实验分子医学。2008年4月30日；40(2): 229–236.
siRNA靶向敲除分析检测到亮氨酸-tRNA合成酶1（LARS1）过度表达在肺癌细胞生长和迁移中的意义
,1,2,* ,三，* ,1,2 ,1,2 ,1,2和
1,2 Seung-Hun Shin先生
1韩国首尔天主教大学医学院微生物系，137-701，韩国。
2韩国天主教大学医学院基因组多态性综合研究中心，韩国首尔137-701。
Ho-Shik Kim先生
三韩国首尔天主教大学医学院生物化学系，137-701。
Seung-Hyun Jung先生
1韩国首尔天主教大学医学院微生物系，137-701，韩国。
2韩国天主教大学医学院基因组多态性综合研究中心，韩国首尔137-701。
许海东
1韩国首尔天主教大学医学院微生物系，137-701，韩国。
2韩国天主教大学医学院基因组多态性综合研究中心，韩国首尔137-701。
永博贞
1韩国首尔天主教大学医学院微生物系，137-701，韩国。
2韩国天主教大学医学院基因组多态性综合研究中心，韩国首尔137-701。
Yeun Jun Chung先生
1韩国首尔天主教大学医学院微生物系，137-701，韩国。
2韩国天主教大学医学院基因组多态性综合研究中心，韩国首尔137-701。
1韩国首尔天主教大学医学院微生物系，137-701，韩国。
2韩国天主教大学医学院基因组多态性综合研究中心，韩国首尔137-701。
三韩国首尔天主教大学医学院生物化学系，137-701。
通讯作者。 *这些作者为这项工作做出了同等贡献。
摘要
肺癌发生的分子机制及其侵袭性在很大程度上仍不清楚。为了揭示与肺癌发生和行为相关的生物标志物，我们利用基于退火控制引物（ACP）的GeneFishing系统，通过与正常肺上皮细胞系CCD-25Lu的比较，筛选了A549肺癌细胞系中新的差异表达基因（DEG）。在DEG中，亮氨酸-tRNA合成酶1（LARS1）的过度表达是显著的，免疫印迹和实时定量RT-PCR分析证实了这种上调。除A549细胞系外，原发性肺癌组织中LARS1 mRNA的表达水平也高于其正常对照组织。为了探讨LARS1在肺癌中过度表达的致癌潜能，我们通过治疗siRNA来敲除LARS1并观察其肿瘤行为。LARS1敲除细胞通过跨孔膜迁移并在软琼脂和培养板中形成菌落的能力降低。综上所述，这些发现表明LARS1可能在肺癌细胞的迁移和生长中发挥作用，这表明其在肺癌发生中的潜在意义。
关键词：氨基酰-tRNA合成酶、细胞运动、细胞增殖、亮氨酸-tRNA连接酶、肺肿瘤、致癌基因、RNA、小干扰
材料和方法
细胞培养
在含有10%FBS（Hyclone，Logan，UT）和10 U/ml青霉素链霉素（Sigma，St.Louis，MO2.
差异表达基因（DEGs）的筛选
为了筛查A549细胞中的DEG，我们根据制造商的说明使用了基于ACP的GeneFishing PCR试剂盒（Seegene，首尔，韩国）。简而言之，使用Moloney鼠白血病病毒逆转录酶（Promega，Madison，WI）和dT-ACP1（5'-CTGGAATGCTGACTACGATIIIIT（18）-3'）引物，从CCD-25Lu和A549细胞系中提取总RNA，合成第一链cDNA。使用dT-ACP2和任意ACP的引物，通过以下一个循环反应合成第二个序列的cDNA；依次为94℃1 min、50℃3 min和72℃1 min。在合成第二链cDNA后，进行第二阶段PCR扩增，如下所示：；94℃40次循环40s、65℃40次、72℃40次，然后在72℃下最终拉伸5min。扩增的PCR产物在含有溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶中分离。使用GENCLEAN II Kit（Q-BIO基因，加利福尼亚州卡尔斯巴德）从凝胶中重新扩增并提取带强度不同的扩增cDNA片段，并使用ABI PRISM 310遗传分析仪（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）直接测序。
实时定量RT-PCR（qRT-PCR）
