对治疗的贡献，用RTL342M治疗MCAO小鼠，RTL342 M与RTL551具有相同的mMOG-35−55肽，但MHC II部分不同（HLA-DR2 vs.I-ab条). 与RTL553类似，用RTL342M治疗MCAO未能减少梗死体积(图1C). 这些数据表明，成功的中风RTL治疗需要神经抗原肽（mMOG-35−55）和治疗小鼠的自体MHC部分。

RTL1000减少DR2-Tg小鼠的梗死面积

我们进一步评估了含有与hMOG-35−55肽共价连接的HLA-DR2部分的人源化RTL1000对DR2小鼠MCAO的治疗活性。如所示图1DRTL1000的四个治疗组显著降低了皮质梗死体积（27.7±18.2，溶媒组对5.3±5.2，RTL1000治疗组）。这些数据表明，RTL1000含有一个神经抗原肽和一个匹配的MHC II部分，可以显著降低不同小鼠品系皮层中中风损伤的大小，进一步证明了上述RTL治疗参数。

RTL551抑制缺血脑内炎症细胞，尤其是活化的小胶质细胞和巨噬细胞的流入

我们假设RTL551治疗可以减少中风后炎症细胞向大脑的浸润。事实上，在MCAO后96小时，RTL551治疗减少了缺血同侧半球大脑单个核细胞总数的64%（从220000减少到80000/只小鼠）和存活白细胞总数的52%（从39600减少到19200/只鼠），细胞计数低得多（总脑细胞数为～60000，存活白细胞数为~10000）从未受影响的对侧半球恢复，分别来自溶媒和RTL治疗小鼠。使用四色流式细胞术，我们发现在溶媒和RTL治疗小鼠的缺血和未受影响半球中，大多数细胞类型的百分比具有可比性。然而，RTL551治疗显著下调CD45的表达你好CD11b型你好在脑缺血右半球代表巨噬细胞和活化的小胶质细胞的细胞（车辆治疗小鼠为44%，RTL551治疗小鼠为15%，图2A). 考虑到回收的活白细胞的绝对数量，CD45的减少你好CD11b型你好RTL551处理后的细胞（83%）甚至更显著（从17424到2880/小鼠，图2B和表1). RTL551治疗还导致树突状细胞（DC）减少（81%），而缺血脑中其他细胞群的绝对数量减少（-35%至-59%，表1). 相反，这些人群在左侧非缺血侧的基线水平要低得多（1.4−26%），相对而言受RTL551治疗的影响较小（−33至+137%，表1).

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显示RTL551治疗后左半球（非缺血性）和右半球（缺血性）巨噬细胞/活化小胶质细胞的百分比（右上象限框）（A）和绝对数（B）减少的代表性点图。

表一

MCAO后96小时，经RTL551（n=1组3个大脑）处理的小鼠左侧（非缺血）和右侧（缺血）半球浸润细胞的绝对数量示例。

左侧（非缺血性）右侧（缺血）
车辆RTL551型%减少车辆第551页%减少
CD3（T细胞）97230137↑59438435
CD11b（常驻小胶质细胞/巨噬细胞）7895687413309671513051
CD45hiCD11b+（活化的小胶质细胞/巨噬细胞）248259017,4242,88083
CD11c（直流）75770514896081
B220（B电池）21061402338039330259
DX5（NK细胞）223872↑1989651

RTL治疗可部分恢复MCAO后的脾细胞数，但不能恢复胸腺细胞数

为了评估RTL551治疗对中风诱导的萎缩的影响，对缺血后溶媒和RTL治疗小鼠的脾脏和胸腺中的细胞数进行了计数，并与各自的假手术对照组进行了比较。正如预期的那样，MCAO在给药组中诱导了脾脏和胸腺细胞数量的显著减少(图3). 有趣的是，在再灌注96h后，RTL551治疗组与载体治疗组小鼠（4.6±3.5，载体对17.1±17.3，RTL治疗组小鼠，p=0.02）的脾脏中活细胞计数显著增加。相反，RTL553或RTL342M治疗并没有改善脾细胞计数（数据未显示）。RTL551均未改变MCAO诱导的胸腺细胞计数急剧减少(图3)或RTL553（未显示）与车辆处理。

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RTL551给药后假小鼠和MCAO小鼠A）脾脏和B）胸腺的细胞计数。数据以单个小鼠的平均值±SD表示。

