自然细胞生物学。作者手稿；可在PMC 2009年5月4日获得。
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NIHMSID公司：美国国立卫生研究院104261
细胞质p53对自噬的调节
,1,2,三，16 ,1,2,4,16 ,1,2,三 ,1,2,三 ,5 ,6 ,1,2,三 ,1,2,三 ,7 ,8 ,9 ,10 ,11 ,1,2,三 ,4 ,12 ,13 ,14 ,11 ,14,15 ,8 ,7 ,10 ,5 ,6和1,2,三，17
埃兹吉·塔斯德米尔
1INSERM，U848，巴黎11，94805 Villejuif，法国
2法国维尔尤夫古斯塔夫·罗西研究所，巴黎11号，邮编94805
三巴黎南巴黎大学，巴黎11，94805 Villejuif，France
M.Chiara Maiuri先生
1INSERM，U848，巴黎11，94805 Villejuif，法国
2法国维尔尤夫古斯塔夫·罗西研究所，巴黎11号，邮编94805
4意大利那不勒斯大学生物技术学院和实验药理学系
洛伦佐·加卢齐
1INSERM，U848，巴黎11，94805 Villejuif，法国
2法国维尔尤夫古斯塔夫·罗西研究所，巴黎11号，邮编94805
三巴黎南巴黎大学，巴黎11，94805 Villejuif，France
伊利奥·维塔莱
1INSERM，U848，巴黎11，94805 Villejuif，法国
2法国维尔尤夫古斯塔夫·罗西研究所，巴黎11号，邮编94805
三巴黎南巴黎大学，巴黎11，94805 Villejuif，France
莫伊甘·贾瓦赫里·梅格尼（Mojgan Djavaheri-Mergny）
5INSERM U756，巴黎南11大学，法国Châtenay Malabry制药学院
马塞洛·达梅利奥
6杜尔贝科电视马拉松研究所，托尔韦加塔大学生物系和IRCCS圣卢西亚基金会，意大利罗马00133
阿尔弗雷多·克里奥洛
1INSERM，U848，巴黎11，94805 Villejuif，法国
2法国维尔尤夫古斯塔夫·罗西研究所，巴黎11号，邮编94805
三巴黎南巴黎大学，巴黎11，94805 Villejuif，France
尤金妮娅·莫塞利
1法国维勒朱伊夫，巴黎94805
2法国维尔尤夫古斯塔夫·罗西研究所，巴黎11号，邮编94805
三巴黎南巴黎大学，巴黎11，94805 Villejuif，France
朱长莲
7哥德堡大学神经科学与生理学研究所脑修复与康复中心，瑞典哥德堡西尔维亚女王儿童医院儿科肿瘤科
弗朗西斯·哈珀
8CNRS，FRE 2937，安德烈·沃夫研究所，94801 Villejuif，法国
乌尔夫·南马克
9瑞典哥德堡大学生物医学研究所医学生物化学和细胞生物学系
克莱桑蒂·萨马拉
10希腊克里特岛赫拉克利翁希腊希拉斯研究与技术基金会分子生物学和生物技术研究所
保罗·平顿
11意大利费拉拉大学跨学科炎症研究中心（ICSI）普通病理科实验和诊断医学系，44100费拉拉
何塞·米盖尔·维森西奥
1INSERM，U848，巴黎11，94805 Villejuif，法国
2法国维尔尤夫古斯塔夫·罗西研究所，巴黎11号，邮编94805
三巴黎南巴黎大学，巴黎11，94805 Villejuif，France
罗莎·卡努乔
4意大利那不勒斯大学生物技术学院和实验药理学系
研究者马代奥
13奥地利格拉茨格拉茨大学分子生物科学研究所
Patrizia Paterlini-Brechot公司
14INSERM U807，法国巴黎第五大学医学院Necker-Enfants Malades医院，75015
罗萨里奥·里祖托
11意大利费拉拉大学跨学科炎症研究中心（ICSI）普通病理科实验和诊断医学系，44100费拉拉
Gyorgy Szabadkai公司
14INSERM U807，法国巴黎第五大学医学院Necker-Enfants Malades医院，75015
15英国伦敦WC1E6BT Gower街伦敦大学学院生理学系
杰拉德·皮尔龙
8CNRS，FRE 2937，安德烈·勒沃夫研究所，法国维勒朱夫94801
布劳姆格林
7瑞典哥德堡皇后西尔维亚儿童医院小儿肿瘤科哥德堡大学神经科学与生理研究所脑修复与康复中心
内克塔里奥斯·塔维尔纳拉基斯
10希腊克里特岛赫拉克利翁希腊希拉斯研究与技术基金会分子生物学和生物技术研究所
帕特里斯·科多诺
5INSERM U756，巴黎南11大学，法国马拉布里郡法科
弗朗西斯科·塞科尼
6杜尔贝科电视马拉松研究所，托尔韦加塔大学生物系和IRCCS圣卢西亚基金会，意大利罗马00133
吉多·克罗默
1INSERM，U848，巴黎11，94805 Villejuif，法国
2法国维尔尤夫古斯塔夫·罗西研究所，巴黎11号，邮编94805
三巴黎南巴黎大学，巴黎11，94805 Villejuif，France
1INSERM，U848，巴黎11，94805 Villejuif，法国
2法国维尔尤夫古斯塔夫·罗西研究所，巴黎11号，邮编94805
三巴黎南巴黎大学，巴黎11，94805 Villejuif，France
4意大利那不勒斯大学生物技术学院和实验药理学系
5INSERM U756，巴黎南11大学，法国马拉布里郡法科