使用寡聚（dT）引物和SuperScript II逆转录酶（Invitrogen，Carlsbad，CA）将提取的总RNA逆转录为cDNA。用含有cDNA、1×SYBR Green的混合物进行qRT-PCRTbr公司聚合酶混合物（芬兰FINNZYMES）、ROX（0.5×）和使用Mx3000P QPCR的引物（加利福尼亚州拉霍亚市斯特拉赫纳）。GAPDH被用作每个程序的内部控制。热循环为95℃下一个循环10min，然后是95℃下40个循环10s，60℃下30 s，72℃下30秒。扩增PCR反应后，进行55℃至95℃（Δ0.5℃/s）的熔融曲线分析。LARS1号机组特异性引物如下；正向引物5'-ATGCGGAAAAAAGGAAGGACAG-3'和反向引物5'-CAGGCCAAAGGAAACAGACAAC-3'。GAPDH公司特异性引物如下；正向引物5'-GCGGGCTCTCCCAGACATCAT-3'和反向引物5'-CAGCCCCGCTCAAAGGTG-3'。采用ΔΔCt法进行相对定量(Livak和Schmittgen，2001年). 信号强度比(LARS1号机组/GAPDH公司)并与正常肺组织进行比较。所有qRT-PCR实验重复两次，并表示为比值（肿瘤/正常）±SD的平均值。对于原发性肺癌，由于样本的限制，我们进行了单一实验。
击倒LARS1号机组表达
隐形小干扰RNA（siRNA）LARS1号机组合成如下；5'-AAAAUGAAGGCGUCCAUUCAUAUG-3'。阴性对照的加扰RNA购自Invitrogen。用于击倒LARS1号机组表达时，将A549细胞以400000个细胞/孔的浓度放置在6孔板中，并培养过夜。使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）将50 nM siRNA转染细胞。初始培养10小时后，我们用新鲜培养基替换培养基，并培养14小时。
LARS1的Western blot分析
在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳细胞蛋白（每车道30µg）。将分离的蛋白质转移到PVDF膜上，该膜在TBST（20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl和0.1%吐温20，pH 7.5）中用5%的非脂奶粉封闭，然后用抗LARS1抗体（英国剑桥Abcam）和抗β-肌动蛋白抗体（密歇根州圣路易斯Sigma）孵育过夜。用TBST清洗后，PVDF膜在室温下与稀释的HRP-结合抗兔IgG孵育1h。然后使用增强化学发光（ECL）系统检测印迹（Amersham-Pharmacia Biotech，Braunschweig，德国）。
集落形成分析
进行集落形成试验以探讨LARS1号机组如前所述，在A549中拆除(Crnković-Mertens等人，2006年). 用siRNA转染20小时后，将A549细胞接种在6孔板中。生长6天后，用PBS洗涤细胞，并用在20%甲醇中的0.5%结晶紫染色。在放大40倍的显微镜下对直径大于1 mm的细胞集落进行计数。
软琼脂试验
探索LARS1号机组对于A549细胞的非凤尾鱼依赖性生长，如前所述进行软琼脂试验(Zhang等人，2006年). 用siRNA转染20小时后，在六孔培养板中现有的0.6%底部低熔点琼脂糖顶部的每个孔中用RPMI1640将1000个细胞接种在0.35%低熔点的琼脂糖中。在37℃、5%CO中孵育2周后2，菌落计数方法与菌落形成试验相同。
迁移分析
迁移分析如前所述进行(Lee等人，2007年)使用24孔格式的跨井室（Becton Dickinson Labware，新泽西州富兰克林·迪金森），孔径为8µm，稍加修改。简言之，将悬浮在400µl无血清RPMI1640中的A549细胞接种到每个培养箱的上部，而将500µl含有10%FBS的RPMI1640.在37℃培养24小时后，用20%甲醇中0.5%结晶紫对细胞进行染色。用棉签清除过滤器上表面上的非聚集细胞。在10个显微镜下计数迁移细胞，每个孔5个物镜。
结果
肺癌细胞系中的二甘醇
为了鉴定肺癌细胞系中的二甘醇，我们采用了基于ACP的GeneFishing PCR，并比较了A549和CCD-25Lu细胞系之间的带强度。通过对扩增cDNA片段的密度分析，我们在两个细胞系之间显示不同强度的条带中选择了8个片段。从琼脂糖凝胶中洗脱八条扩增子带，重新扩增并测序。这些序列用于BLAST搜索，以确定其基因注释。根据BLAST分析，六个是已知基因，另外两个是未知基因(). 在这6个基因中，我们选择了LARS1号机组为了进一步评估其致癌潜能的功能，因为A549和CCD25-Lu之间的表达水平差异很大，据报道，氨酰-tRNA合成酶（ARS）家族的几个成员参与了多种生物过程。显示了的GeneFishing结果LARS1号机组.