RTL551治疗不影响外周细胞亚型的分布

考虑到RTL551治疗小鼠脾细胞数量的部分恢复，我们追踪了特定脾细胞类型的存活情况。如所示表2RTL治疗不会影响脾脏中T细胞、B细胞、巨噬细胞或DC的百分比，尽管车辆处理的MCAO-与假手术小鼠相比，DC降低。如所示表3，我们确认了之前的发现(8)与假手术小鼠相比，MCAO增加了车用MCAO小鼠的循环CD11b+巨噬细胞，并进一步注意到RTL治疗限制了这种增加（车用MCOA小鼠增加21%，RTL551处理MCAO鼠增加11%）。

表2

MCAO后96h载体和RTL551处理小鼠脾脏细胞表型分布

车辆
RTL公司
假（n=3）MCAO（n=7）假（n=4）MCAO（n=7）
CD3（CD3）+35.1±8.848.8±12.733.9±2.241.3±12.5
CD4细胞+21.6±4.826.9±7.519.9±1.522.7±5.7
CD8细胞+13.5±3.620.1±5.815.9±3.219.6±8.5
CD11b型+8.5±5.85.2±1.96.8±1.56.2±3.2
CD11c公司+2.4±1.20.6±0.5*2.1±0.21.1±0.6
CD19编号+46±9.236.7±11.850.5±2.944.8±6.7
PI公司+13.4±1.620.1±12.114.2±5.215.1±6.8
*与RTL或载体处理的假手术小鼠相比有显著差异

表3

MCAO后96h载体和RTL551处理小鼠血液中细胞表型的分布

车辆
RTL公司
假（n=3）MCAO（n=9）Sham（n=4）MCAO（n=7）
CD3（CD3）+16.8±7.411.6±3.0*22.6±4.412.2±4.8*
CD4细胞+9.3±4.25.4±1.5*12.2±3.76.9±3.0*
CD8（CD8）+7.6±2.56.2±1.810.0±2.55.5±1.9*
CD11b型+18.8±6.939.2±14.1*15.5±5.227.7±7.7*
CD11c公司+1.0±0.31.0±1.70.9±0.71.0±0.7
CD19编号+43.0±9.123.4±12.7*37.2±11.726.2±14.4
*与RTL或车用治疗、假手术小鼠相比有显著差异

讨论

我们的研究首次证明，MCAO发病后使用RTL治疗可以减小皮层和总梗死面积，抑制炎症细胞，特别是活化的巨噬细胞/小胶质细胞和DC向缺血后大脑的浸润，并部分保留MCAO后典型消融的脾细胞数量。这一结果对C57BL/6雄性小鼠的RTL551治疗是特异性的，并使用“人源化”RTL1000构建体治疗HLA-DR2-Tg小鼠的MCAO进行了验证。结果清楚地表明，RTL的治疗活性需要一种神经抗原肽（小鼠或人类MOG-35−55），该肽与MHC部分紧密结合，与治疗小鼠菌株（I-ab条C57BL/6小鼠和DR2-Tg小鼠的HLA-DR2）。相反，用含有I-A的RTL553治疗C57BL/6小鼠b条与I-Ea-52−68（非神经抗原肽）偶联，与mMOG-35−55肽偶联的由HLA-DR2（非匹配MHC II类）组成的RTL342M没有治疗作用。

除了已知可诱导C57BL/6和DR2小鼠株炎症的RTL结合的MOG-35−55肽之外(20,27)，目前尚不清楚其他哪些神经抗原肽也可能对MCAO有效。中风治疗活动的关键特征似乎是抗原性与自身MHC II分子结合，以及在脑梗塞区域的表达。这一重要问题有待进一步研究。治疗RTL时需要匹配的MHC部分，这表明治疗活性可能需要完整的RTL分子直接结扎神经抗原反应性T细胞，而不是宿主APC内化和重新呈现RTL结合的MOG肽。