6杜尔贝科电视马拉松研究所，托尔韦加塔大学生物系和IRCCS圣卢西亚基金会，意大利罗马00133
7瑞典哥德堡皇后西尔维亚儿童医院小儿肿瘤科哥德堡大学神经科学与生理研究所脑修复与康复中心
8CNRS，FRE 2937，安德烈·沃夫研究所，94801 Villejuif，法国
9瑞典哥德堡大学生物医学研究所医学生物化学和细胞生物学系
10希腊克里特岛赫拉克利翁希腊希拉斯研究与技术基金会分子生物学和生物技术研究所
11意大利费拉拉大学跨学科炎症研究中心（ICSI）普通病理科实验和诊断医学系，44100费拉拉
12美国纽约州立大学石溪分校病理学系
13奥地利格拉茨格拉茨大学分子生物科学研究所
14INSERM U807，法国巴黎第五大学医学院Necker-Enfants Malades医院，75015
15英国伦敦WC1E6BT Gower街伦敦大学学院生理学系
16这些作者对这篇论文的贡献是一样的。
作者贡献E.T.、M.C.M.、L.G.和I.V.进行了实验，编制了数字并分析了数据；M.D.-M.、M.D.-A.、A.C.、E.M.、C.Z.、F.H.、U.N.、C.S.、P.P.、J.M.V、R.C.、F.M.、P.PB、G.S.、G.P.、K.B.、N.T.、P.C.和F.C.进行了实验；E.T.和G.K.规划了该项目；G.K.负责监督项目并撰写手稿。
- 补充资料
2
GUID:30CD1348-C929-4D0C-8A51-A188C22DA29F
摘要
多种细胞应激源，包括肿瘤抑制因子p53的激活，可以刺激自噬。在这里，我们表明敲除、敲除或药物抑制p53可以诱导人类、小鼠和线虫细胞的自噬。增强的自噬提高了p53缺陷癌细胞在缺氧和营养缺乏条件下的存活率，使其能够维持较高的ATP水平。抑制p53导致去核细胞的自噬，而p53能够抑制细胞质而非核细胞的增强自噬第53页-/-细胞。许多不同的自噬诱导物（例如饥饿、雷帕霉素和影响内质网的毒素）通过依赖E3泛素连接酶HDM2的途径刺激蛋白酶体介导的p53降解。抑制p53降解阻止了几个细胞系对几种不同刺激的自噬激活。这些结果为将自噬与癌相关p53失调联系起来的关键信号通路提供了证据。
自噬（“自噬”）是真核生物对细胞应激的一种重要反应。在自噬过程中，部分细胞质和细胞质细胞器被隔离在特征性的双膜或多膜自噬小体中，并输送到溶酶体进行大量降解。通过促进分解代谢反应，自噬产生新的代谢底物，满足细胞的生物能量需求，并允许适应性蛋白质合成。自噬还包括一个自我平衡的“清理”过程，以清除细胞内的寄生虫、受损的细胞器和潜在的有毒、易聚集的蛋白质。最后，自噬被认为是一个自我构造的过程，在这个过程中，应激细胞屈服于所谓的自噬细胞死亡1.
自噬对哺乳动物细胞的长期存活至关重要，自噬能力的部分降低可能构成致癌事件。至少有一个系统发育保守的自噬基因，atg6/beclin 1号机组，在人类癌症中经常在一个位点失活，小鼠研究证实贝克林1是一种单倍体肿瘤抑制剂2有两个非结论性假设可以解释抑制自噬如何刺激肿瘤发生和肿瘤进展。首先，不能进行自噬可能导致坏死细胞死亡三或破坏死亡细胞的清除4这可能会加剧局部炎症，从而有利于肿瘤生长。第二种可能性是抑制自噬可能导致基因组不稳定5自噬的部分缺陷可能导致肿瘤发生，至少在某些癌症中是这样。事实上，许多人类肿瘤表现出异常水平的自噬6它可以受到外源性和内源性应激的刺激，包括化疗、放疗和缺氧。在大多数情况下，抑制这种自噬反应会降低细胞存活率7,8强调了自噬作为细胞防御机制的重要性。
最具广泛特征的肿瘤抑制蛋白是p53，它是一种对新陈代谢、抗氧化防御、基因组稳定性、增殖、衰老和细胞死亡具有多效性作用的主调节蛋白9DNA损伤以p53依赖的方式诱导自噬10此外，p53缺乏的癌细胞中p53的重新表达已被证明通过重新激活细胞内在屏障来阻止肿瘤发生，如衰老和凋亡，从而导致肿瘤退化11-13在p53重新激活的过程中，自噬被诱导13可能是p53介导的自噬诱导物的反式激活的结果14这种对p53的自噬反应可能导致细胞死亡14或构成细胞防御反应，其抑制可能提高p53再激活对B细胞淋巴瘤的治疗效果13.
虽然p53系统的激活可以诱导自噬，但我们惊奇地发现，去除p53也可以刺激自噬。在这里，我们提供证据表明p53作为自噬的内源性阻遏物发挥作用。我们的结果增加了一种日益复杂的稳态调节，其中p53和自噬以一种迄今为止意想不到的方式相互关联。
结果
p53缺失、耗尽或抑制后的自噬空泡化
通过透射电子显微镜（TEM）测定，HCT116结肠癌细胞显示自噬体和/或自溶体的细胞质积聚，这是自噬的形态学相关性，当第53页被特定的短干扰（si）RNA击倒()，被同源重组敲除15或被p53的药理拮抗剂环哌氟菊酯-α（PFT-α）抑制(参考文献16;). p53的缺失或抑制也会在未转化的HFFF2人成纤维细胞、SH-SY5Y神经母细胞瘤和HeLa宫颈癌细胞中诱导TEM可检测的自噬(补充信息，图S1a，b). p53的抑制、缺失或缺失增加了自噬的两个生化标志17即LC3-I转化为LC3-II，p62/SQSTM1表达减少(). PFT-α，第53页击倒或第53页敲除刺激了GFP-LC3融合蛋白从普遍存在的弥散模式向自噬体的重新分布，在HCT116细胞中可以看到自噬小点(;补充信息，图S1c)小鼠胚胎成纤维细胞；;补充信息，图S1d)人HFFF2、SH-SY5Y和HeLa细胞(补充信息，图S1e-g).