LARS1基因在肺癌细胞中的过度表达。（A） CCD-25Lu和A549细胞的总RNA用于基于ACP的GeneFishing分析，如材料和方法所述。对两个细胞系之间显示不同强度的扩增子带进行重新扩增和测序，以便进行基因注释。箭头表示DEG带LARS1号机组.（B）的表达水平LARS1号机组按照材料和方法中的描述，通过qRT-PCR测定每个细胞中的。作为内部对照，使用GAPDH mRNA。（C） CCD-25Lu和A549细胞的细胞裂解物用于抗LARS1抗体的免疫印迹分析。β-actin被检测为等蛋白负荷。（D） 的表达式级别LARS1号机组按照材料和方法中的描述，用qRT-PCR对17例原发性肺癌样本进行了检测。17种原发性癌症中有10种表现出两倍以上的上调LARS1号机组（本研究中过度表达的标准）与正常对照肺组织进行比较。
表1
CCD-25L和A549细胞系之间差异表达的基因综述。
过度表达LARS1号机组在A549细胞和原发性肺癌组织中
为了确认相对较高的LARS1号机组在GeneFishing检测到的A549细胞中，我们筛选LARS1号机组用qRT-PCR和免疫印迹分析在同一细胞系中表达。qRT-PCR实验重复两次，用比值（肿瘤/正常）±SD的平均值表示。如，的RNA表达水平LARS1号机组A549细胞比CCD-25Lu细胞高2倍以上（2.06±0.19）。A549的LARS1蛋白水平也高于CCD-25Lu(). 这些发现表明LARS1号机组通常在肺癌中过度表达。为了检验这种可能性，我们检查了LARS1号机组通过qRT-PCR在17个原发性肺癌组织中检测(). 在17个肺癌组织中的10个组织中LARS1号机组与正常对照组织相比，mRNA的表达增加了两倍以上，而在两倍以下没有原发性肺癌表达不足。该数据表明LARS1号机组通常在肺癌中过度表达。
siRNA对LARS1号机组肿瘤细胞生长
SiRNA对抗LARS1号机组（siLARS）抑制LARS1号机组与用对照siRNA（siCon）处理的细胞相比，在mRNA（肿瘤/正常比值=0.33±0.21）和蛋白质水平(). 然后，我们检查了LARS1号机组下调A549细胞生长。在集落形成试验中，与经siCon处理的细胞相比，经siLARS处理的A549细胞的集落数减少到64%（±14%）(). 在软琼脂分析中，siLARS处理的A549细胞的菌落数量减少到siCon处理的细胞的一半以下（43±9.5%），并且siLARS处理的细胞的菌落大小通常也小于siCon处理的细胞().
下调LARS1号机组抗人肺癌siRNA在A549细胞中的表达LARS1号机组（siLARS）。（A） 用50 nM的siLARS或siCon转染A549细胞，并培养14小时。然后LARS1号机组如材料和方法所述，通过qRT-PCR比较siLARS和siCon处理的细胞之间的表达。作为内部对照，使用GAPDH mRNA。（B） 通过免疫印迹分析比较相同细胞间LARS1蛋白的表达。β-actin被检测为等蛋白负荷。
siLARS对A549细胞集落形成和迁移的影响。（A） 集落形成分析。分别用siCon和siLARS转染A549细胞，并在6孔板中培养6天。计数直径大于1mm的菌落。右框中的条形图表示经siLARS处理的细胞与经siCon处理的细胞中菌落数的百分比。数据表示三个独立实验的百分比±SD的平均值。（B） 软琼脂试验。如材料和方法所述，在低熔点琼脂糖中培养相同的细胞。两周后，对菌落进行拍照并统计菌落数量。（C） Transwell分析。将相同的细胞培养在24孔跨阱腔室的上部腔室中进行迁移分析。24小时后，按照材料和方法中的描述对迁移的细胞进行计数。对迁移的细胞进行拍照，并计算迁移的siLARStreated细胞与迁移的siCon处理的细胞的百分比。数据表示三个相关实验的百分比±SD的平均值。
siLARS对肿瘤细胞迁移的影响
我们还使用跨阱分析检测了siLARS对癌细胞迁移的影响。与siCon处理的细胞相比，转染siLARS的A549细胞的迁移活性明显降低（62±21.2%）()，表明了LARS1号机组过度表达对癌细胞迁移的影响。
讨论
