单元格元数据。2008年9月3日;8(3-3): 224–236.
SREBP活性受mTORC1调节并参与Akt依赖性细胞生长
,1 ,1,7 ,1,7 ,2 ,三 ,4 ,5 ,6和1,∗
托马斯·波斯特曼
1基因表达分析实验室,44 Lincoln’s Inn Fields,London WC2A 3PX,UK
克劳迪奥·桑托斯
1基因表达分析实验室,44 Lincoln’s Inn Fields,London WC2A 3PX,UK
比阿特丽斯·格里菲斯
1基因表达分析实验室,44 Lincoln’s Inn Fields,London WC2A 3PX,UK
梅根·卡利
2信号转导实验室,44 Lincoln’s Inn Fields,London WC2A 3PX,UK
玛丽·吴
三发展信号实验室,44 Lincoln's Inn Fields,伦敦WC2A 3PX,英国
莎莉·李弗斯
4英国伦敦癌症研究所,44 Lincoln’s Inn Fields,London WC2A 3PX,UK
约翰·格里菲斯
5英国剑桥癌症研究所,李嘉诚中心,Robinson Way,Cambridge,CB2 0RE UK
袁丽忠
6癌症研究英国生物医学磁共振研究小组、英国萨里郡萨顿癌症研究所和皇家马斯登医院
阿尔穆特·舒尔茨
1基因表达分析实验室,44 Lincoln’s Inn Fields,London WC2A 3PX,UK
1基因表达分析实验室,44 Lincoln’s Inn Fields,London WC2A 3PX,UK
2信号转导实验室,44 Lincoln’s Inn Fields,London WC2A 3PX,UK
三英国伦敦WC2A 3PX林肯酒店44号开发信号实验室
4英国伦敦癌症研究所,44 Lincoln’s Inn Fields,London WC2A 3PX,UK
5英国剑桥癌症研究所,李嘉诚中心,Robinson Way,Cambridge,CB2 0RE UK
6癌症研究英国生物医学磁共振研究小组、英国萨里郡萨顿癌症研究所和皇家马斯登医院
7这些作者对这项工作贡献均等
接收日期:2007年12月22日;2008年5月12日修订;2008年7月25日验收。
- 补充资料
文件S1。十四个数字和补充实验程序
GUID:5A6E6740-2760-49BF-9D15-92D8212C11D6
总结
细胞生长(质量积累)需要与合成大分子所需的代谢过程相协调。PI3-激酶/Akt信号通路通过激活雷帕霉素靶标(TORC1)的复合物1诱导细胞生长。这里我们显示Akt依赖性脂肪生成需要mTORC1活性。此外,成熟形式的固醇反应元件结合蛋白(SREBP1)的核积累和SREBP靶基因的表达被mTORC1抑制剂雷帕霉素阻断。我们还表明,沉默SREBP可以阻断Akt依赖性脂肪生成,并减弱体外Akt激活引起的细胞大小增加。苍蝇中dSREBP的沉默导致细胞和器官尺寸减小,并阻止dPI3K诱导细胞生长。我们的研究结果表明,PI3K/Akt/TOR途径以协调的方式调节蛋白质和脂质的生物合成,这两个过程都是细胞生长所必需的。
关键词:人体疾病,信号
结果
mTORC1在Akt依赖性细胞生长和脂质生物合成中的作用