通过缺失、耗尽或抑制p53诱导自噬空泡化。(一)HCT116细胞中p53被特异siRNA耗竭或p53被PFT-α药物抑制所诱导自噬的超微结构证据。(b条)PFT-α诱导自噬，第53页击倒，或第53页HCT116细胞中的敲除。在3个独立的实验中，测定了至少50个细胞的自噬体和自溶体的数量（平均值±标准差*P（P）< 0.05). 采用无营养（NF）条件下的培养作为阳性对照。(c（c）)p53对LC3成熟的影响。免疫印迹显示野生型（WT）或第53页-/-HCT116型(n个= 3). (d日)PFT-α诱导的GFP-LC3点，第53页击倒或击倒。WT和第53页-/-HCT116细胞转染对照或第53页-用GFP-LC3质粒重新转染的特异性siRNAs，在完整培养基中培养24小时，并在存在或不存在30µM PFT-α的条件下保存6小时。点状细胞（GFP-LC3）中显示GFP-LC2积聚的细胞百分比真空)报告（平均值±标准差。，n个= 3; *P（P）< 0.05). (e（电子）)与转染GFP-LC3的WT-MEF相比，p53-/-MEF中的GFP-LC3puncta（平均值±标准差）。，n个= 3; *P（P）< 0.05). (（f）)来自第53页+/+或第53页-/-表达GFP-LC3转基因的小鼠（平均值±s.d*P（P）<0.05），无饥饿或饥饿24小时后。每一区域的GFP-LC3点的数量是在至少4个区域内测定的（每只动物4张载玻片，每种条件3只动物，放大×400倍）。(克)透射电镜照片第53页-/-和第53页+/-小鼠肝脏。第53页-/-肝细胞携带大约3个自噬体，第53页+/-控制每个单元格大约1个。(小时)p53同源CEP-1对DsRed:：LGG-1水平的调节秀丽线虫显示了WT动物和携带cep-1缺失等位基因(gk138号). WT每细胞点状细胞计数为6.9±3.3，WT为52.2±9.4cep-1(gk138号)胚胎（20个个体的平均±s.e.m.，每个胚胎5个细胞）。DsRed:：LGG-1点的量化显示了所示的遗传背景和条件（点表示单个胚胎的像素强度）。
表达GFP-LC3转基因的成年小鼠的各种组织（胰腺、肝脏和肾脏，但不是肌肉）18在上第53页-/-背景显示GFP-LC3点高于第53页+/+室友控制(;补充信息，图S2). 饥饿24小时诱导GFP-LC3转基因细胞自噬第53页+/+老鼠18而GFP-LC3点在第53页-/-老鼠(;补充信息，图S2d)这表明，自噬在胰腺、肝脏和肾脏中发生的水平最高，或者饥饿诱导自噬需要p53。TEM证实第53页-/-肝细胞()和胰腺上皮细胞(补充信息，图S2e)自噬比杂合子多第53页+/-同窝的人。小鼠全身注射PFT-α也可诱导小脑和心脏的自噬(补充信息，图S3a-f). 最后，敲除或RNAi介导的第53页直系亲属cep-1在里面秀丽隐杆线虫刺激自噬，如胚胎中DsRed:：LGG-1报告基因产物（LGG-1是LC3的同源基因）的增加表达和细胞质聚集所示()在成人咽细胞中(补充信息，图S3g，h). 这些数据表明，p53对自噬的调节在系统发育上是保守的。
p53抑制后自噬空泡化增强的机制
p53中和诱导的GFP-LC3点状突起通过消耗附件5,贝克林1/Atg6,附件10,附件12或毫伏电压34使用先前验证的siRNAs7,19表明这一现象遵循典型的自噬途径(). 类似地，MCF7乳腺癌细胞由于Beclin 1表达不足而通常不能自噬20，未能在之后激活自噬第53页击倒；然而，当Beclin 1表达被诱导时，自噬程序被恢复(). p53缺失导致自噬体和自溶体的积累可能涉及增强自噬隔离（正速率）或减少自噬物质的降解（负速率）。为了区分这些可能性，我们通过监测GFP-LC3与溶酶体标记Lamp-2的共定位来评估PFT-α诱导的自噬空泡化，无论是在没有或存在抑制自噬体和溶酶体融合的bafilomycin A1的情况下7(). Bafilomycin A1进一步增强了PFT-α触发的GFP-LC3点状物的积累(). 同样，溶酶体蛋白酶抑制剂leupeptin21进一步增加了PFT-α触发的LC3-II诱导(). 这些数据表明，p53抑制至少会增加自噬的发生率在体外，在培养细胞中。
PFT-α触发自噬空泡化，对空泡溶酶体融合无影响。(一)PFT-α或第53页转染siRNAs的WT HCT116细胞中siRNA诱导的GFP-LC3 puncta，以耗尽必需的自噬基因产物Atg5、Atg10、Atg12、Beclin 1或hVps34。在无营养（NF）条件下培养用作自噬诱导的控制。(b条)PFT-α或第53页用小鼠特异性siRNA转染的MEFs中siRNA介导的GFP-LC3点附件5或贝克林1. (c（c）)MCF7细胞中p53缺失诱导自噬的Beclin 1表达要求。将稳定转染四环素抑制型Beclin 1构建物的MCF7细胞维持在阻止或允许Beclin l表达的条件下，转染GFP-LC3并进行第53页量化GFP-LC3点之前击倒。中的数据一-c（c）为3个独立实验的平均值±标准差。(d日-（f）)巴非霉素A1（BafA1）对PFT-α诱导的GFP-LC3点状细胞的影响。用PFT-α和/或BafA1处理表达GFP-LC3的HeLa细胞，然后对Lamp-2进行免疫染色，观察GFP-LC3-和Lamp-2的共定位。有代表性的共焦显微照片与共定位轮廓一起显示(d日)在由箭头的方向指示的感兴趣区域内。绘制对照细胞和6小时后在PFT-α和/或BafA1存在下培养的细胞的重叠百分比(d日,e（电子）). 柱表示GFP-LC3和Lamp-2的共定位百分比（平均值±标准差*P（P）<0.05），每种情况下至少50个细胞定量。通过常规荧光显微镜定量GFP-LC3重新分布的动力学（平均值±s.d.、3个实验，（f）). (克)免疫印迹法检测PFT-α和/或亮氨酸肽处理的WT HCT116细胞中LC3-I/II的表达(n个= 3).