在这项研究中，我们建议LARS1号机组ARS家族成员，通过影响肿瘤细胞的生长和迁移，参与肺肿瘤的发生和肿瘤细胞的行为。持续上调LARS1号机组DEG和qRT-PCR均显示了我们在本研究中使用的基于ACP的GeneFishing分析的可靠性。我们观察到LARS1号机组在肺癌细胞系和原发性肺癌组织中。例如，除A549细胞系外，59%（10/17）的原发性肺癌表现出两倍以上的上调LARS1号机组这表明它在肺癌中具有致癌性。我们假设，如果LARS1号机组有助于肺癌的肿瘤行为，如肿瘤生长和迁移，降低过度表达LARS1号机组可以抑制这些表型。正如我们所料，我们清楚地观察到siLARS治疗对肺癌细胞生长和迁移的抑制作用，这证实了其致癌作用。
ARS家族成员是看家酶，在多肽合成过程中催化tRNA的氨酰化。最近，据报道，ARS除了具有蛋白质合成的管家功能外，还具有许多其他非催化活性，如凋亡、血管生成、RNA剪接和炎症（综述于Lee等人，2004年). 例如，人类QARS与凋亡信号调节激酶1（ASK1）相互作用并阻断其激酶活性，从而抑制细胞死亡(Ko等人，2001年). 据报道，白细胞弹性蛋白酶从全长YARS中产生的人类YARS的N末端片段（称为mini-YARS）与CXC-趋化因子受体CXCR1强烈结合，作为多形核白细胞的化学吸引剂并诱导血管生成(Wakasugi等人，2002年). 相比之下，N-末端截短形式的人类WARS在IFN-γ的作用下抑制血管生成(Otani等人，2002年;Kise等人，2004年). 在酵母中，也有报道称LARS2（线粒体LARS）具有非标准的I组内含子剪接活性(拉布西，1990年;Rho等人，2002年). 然而，目前还没有关于人类LARS的非规范活性的报道，无论其定位如何；因此，据我们所知，这份报告是首次证明人类LARS具有非规范活性的证据。
为了研究siLARS抑制肿瘤细胞生长和迁移的分子机制，我们观察了p53、c-Myc、基质金属蛋白酶（MMP）-1和MMP-2等参与细胞周期和细胞运动的蛋白的表达谱LARS1号机组敲低细胞。但是，这些蛋白质在LARS1号机组击倒（数据未显示）。细胞存活和迁移所需的信号转导子或调节剂，包括信号转导子和转录激活子（STAT）家族成员和AKT激酶也没有受到干扰（数据未显示）。需要进一步的综合下游分析，如全局表达谱分析或蛋白质组筛选，以探索siLARS介导的抗肿瘤活性的分子机制。
癌细胞的蛋白质合成速率通常高于正常细胞，因为癌细胞增殖更广泛，其代谢比正常细胞更具活力。因此，可以假设ARS在包括肺癌在内的癌细胞中升高。假设肺癌细胞生长和迁移的衰减LARS1号机组敲除可能归因于蛋白质合成的一般性、非特异性抑制。然而，DEG分析显示，除LARS1外，ARS家族成员在肺癌细胞中均未升高，此外，上述参与癌细胞生长和迁移的几种蛋白的表达并未因基因敲除而改变LARS1号机组，这表明LARS1号机组敲除可能不是由于蛋白质合成的普遍抑制，而是更可能的LARS1特异机制。
我们的研究有几个局限性。例如，我们尚未观察到LARS1号机组击倒细胞，这可能为理解导致LARS1号机组过表达及其影响肺癌生长和迁移的分子机制LARS1号机组第二，尽管我们观察到LARS1号机组在17种原发性肺癌中表达，需要更大规模的筛查来确认其在原发性癌症中的作用。
总之，我们确定了LARS1号机组，ARS家族成员，在肺癌细胞系和原发性肺癌中。我们通过影响肿瘤细胞的生长和迁移，提出了其在肺肿瘤发生和肿瘤行为中的潜在意义。据我们所知，这是第一份显示频繁过度表达LARS1号机组在肺癌细胞系和原发性肿瘤中，表明其致癌潜力。综上所述，我们的结果和策略将有助于阐明肺癌的发病机制和开发生物标记物。
鸣谢
本研究得到了大韩民国卫生与福利部韩国健康21研发项目的资助（01-PJ3-PG6-01GN07-0004）。
缩写
| ACP公司 | 退火控制底漆 |
| ARS公司 | 氨酰-tRNA合成酶 |
| 二甘醇 | 差异表达基因 |
| LARS1号机组 | 亮氨酸-tRNA合成酶1 |
| 小干扰RNA | 小干扰RNA |
工具书类
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