Akt通过mTOR/S6K途径激活蛋白质生物合成,参与哺乳动物和无脊椎动物系统中细胞生长的调节(Sarbassov等人。,2005). 为了研究从头合成脂质在Akt调控细胞生长中的作用,我们使用表达Akt1激酶条件等位基因(myrAkt-ER)的永生化人视网膜色素上皮细胞(RPE)(Porstmann等人。,2005). 细胞培养在补充有1%脂蛋白缺乏血清(LPDS)的培养基中,以减少内源性Akt的激活并限制外源性脂质的可用性。通过添加4-羟基三苯氧胺(4-OHT)激活myrAkt-ER导致中位细胞体积(MCV)增加20%-30%(A和1B)。同时使用特异性mTORC1抑制剂雷帕霉素治疗可消除Akt依赖性细胞体积增加。雷帕霉素在缺乏Akt激活的情况下不会影响细胞大小,因为实验是在血清饥饿条件下进行的。然而,雷帕霉素显著降低了细胞蛋白质含量的Akt依赖性增加(图S1). 重要的是,在这里使用的条件下,我们没有观察到Akt激活后细胞周期分布的显著变化(数据未显示)。
mTORC1是Akt依赖性细胞生长和诱导脂质合成所必需的
(A) 用100 nM 4-羟基三苯氧胺(4-OHT)或溶剂(乙醇)在含有1%脂蛋白缺乏血清(LPDS)的培养基中处理RPE myrAkt-ER细胞24小时,并加入或不加入50 nM雷帕霉素。在(A)中,通过测量电子电池体积来确定电池大小。
(B) 与溶剂对照相比,Akt活化引起的中位细胞体积(MCV)的变化。
(C) 在含有1%LPDS的培养基中,用乙醇(深灰色条)、4-OHT(黑色条)、雷帕霉素(开放条)或雷帕霉素和4-OHT处理RPE-myrAkt-ER细胞48小时。通过使用NMR光谱测量培养物上清液中的代谢物浓度来测定葡萄糖摄取和乳酸产生。代谢物水平根据细胞数量进行标准化,并与无细胞培养基进行比较。数值表示相对于乙醇处理的细胞的平均百分比变化。(∗)p≤0.01乙醇对4-OHT。
(D) RPE-myrAkt-ER细胞按(A)中的方法处理,并掺入D-[6-14C] 葡萄糖,[2-14C] -丙酮酸和[1-14C] -醋酸盐转化为细胞脂质。
(E) 从按(C)处理的细胞中提取细胞脂质,并通过核磁共振波谱进行分析。代谢物浓度根据细胞数进行标准化,数值代表相对于乙醇处理细胞的平均百分比变化。(∗)p<0.01乙醇对4-OHT;(∗∗)4-OHT与4-OHT加雷帕霉素相比p<0.05。UFA,不饱和脂肪酸;FA,饱和脂肪酸;PE=磷脂酰乙醇胺;PC=磷脂酰胆碱;PG=磷脂酰甘油。
(F) 在60μM SB20490存在或不存在的情况下,用4-OHT刺激RPE-myrAkt-ER细胞24小时,并测定细胞体积。
(G) 在60μM SB20490存在或不存在的情况下,激活Akt后MCV的变化。在(B)、(D)和(G)中,误差线代表标准偏差(SD)。在(C)和(E)中,误差条代表平均值的标准误差(SEM)。
接下来,我们使用核磁共振波谱(NMR)测量了激活myrAkt-ER前后介质代谢物浓度的变化。Akt激活诱导RPE细胞中葡萄糖摄取和乳酸生成增加近2倍(C) 与Akt在激活葡萄糖摄取和糖酵解中的作用一致。雷帕霉素存在时,Akt依赖性葡萄糖摄取和乳酸生成被完全阻断(C) ●●●●。同样,我们观察到雷帕霉素治疗降低了Akt依赖性氨基酸摄取和细胞氨基酸含量(图S2). 对放射性葡萄糖、丙酮酸或醋酸盐并入细胞脂质的分析表明,Akt活化导致葡萄糖依赖性脂肪生成显著增加。关键的是,雷帕霉素治疗完全阻断了这种情况(D) 表明Akt激活从头合成脂质需要mTORC1功能。
我们之前已经证明Akt可以诱导细胞内脂质的积累,包括磷酸甘油酯(Porstmann等人。,2005).E显示雷帕霉素抑制mTORC1可防止Akt依赖性的不饱和脂肪酸(UFA)和饱和脂肪酸的积累以及磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰甘油(PG)水平(E) ●●●●。
接下来,我们询问是否需要诱导脂质生物合成才能使Akt依赖性细胞增大。脂肪酸的生物合成需要细胞质乙酰辅酶A,它由ATP-柠檬酸裂解酶(ACLY)产生。体内肿瘤生长需要ACLY功能(Bauer等人。,2005; Hatzivassiliou等人。,2005). 使用抑制剂SB204990抑制ACLY可减弱RPE细胞中Akt依赖性细胞体积增加(F和1G)。