自噬由包括AMP激酶（AMPK）在内的几种激酶控制，AMPK诱导自噬22雷帕霉素（mTOR）的哺乳动物靶点，该靶点可抑制自噬23.英寸第53页-/-细胞、AMPK和AMPK底物结节性硬化复合物2（TSC2）和乙酰辅酶A羧化酶（ACCα）过度磷酸化（表明AMPK激活），而p70S6K系列mTOR底物被低磷酸化（这反映了mTOR抑制；). siRNA介导的AMPKα1和AMPKβ2的缺失，抑制p53中底物ACCα的过度磷酸化-/-单元格()或用雷帕霉素抑制mTOR()消除p53抑制剂和对照HCT116之间的自噬差异()或SH-SY5Y单元（未显示）。这些结果与p53通过AMPK/mTOR依赖途径控制自噬的可能性一致。
AMPK、p70S6K和mTOR在p53介导的自噬调节中的作用。(一)AMPKα、ACCα、TSC2和p70磷酸化状态的免疫印迹检测S6K系列HCT116细胞中。检测到p70S6K的低磷酸化和AMPKα、ACCα和TSC2的高磷酸化第53页-/-HCT116与WT HCT116细胞在完全培养基中培养后的比较(n个= 5). (b条)WT和WT中GFP-LC3vac细胞的定量第53页-/-转染AMPK催化α1和α2亚单位特异性siRNA的HCT116细胞（3个独立实验的平均值±标准差*P（P）< 0.05). 中的插图b条证明了免疫印迹分析评估的siRNA介导的AMPKα1和AMPKβ2下调的效率(n个= 3). 注意，抗体识别AMPKα1和AMPKβ2。(c（c）)免疫印迹法检测WT和WT中ACCα磷酸化第53页-/-HCT116细胞被敲除AMPK公司α1和AMPK公司α2(n个= 5); Co，对照。(d日)GFP-LC3vac细胞的定量（平均值±标准差。，n个=3个单独实验），在用PFT-α和/或雷帕霉素处理的WT HCT116和p53-/-HCT116中。
p53的抑制或缺失通过诱导自噬导致应激抵抗
自噬使细胞在饥饿条件下保持较高的ATP水平24当野生型HCT116细胞从含糖培养基转移到无糖培养基时，细胞内ATP水平在几分钟内降低(;补充信息，图S4a). 在野生型细胞中，ATP的这种减少被糖酵解产物丙酮酸（以膜通透性甲基丙酮酸形式提供；;补充信息，图S4b)通过自噬诱导剂雷帕霉素(;补充信息，图S4c). 相反，第53页-/-即使在没有葡萄糖的情况下，细胞仍保持较高的ATP水平(). 然而第53页-/-当AMPKα、Beclin 1的缺失抑制自噬时，在无葡萄糖条件下维持高ATP水平的细胞受到损害()、Atg5或Atg10（未显示数据）。这会影响细胞在代谢应激（营养缺乏和缺氧）条件下的存活。代谢应激48小时后，线粒体跨膜电位（ΔΨ米用荧光染料DiOC测量6（3） ）在大量野生型细胞中减少，这是细胞即将死亡和/或丧失生存能力的迹象（用活性染料碘化丙啶或克隆形成分析测定）。第53页-/-细胞对代谢应激具有相对抗性；然而，这种抵抗被击倒AMPK公司α或基本自噬基因产物Atg5、Atg10()或Beclin 1(补充信息，图S4f). 丙酮酸甲酯部分逆转了代谢应激的致死效应(补充信息，图S4d，e). 当在MCF7细胞中调节p53和Beclin 1水平时，也得到了类似的结果（除非Beclin l表达被诱导，否则自噬功能不全20;)以及MEF（自噬能力，Beclin 1耗尽时除外；). 无论细胞类型如何，p53缺失都增强了对代谢应激的抵抗力，但只有当细胞表达Beclin 1并因此能够自噬时才会出现这种情况(). 这些结果表明第53页-/-细胞代谢应激依赖于自噬的增加。
p53缺失可减轻葡萄糖缺乏时ATP的消耗，并有利于在代谢应激下存活。(一)WT和p53中的细胞质ATP水平-/-HCT116细胞中没有葡萄糖。在用先含有然后缺失葡萄糖的培养基灌注细胞后，对荧光素酶表达的HCT116进行测量。(b条)丙酮酸甲酯（MetPyr）对野生型小鼠ATP水平的影响第53页-/-HCT116细胞葡萄糖耗尽。ATP水平测量如下一在葡萄糖存在下，停药或用MetPyr替代后15分钟。(c（c）)自噬对WT和WT的ATP水平的影响第53页-/-HCT116细胞葡萄糖耗尽。细胞转染了针对贝克林1和AMPK公司α、 或用雷帕霉素治疗6小时，然后测量ATP水平，如一，在葡萄糖停药之前或之后（平均三次给药的±s.d.，3个独立实验）。(d日)在缺乏p53的情况下，代谢应激诱导的细胞死亡减弱。HCT116细胞转染对照组，附件5-,附件10-，或AMPK公司α特异性siRNAs，并在48小时后受到代谢应激（在无营养、缺氧条件下培养48小时），并用DiOC染色6（3） 和PI。列的黑色和白色部分指的是DiOC6（3） 低PI（染色）和DiOC6（3） 低PI+（死亡）人数。（e）在缺乏p53的情况下，代谢应激诱导的克隆形成存活率下降减弱。HCT116细胞受到代谢应激d日监测克隆存活率。(（f）)MCF7细胞中Beclin 1的表达恢复了p53缺失带来的生存优势。培养携带四环素可抑制Beclin 1表达结构的MCF7细胞，以避免Beclin l表达或诱导其表达，用对照siRNA或第53页-特定siRNA，经受代谢应激，最后用DiOC染色6（3） /PI。(克)p53和自噬对代谢应激MEF生存的影响。WT-MEFs转染了指示的siRNAs，然后在进行克隆形成分析之前经受代谢应激。中的结果d日-克是3个单独实验的平均值±标准差(*P（P）< 0.05); Co，控制。
抑制自噬需要细胞质而非细胞核p53
为了了解p53抑制自噬的机制，我们测定了野生型和第53页-/-HCT116细胞，但未能识别基因本体程序中列出的自噬相关转录物的变化(网址：www.intenuity.com). 因此，我们利用细胞质（无核细胞）研究了p53对自噬的抑制是否与转录相关。作为对PFT-α的反应，HeLa细胞质体（如箭头所示)仍然能够积累GFP-LC3点(;补充信息，图S5a)，表明PFT-α刺激的自噬不需要细胞核（通过延伸转录）。
细胞质p53抑制自噬。(一,b条)PFT-α介导的细胞自噬刺激。细胞松弛素B处理后，通过密度梯度离心法将GFP-LC3转染的HeLa细胞剜除，并在多聚赖氨酸涂层盖玻片上培养。然后将细胞和细胞质的混合物（箭头，通过缺乏Hoechst 33342染色确定）暴露于三种不同的自噬诱导物：PFT-α、营养饥饿和雷帕霉素。结果为平均值±标准差。n个=3个实验）。(c（c）-e（电子）)p53突变体对小鼠自噬的影响第53页-/-HCT116细胞。本研究中使用的p53结构域和突变体在c（c）用表达WT、细胞核和细胞质p53的质粒转染的细胞的代表性显微照片显示在d日.量化p53的GFP-LC3点-/-瞬时转染p53突变体的HCT116细胞如图所示e（电子）（平均值±标准差。，n个=3个实验*P（P）< 0.05). (（f）)AMPKα、AACα、TSC2和p70磷酸化状态的检测S6K系列在p53-/-HCT116细胞中瞬时表达WT或突变型p53(n个= 5).
