赖氨酸缺失的TRAF6 N-末端-聚合酶B融合蛋白与TAK1相互作用并激活TAK1，诱导NFκB和AP-1报告活性。（A） 在环指、锌指和线圈线圈域（TRAF6 K32-348R）（顶部）或环指、锌指和线圈圈域中产生含有赖氨酸（K）到精氨酸（R）突变的鼠TRAF6突变版本，但TRAF6-C域替换为回旋酶B人工寡聚化域（TRAF 6（1-358）ΔK-回转体B）（底部）。（B） 将显示的全长版本的FLAG-TRAF6转染293T细胞，然后用FLAG免疫沉淀裂解产物，并用在体外使用重组WT、仅K48或仅K63泛素，在有或无ATP的情况下泛素化。用抗TRAF6免疫印迹法检测未修饰和修饰的TRAF6。（C） 将等量（1µg）表位标记的TAK1（Myc）与野生型（WT）、环突变体（C70A）或赖氨酸缺陷型（ΔK）TRAF6（1-358）-回旋酶B（FLAG）表达质粒联合转染293T细胞，并用抗FLAG琼脂糖进行免疫沉淀（IP）。IP和全细胞提取物（WCE）用抗Myc或抗FLAG进行免疫印迹。（D） 将10 ng TAK1与野生型（WT）、环突变体（C70A）或赖氨酸缺陷型（ΔK）TRAF6（1-358）-回旋酶B（FLAG）表达质粒联合转染293T细胞，在收获前未经处理或用Coumermycin A处理5分钟，然后用抗FLAG琼脂糖IP处理。IP和全细胞提取物（WCE）用所示的抗磷酸TAK1（T187）、抗TAK1或抗FLAG进行免疫印迹。（E） 如图所示，用NFκB-荧光素酶（E）或AP-1-荧光素酶（F）加WT、C70A或K32-348R TRAF6（1-358）-回旋酶B转染（F）293T细胞。细胞裂解物通过荧光素酶报告分析进行分析。数值表明比背景增加了倍，并根据β-半乳糖苷酶内部标准进行了标准化。