先前的一项研究详细评估了梗死后炎性细胞流入大脑的情况(4). 虽然T细胞、B细胞、中性粒细胞和巨噬细胞都存在，但在闭塞后48、72和96小时观察到的主要浸润细胞群是巨噬细胞/活化的小胶质细胞群，FACS可以将其识别为CD45你好CD11b型你好我们研究中的这一人群在闭塞后96小时时占活白细胞群的约45%，这与Stevens研究一致。在梗死面积缩小的同时，RTL551治疗减少了右脑半球的所有浸润细胞类型，但特别抑制（>80%）CD45的浸润你好CD11b型你好巨噬细胞/活化的小胶质细胞和CD11c DC。中风的这一结果与先前描述的RTL在实验性多发性硬化期间阻止细胞浸润中枢神经系统的作用非常相似(20). 外周移行细胞的减少也可能有助于解释RTL诱导的中风第二免疫抑制期脾脏细胞数量的保存。

关于RTL在MCAO后抑制病变大小的能力，尚未解决的主要问题是建立其可能的工作原理的概念框架。实验性卒中中发生的病变部分是通过炎性细胞的浸润传播的，包括T细胞、B细胞、中性粒细胞和活化的巨噬细胞。我们以前的研究表明，T细胞和B细胞缺陷SCID小鼠的皮层卒中病变面积减小(6)以及其他研究表明T细胞而非B细胞或中性粒细胞是必要的炎症因子(5). 此外，粘膜诱导T细胞对髓磷脂抗原的耐受或将耐受的T细胞转移到接受MCAO的幼年小鼠，导致梗死面积和IFN-γ产生细胞数量减少，分泌IL-10和TGF-β的细胞增加(21-23,25).

我们的工作假设是，正常的脑抗原，如MOG，在中风病变中以更高的量释放，并在炎症环境中呈现给免疫浸润细胞，可能是在吞噬细胞，如小胶质细胞、巨噬细胞和树突状细胞摄入受损的脑组织后。在再灌注6小时内增加外周免疫细胞总体激活的快速脑脾信号(7)可能会使许多不同特异性的活化T细胞浸润中风病变部位。这些对MOG或其他脑抗原具有特异性的T细胞可能会被触发，招募其他炎性细胞进入病灶，从而增加周围组织的损伤。这种情况在一定程度上代表了T细胞识别和响应自身抗原的天然能力，与Zhang等人描述的骨骼和肠道再灌注损伤中涉及的非肌凝蛋白重链II a和C型的天然IgM抗体在概念上没有不同(33).

RTL治疗可能通过不同的机制在体内诱导T细胞对MOG-35−55肽的耐受，但其结果与粘膜给药MBP诱导的结果相同(22)或MOG-35−55肽(23). 我们之前确定，RTL特异性靶向髓磷脂特异性T细胞，并深刻改变其功能特性，从促炎细胞转变为分泌IL-10、IL-13和TGF-β3的抗炎细胞(16). 因此，RTL“油化”MOG特异性T细胞可以抑制其他T细胞进入中枢神经系统，阻止中风损伤部位释放促炎细胞因子，并减少活化巨噬细胞/小胶质细胞的浸润。RTL抑制中风的这一解释支持了我们之前的观察，即在免疫神经抗原之前用RTL预处理过的小鼠能够有效防止随后的EAE诱导(34). 此外，通过缩短早期脑脾激活，对MOG特异性T细胞的RTL调节可能有助于观察到的脾细胞数量的部分保存。

总之，我们在这里证明了髓鞘抗原特异性免疫调节剂（重组TCR配体，RTL551和RTL1000）的治疗活性，这些药物在MCAO诱导后给药时有效。RTL治疗大大减少了炎症细胞（尤其是巨噬细胞和DC）流入缺血半球的数量，并部分防止了伴随中风下游免疫抑制期的脾脏萎缩。未来的研究正在进行中，以确定在MCAO后多久可以给予RTL并仍然发挥治疗作用。RTL1000是一种人源化RTL，由与HLA-DR2部分共价连接的MOG-35−55肽组成，目前正在进行MS临床试验，可能对人类中风患者的治疗有用。

致谢

作者感谢Eva Niehaus女士准备手稿。这项工作得到了美国公共卫生服务NIH拨款NS33668、NRO3521、NS49210、AI43960和NS47661的支持；国家多发性硬化症协会拨款RG379-A-4；南希·戴维斯无墙中心；以及退伍军人事务部生物医学实验室研发服务。

脚注

利益冲突披露

Offner博士、Vandenbark博士和OHSU在Artielle ImmunoTherapeutics，Inc.公司拥有重大财务利益，该公司可能对这项研究和技术的结果具有商业利益。OHSU和波特兰VAMC利益冲突研究委员会已经审查和管理了这种潜在的利益冲突。

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