接下来，我们重新改造第53页-/-p53靶向核或核外部位的HCT116细胞(). 野生型和内皮网（ER）靶向p53（p53ER）25抑制自噬，而锁定在细胞核中的p53形式（使用被破坏的核输出信号，NES）无法抑制自吞噬(;补充信息，图S5b). 突变R175H，已知其可抑制p53的核质效应(参考文献26,27)，阻止了p53和p53ER对自噬的抑制。核定位序列（NLS）突变导致p53细胞质滞留的p53突变能有效抑制自噬。p53ERTAM公司除非添加4-羟基三苯氧胺（4-OHT），否则融合结构（与p53融合的雌激素受体的激素结合区）是无效的28.转染第53页-/-带有p53ER的细胞TAM公司仅在4-OHT存在时抑制自噬。去除前富结构域（ΔPP）削弱了p53ER的抑制作用TAM公司关于自噬，反对非特异性作用(). 野生型或细胞质靶向p53对自噬的抑制伴随着AMPKα、ACCα和TSC2磷酸化的降低，以及p70磷酸化的增加S6K系列，强调p53对AMPK/mTOR轴的影响(). 这些结果表明，p53通过细胞质定位产生的转录依赖效应抑制自噬。
p53在自噬生理调节中的意义
PFT-α抑制p53可快速诱导自噬，其动力学与雷帕霉素类似（见下文）。添加PFT-α后不久（2 h），新形成的GFP-LC3+与ER标记ERp57共定位的斑点()或钙网织蛋白（数据未显示），而与线粒体标记物（如OXPHOS复合物的核心2亚基）的共定位发生在较晚的时间点(). 添加PFT-α后4-6小时，自噬细胞中ER标记物水平下降(). 因此，抑制p53最初会诱导有效的网织吞噬（内质网自噬），随后是线粒体自噬（自噬线粒体）。内质网噬菌体也由内质网应激源诱导，如thapsigargin、tunicamycin和brefeldin A，途径依赖于IRE-1α依赖的eIF2α磷酸化29类似地，p53的缺失或抑制增加了eIF2α的磷酸化(). siRNA介导的HCT116中IRE-1α的缺失()细胞或移除爱尔兰1来自MEF的α基因()抑制p53中和诱导的自噬。
内质网应激抑制p53诱导自噬(一-c（c）)将GFP-LC3瞬时转染WT HCT116细胞，用PFT-α处理2、4或6 h，并进行免疫荧光染色，观察GFP-LC3-的共定位+带有ER标记ERp57的punta(一)或线粒体标记(b条). 注意，含有GFP-LC3的细胞+在与PFT-α长时间孵育后，点刺通常含有少量ERp57（白色箭头）。共定位百分比（平均值±标准差。，n个=3个实验，每个实验50张图像）由共焦显微镜测定(c（c）). (d日)WT中的eIF2α磷酸化或第53页-/-PFT-α处理HCT116细胞(n个= 5). (e（电子）,（f）)WT HCT116细胞(e（电子）,（f）)或第53页-/-HCT116细胞(（f）)转染GFP-LC3，加上对照siRNA或爱尔兰共和国1α-和/或第53页-特异性siRNA，并用PFT-α、thapsigargin、tunicamycin或brefeldin A处理(克)GFP-LC3转染的WT或爱尔兰1α-/-用PFT-α治疗MEF。中的列e（电子）-克显示3个独立实验的平均值±标准差(*P（P）< 0.05).
除了诱导自噬外，衣霉素N个-糖基化和其他自噬诱导物（例如，营养素耗竭、雷帕霉素和锂）导致p53的伴随耗竭(). 细胞质和细胞核p53均以类似的动力学耗尽（数据未显示）。雷帕霉素治疗或由膜霉素、他普菌素或布雷费尔德素A诱导的内质网应激引起HDM2和p53的蛋白酶体依赖性降解(参考文献30,31)以及自噬29,32(). 当用MG132抑制蛋白酶体或siRNA介导的HDM2耗竭来阻止p53降解时，不诱导自噬。在HCT116细胞中观察到这种效应()以及HeLa细胞(补充信息,)和非转化成纤维细胞（数据未显示）。HDM2的两种药理抑制剂Nutlin-3(参考33)和RITA34还稳定了p53并抑制了内质网应激、营养缺乏、锂和雷帕霉素诱导的自噬(). 在对照实验中，HDM2型击倒，MG132()、Nutlin-3或RITA()没有阻止自噬的构成性升高第53页-/-细胞，表明这些药物不发挥内在的自噬抑制作用。野生型p53和抗HDM2依赖性降解的p53突变的过度表达（p53ΔI）35还以浓度依赖性的方式抑制了衣霉素、他巴霉素和雷帕霉素诱导的自噬。在本试验中，p53ΔI突变对自噬诱导物引起的降解具有相对抗性，并且在抑制GFP-LC3再分布方面比野生型p53更有效().
自噬的诱导需要HDM2和蛋白酶体介导的p53降解。p53降解动力学(一)以及诱导GFP-LC3斑点(b条)在含有雷帕霉素（Rapa）、衣霉素（Tn）、锂（Li）或无营养物质培养基（NF）的完整培养基中培养的WT HCT116细胞中。(c（c）)WT HCT116细胞转染对照或HDM2型-靶向siRNA在MG132存在或不存在的情况下培养3小时，然后用自噬诱导剂治疗6小时（Tp，thapsigargin；其他缩写如b条). 通过免疫印迹分析测定p53和HDM2的丰度，以及显示GFP-LC3在空泡中积聚的细胞百分率真空)已确定。(d日)HDM2抑制剂对p53蛋白水平和自噬的影响。WT HCT116未经处理或用Nutlin-3、RITA和/或指定的自噬诱导剂处理，然后进行p53免疫印迹或免疫荧光显微镜观察GFP-LC3的重新分布。(e（电子）)MG132和HDM2 siRNA对WT和HDM自噬的影响第53页-/-HCT116细胞。(（f）)HDM2抑制剂未能阻止p53缺失诱导的自噬。添加Nutlin-3和RITA第53页-/-HCT116细胞，然后定量GFP-LC3斑点。(克)WT和泛素抗性p53对自噬的影响。第53页-/-将GFP-LC3单独或与不同浓度的pcDNA3.1、WT p53或缺乏泛素化位点的p53（p53ΔI）联合转染HCT116细胞，然后用雷帕霉素、突尼斯霉素或他司加林处理。随后，对p53表达和GFP-LC3点进行量化。(小时)消耗Atg5或Beclin 1并不能阻止雷帕霉素或内质网应激源引起的p53降解。转染siRNA靶向的WT HCT116细胞附件5或贝克林1用雷帕霉素、衣霉素或他培沙金治疗6h后，用免疫印迹法检测p53水平。GFP-LC3的量化真空中的单元格b条-克是3个单独实验的平均值±标准差*P（P）< 0.05. 这些污点一,c（c）,d日,克和小时显示了3-5个不同实验的代表性。
这些结果为p53缺失和自噬诱导之间的联系提供了证据。值得注意的是，在内质网应激条件下，Atg5或Beclin 1的缺失并不能阻止p53的降解()这表明自噬不是p53缺失所必需的。相反，p53的缺失似乎是诱导自噬所必需的().
讨论
在这里，我们发现p53的缺失、耗尽或抑制会在人类、小鼠和线虫细胞中诱导自噬。此外，各种自噬诱导物导致p53降解，而抑制p53降解可阻止自噬，这表明抑制p53对诱导自噬至关重要。这些发现对p53系统的空间调控、p53与自噬/存活途径之间的联系以及p53作为肿瘤抑制蛋白的作用具有意义。
目前，自噬诱导刺激（如内质网应激）导致细胞质易位和随后的p53降解的确切机制尚不清楚。然而，这个过程涉及Ser 315和Ser 376上p53的顺序磷酸化、其核输出、HDM2泛素化和蛋白酶体介导的降解30,31如图所示，抑制HDM2或蛋白酶体可防止由各种自噬触发物诱导的p53降解，并抑制自噬。本研究对p53缺失抑制自噬的机制提供了一些见解。我们已经证明，p53通过细胞质（非核）效应抑制自噬，这一发现表明，药物抑制p53可以触发细胞质中的自噬。此外，细胞质靶向而非细胞核靶向的p53变体抑制自噬。重要的是，无论是改变p53构象的点突变（R175H）还是πPP的去除都会消除p53的自噬抑制作用。p53的另一种细胞质功能，即诱导线粒体膜通透性和凋亡，也被R175H和ΔPP突变所抵消27,36,37与p53相互作用诱导凋亡的因子属于Bcl-2蛋白家族27,36,38也调节自噬39与仅促凋亡BH3蛋白一样，p53抑制Bcl-2同源物的抗凋亡作用36并激活Bax38和Bak40，是促进细胞凋亡的Bcl-2蛋白。然而，只有BH3蛋白是自噬诱导物，而不是抑制剂41表明p53对自噬的调节作用不同于仅BH3蛋白。因此，细胞质p53抑制自噬的确切分子途径仍然难以捉摸。
无论分子细节如何，p53诱导自噬与mTOR的抑制有关10,42而p53对自噬的抑制与mTOR活性的增强有关。此外，p53诱导自噬似乎依赖于基因的反式激活，如动态随机存取存储器14而抑制是一种细胞质效应。p53的核质穿梭受核输出信号翻译后修饰的调控43并且在调节自噬中起主要作用。
p53被各种应激源激活，包括影响DNA结构的因素（例如紫外线、电离辐射和化学疗法）和诱导活性氧物种的条件。应激激活p53涉及多种机制，通常导致p53蛋白的稳定44一旦激活，p53介导多种效应，从短暂细胞周期阻滞后刺激DNA修复到不可逆细胞周期阻滞（衰老）或诱导凋亡。这些影响大多取决于p53靶基因的反式激活9,45确定p53是否诱导适应性反应（DNA修复）或细胞死亡与不同的转录程序有关，与p53转录后修饰的特定模式相关（例如Ser 46的磷酸化，这是促凋亡的）。虽然DNA损伤和前氧化条件激活了p53，但一些细胞应激源使p53失活，正如内质网应激源所证明的那样30,31饥饿（如本研究所示）。这些发现表明，压力源性质的细微差异可以诱导或抑制p53。
如前所述，p53可能通过自噬诱导蛋白DRAM的转录激活而有效地诱导自噬14也通过mTOR通路的失活10这种p53介导的自噬激活以积极的方式与细胞死亡相关（因为DRAM也需要通过p53诱导凋亡）或以消极的方式（因为自噬抑制可以增强p53介介导的凋亡）。此外，我们在这里显示，生理水平的p53抑制自噬。因此，p53系统的任何扰动——激活或抑制——都可能诱导自噬。任何一种由p53失活或过度激活引起的细胞应激都可能诱导自噬，可能是在基因毒性应激或无法应对这种应激的情况下。如上所述，由p53过度激活诱导的自噬既可以是细胞杀伤性的，也可以是细胞保护性的。相反，与p53抑制相关的自噬似乎是细胞保护性的，这一发现表明自噬是增强肿瘤抵抗力所必需的第53页-/-细胞代谢应激。
总之，这些发现表明，在一系列可能由细胞事件和信号强度决定的二元决策中，p53可能被不同的应激源激活或抑制，p53可以抑制或增强自噬，自噬可以增加或减少细胞存活。例如，降低葡萄糖浓度可以通过AMPK介导的磷酸化激活p5342,46，但从培养基中去除所有营养物质会导致p53降解，如图所示。此外，尽管p53可以通过mTOR抑制来刺激自噬10或DRAM事务激活14在DNA损伤或p53过度表达的情况下，我们在这里表明，基线p53水平可以在其他细胞环境中抑制自噬。
毫无疑问，p53是癌症中最常失活的肿瘤抑制因子之一。从目的论的角度来看，增加肿瘤细胞的自噬有什么好处？自噬的药理学刺激增加细胞对凋亡的抵抗力，可能是由于前凋亡线粒体的移除47; 对凋亡的抵抗和氧化磷酸化的减少都是癌症的标志48,49自噬是细胞在细胞内代谢物浓度降低的条件下挣扎生存的过程，这是由控制营养素吸收的生长因子信号丢失引起的24如图所示，缺乏p53的细胞对ATP耗竭和缺氧和营养耗竭引起的代谢应激诱导的细胞死亡特别具有抵抗力，当自噬受到抑制时，这种抵抗力就会丧失。癌症细胞的氧气和葡萄糖供应通常很低，尤其是在肿瘤结节的非血管区域。在这种肿瘤微环境中，基线自噬水平的提高可能会改善恶性细胞的适应性，并对那些在浸润正常组织或转移时失去旁分泌或接触依赖性生长信号的癌细胞构成最初的优势。
尽管增强的自噬可能会带来优势，至少对于应激细胞而言，自噬的持续增加可能会降低细胞增殖率，这似乎是合理的（尚待证明）。在这种情况下，自噬的部分抑制要么是通过失去一个贝克林1PI-3K/Akt轴的等位基因（也许还有其他尚未发现的遗传或表观遗传修饰）或组成性激活可能起到抑制自噬的“纠正”措施的作用。重要的是要确定在乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌的自然病史中p53和Beclin-1失活的顺序（或PI-3K/Akt途径被激活），以及这与癌前细胞和恶性细胞自噬能力增强或降低的关系。
方法
单元格和在体外治疗
HCT116细胞是B.Vogelstein的礼物15MCF7细胞稳定转染四环素（2μg ml-1)-可抑制的Beclin 1构造是B.Levine的天赋20人胎儿成纤维细胞（HFFF2）和神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞购自ATCC。对于血清和氨基酸饥饿，细胞在无血清厄尔平衡盐溶液培养基（Sigma）中培养，我们称之为无营养培养基7在缺氧条件下（0.1%氧气，5%CO），在无营养培养基中培养细胞48小时，可诱导代谢应激2).
电池（3×104)接种在24孔培养皿中并培养24小时，然后用雷帕霉素（1μM；托克里斯生物科学）、PFT-α（30μM）、突尼斯霉素（2.5μM），thapsigargin（3μM；Calbiochem）、灯盏花素A（20μM）（氯化锂（10 mM）、巴非霉素A1（1 nM）、亮氨酸蛋白酶（100 nM），4-羟基他莫西芬（4-OHT，100 nM，MG132（10μM；Sigma）、Nutlin-3（10μM）或RITA。
质粒、转染和RNA干扰
将80%汇合处的细胞转染在6孔板中，转染寡效胺（Invitrogen）和siRNAs（100 nM）。siRNA-介导的蛋白下调由免疫印迹或用特异性引物的RT-PCR控制。使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）进行瞬时转染，转染24小时后使用细胞，除非另有说明。将空载体单独或与编码GFP-LC3的质粒一起转染细胞(参考50)，无论是否存在p53 NES-，p53 NLS-（伊利诺伊州芝加哥大学放射与细胞肿瘤学系C.G.Maki赠送），p53 ERTam公司，p53 ERTam公司ΔPP（来自田纳西州孟菲斯市圣裘德儿童医院免疫科J.Chipuk的礼物），p53ΔI（来自英国格拉斯哥比森癌症研究所K.Vousden的礼品），p53WT，p53ER，p53ERR175H或p53 R175H27,36.
GFP-LC3点的量化
通过计算显示GFP-LC3在点状或空泡中积聚的细胞百分比来量化自噬真空，在三个独立实验中每个制剂至少100个细胞）。在细胞质和细胞核中呈弥漫分布的GFP-LC3的细胞被认为是非自噬性的，而代表几个无核GFP-LC2的密集点状GFP-LC4聚集体的细胞被归类为自噬细胞。两名独立研究人员（E.T.和M.C.M.或E.M.）读取每个GFP-LC3染色。为了研究饥饿对携带GFP-LC3转基因的6周龄小鼠p53表达的影响+/+或p53-/-背景被剥夺24小时的食物，但可以免费获得饮用水。
致谢
我们感谢水岛县的GFP-LC3转基因小鼠、莱文和沃格尔斯坦的细胞系、J.Chipuk、C.G.Maki、M.Oren和K.Vousden的突变p53质粒、E.Zaharioudaki、B.Gardie-Capdeville、C.Ladrou、M.R.Duchen、A.Jalil、F.Fanelli和A.Petrini的专家协助。这个cep-1（gk138）突变菌株（TJ1）由隐杆线虫病遗传中心，由NIH国家研究资源中心（NCRR）资助。N.T.由EMBO和欧盟第六框架计划资助。F.C.由Fondazione Telethon、AIRC、Compagnia di San Paolo和意大利卫生部资助。E.T.获得了美国国家癌症研究所（INCa）的博士研究金。G.K.得到了国家癌症防治法、国家癌症防治局、国家癌症预防控制委员会、INCa、医学康复基金会和欧盟（Active p53、Apo-Sys、ApopTrain、ChemoRes、TransDeath、RIGHT）的支持。
脚注
注：补充信息可在Nature Cell Biology网站上获得。
竞争性金融利益作者声明没有竞争性的经济利益。
工具书类
1Levine B，Kroemer G.自噬在疾病发病机制中的作用。单元格。2008;132:27–42. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 2Levine B，Yuan J.细胞死亡中的自噬：一个无辜的罪犯？临床杂志。投资。2005;115:2679–2688. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 三。Degenhardt K等人。自噬促进肿瘤细胞存活并限制坏死、炎症和肿瘤发生。癌细胞。2006;10:51–64. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 4Qu X等。胚胎发育期间凋亡细胞的自噬基因依赖性清除。单元格。2007;128:931–946.[公共医学][谷歌学者] 5Matthew R、Karantza-Wadsworth V、White E.自噬在癌症中的作用。《自然·癌症评论》。2007;7:961–967. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 6Kroemer G、Jaattela M.溶酶体和细胞死亡控制中的自噬。《自然·癌症评论》。2005;5:886–897.[公共医学][谷歌学者] 8Maiuri C、Zalckvar E、Kimchi A、Kroemer G.自噬与自杀：自噬和凋亡之间的相互作用。《自然》杂志分子细胞生物学版。2007;8:741–752.[公共医学][谷歌学者] 9Vousden KH，车道DP。p53与健康和疾病。《自然》杂志分子细胞生物学版。2007;8:275–283.[公共医学][谷歌学者] 10冯Z，张华，莱文AJ，金S。细胞内p53和mTOR通路的协同调节。程序。美国国家科学院。科学。美国。2005;102:8204–8209. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 11Martins CP、Brown-Swigart L、Evan GI。肿瘤中p53修复的治疗效果建模。单元格。2006;127:1323–1334.[公共医学][谷歌学者] 13.Amaravadi RK等。在Myc诱导的淋巴瘤模型中，自噬抑制增强治疗诱导的凋亡。临床杂志。投资。2007;117:326–336. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 14Crighton D等。DRAM是p53诱导的自噬调节剂，对细胞凋亡至关重要。单元格。2006;126:121–134.[公共医学][谷歌学者] 15Bunz F等人。人类癌细胞中p53的破坏改变了对治疗药物的反应。临床杂志。投资。1999;104:263–269. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 16Komarov PG等人。一种保护小鼠免受癌症治疗副作用的p53化学抑制剂。科学。1999;285:1733–1737.[公共医学][谷歌学者] 17Klonsky DJ，al.e.高等真核生物自噬监测分析的使用和解释指南。自噬。2008;4:151–175. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 18水岛N、山本A、松井M、吉森T、大树Y。体内利用表达荧光自噬体标记的转基因小鼠分析营养素饥饿后的自噬反应。分子生物学。单元格。2004;15:1101–1111. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 19Criollo A等。肌醇三磷酸受体对自噬的调节。细胞死亡不同。2007;14:1029–1039.[公共医学][谷歌学者] 20Liang XH，等。beclin 1诱导自噬和抑制肿瘤发生。自然。1999;402:672–676.[公共医学][谷歌学者] 21Mizushima N，Yoshimori T.如何解释LC3免疫印迹。自噬。2007;三[公共医学][谷歌学者] 22Meley D等。AMP激活的蛋白激酶和自噬蛋白水解的调节。生物学杂志。化学。2006;281:34870–34879.[公共医学][谷歌学者] 23Faivre S，Kroemer G，Raymond E.mTOR抑制剂作为抗癌药物的最新发展。Nature Rev.药物发现。2006;5:671–688.[公共医学][谷歌学者] 24Lum JJ、DeBerardinis RJ、Thompson CB。后生动物的自噬：丰富土地上的细胞生存。自然修订版分子细胞生物学。2005;6:439–448.[公共医学][谷歌学者] 25Talos F，Petrenko O，Mena P，Moll UM.线粒体靶向p53具有抑癌活性体内.癌症研究。2005;65:9971–9981.[公共医学][谷歌学者] 26Baker SJ等。结直肠癌17号染色体缺失和p53基因突变。科学。1989;244:217–221.[公共医学][谷歌学者] 27Tomita Y等，WT p53，但不是肿瘤衍生突变体，通过DNA结合域与Bcl2结合并诱导线粒体通透性。生物学杂志。化学。2006;281:8600–8606.[公共医学][谷歌学者] 28Vater CA、Bartle LM、Dionne CA、Littlewood TD、Goldmacher VS。他莫昔芬激活E1A和T24 H-ras转化的p53雌激素受体融合蛋白诱导凋亡-/-小鼠胚胎成纤维细胞。致癌物。1996;13:739–748.[公共医学][谷歌学者] 29Ogata M等人。内质网应激后，细胞存活激活自噬。分子细胞生物学。2006;26:9220–9231. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 30Qu L等。内质网应激通过涉及糖原合成酶激酶-3beta的途径诱导p53细胞质定位并阻止p53依赖性凋亡。基因发育。2004;18:261–277. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 31Pluquet O，Qu LK，Baltzis D，Koromilas AE.内质网应激通过Hdm2和糖原合成酶激酶3β的协同作用加速p53降解分子细胞生物学。2005;25:9392–9405. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 32Yorimitsu T，Nair U，Yang Z，Klinsky DJ。内质网应激触发自噬。生物学杂志。化学。2006;281:30299–30304. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 33.Vassilev LT等人。体内MDM2小分子拮抗剂激活p53通路。科学。2004;303:844–848.[公共医学][谷歌学者] 34Issaeva N等。小分子RITA与p53结合，阻断p53-HDM-2相互作用并激活肿瘤中的p53功能。自然医学。2004;10:1321–1328.[公共医学][谷歌学者] 35Kubbutat MH、Jones SN、Vousden KH。Mdm2对p53稳定性的调节。自然。1997;387:299–303.[公共医学][谷歌学者] 36Mihara M等人。p53在线粒体上具有直接的凋亡作用。分子细胞。2003;11:577–590.[公共医学][谷歌学者] 37Chipuk JE，Maurer U，Green DR，Schuler M。p53的药理学激活在缺乏转录的情况下诱导Bax依赖性细胞凋亡。癌细胞。2003;4:371–381.[公共医学][谷歌学者] 38Chipuk JE等。p53直接激活Bax介导线粒体膜通透性和凋亡。科学。2004;303:1010–1014.[公共医学][谷歌学者] 39Pattinge S等。Bcl-2抗凋亡蛋白抑制Beclin 1依赖性自噬。单元格。2005;122:927–939.[公共医学][谷歌学者] 40Leu JI、Dumont P、Hafey M、Murphy ME、George DL。线粒体p53激活Bak并导致Bak-Mcl1复合物的破坏。自然细胞生物学。2004;6:443–450.[公共医学][谷歌学者] 41Maiuri MC等。Beclin-1中Bcl-X（L）和BH3-样结构域之间的功能和物理相互作用。EMBO J。2007;26:2527–2539. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 42Feng Z等。p53对AMPKβ1、TSC2和PTEN表达的调节：应激、细胞和组织特异性，以及这些基因产物在调节IGF-1-AKT-mTOR途径中的作用。癌症研究。2007;67:3043–3053.[公共医学][谷歌学者] 43Fabbro M，Henderson BR。核质穿梭对肿瘤抑制因子的调节。实验细胞研究。2003;282:59–69.[公共医学][谷歌学者] 44Toledo F，Wahl GM.调节p53途径：在体外假设，体内真实性.《自然·癌症评论》。2006;6:909–923.[公共医学][谷歌学者] 45Lim YP等，《p53知识库：p53研究的综合信息资源》。致癌物。2007;26:1517–1521.[公共医学][谷歌学者] 46Jones RG等。AMP活化蛋白激酶诱导p53依赖性代谢检查点。分子细胞。2005;18:283–293.[公共医学][谷歌学者] 47Rubinsztein DC、Gestwicki JE、Murphy LO、Klinsky DJ。自噬的潜在治疗应用。Nature Rev.药物发现。2007;6:304–312.[公共医学][谷歌学者] 48Hanahan D，Weinberg RA。癌症的特征。单元格。2000;100:57–70.[公共医学][谷歌学者] 49Brahimi-Horn MC，Chiche J，Pouyssegur J.缺氧信号控制代谢需求。货币。操作。细胞生物学。2007;19:223–229.[公共医学][谷歌学者] 50Kabeya Y等。LC3是酵母Apg8p的哺乳动物同源物，加工后定位于自噬体膜。EMBO J。2000;19:5720–5728. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 