Akt激活SREBP1
对敲除小鼠的研究表明SREBP1a和1c选择性参与脂质生物合成的调节(Liang等人。,2002)脂肪生成基因的启动子在体内优先与SREBP1a结合(Bennett等人。,2004). 成熟的SREBP1可以在核裂解物中检测到,作为扩散带迁移到60-65kDa之间。A和2B表明,在Akt激活后2小时内可以检测到核mSREBP1的积累。mSREB1的诱导先于全长SREBP1的增加,这可以在Akt激活8小时后检测到(A、 2B和第3章). Akt激活4小时和8小时后,可以分别检测到FASN mRNA和蛋白表达的增加(C和2D)。甾醇阻断了核mSREBP1和FASN表达对Akt激活的诱导(E和2F)。甾醇诱导SCAP的构象变化,从而诱导INSIG结合,从而阻止SREBP/SCAP复合物的ER/Glgi易位和SREBP的加工(Sun等人。,2005). 观察到的对固醇治疗反应的flSREBP的诱导很可能是由于肝脏X受体(LXR)的激活(Repa等人。,2000) (F) ●●●●。
Akt诱导mSREBP1在细胞核内快速积累
(A) RPE myrAkt-ER细胞在含有1%LPDS的培养基中培养16小时,并用100 nM 4-OHT处理指定时间。制备核提取物并分析成熟SREBP1(mSREB1)的表达。在上清液中检测到全长SREBP1(flSREBP)。
(B) RPE细胞中响应Akt激活的成熟和flSREBP1水平的定量表示。
(C和D)细胞用100 nM 4-OHT处理指定时间。qPCR检测FASN的相对mRNA丰度。将数值归一化为GAPDH,并显示相对于溶剂处理对照的数值。图(D)显示了两个独立实验的代表性,实验重复进行。从与(C)平行处理的细胞制备的全细胞裂解物用于测定FASN、flSREBP1和磷酸化Akt-ER的丰度。
(E) 细胞在含有1%LPDS的培养基中培养,并在存在或不存在10μg/ml胆固醇和1μg/ml 25-羟基胆固醇(甾醇)混合物的情况下,用100 nM 4-OHT或溶剂处理2小时,并分析核提取物中mSREBP1的表达。
(F) 在存在或不存在甾醇的情况下,用100 nM 4-OHT处理细胞24小时。分析全细胞裂解物中FASN、flSREBP1和磷酸化Akt-ER的表达。
(G) 细胞在含有1%LPDS的培养基中培养16小时,然后置于无葡萄糖培养基或含有2.5 mM葡萄糖的培养基。如图所示,用2-脱氧葡萄糖(2-DG)和4-OHT处理细胞。制备核提取物并分析其是否存在mSREBP1。
(H) 在用100 nM 4-OHT刺激24小时之前,将细胞置于含有1%LPDS的无糖培养基或添加2.5 mM葡萄糖或葡萄糖和2-DG的培养基中30分钟。分析全细胞裂解物中FASN和全长SREBP1的表达。
(一) 用4-OHT处理细胞2小时,用或不用AICAR预处理30分钟。分析核提取物中是否存在mSREBP1。误差条代表SD。
Akt通过诱导葡萄糖转运蛋白表达和膜定位诱导葡萄糖摄取,并通过激活己糖激酶增强糖酵解活性(曼宁和坎特利,2007年). 接下来,我们询问了SREBP1的Akt依赖性激活是否需要葡萄糖。缺乏葡萄糖或使用2-脱氧葡萄糖(糖酵解抑制剂)治疗可阻断mSREBP1的Akt依赖性积累(G) 并阻止SREBP靶基因的诱导(H) 。葡萄糖饥饿或糖酵解抑制后的能量消耗可能导致AMPK激活(哈迪和卡林,1997年). AICAR激活AMPK还阻止mSREBP1对Akt激活的反应(一) 并阻止SREBP靶基因的诱导(图S4). 这些结果表明,Akt对SREBP1的激活受细胞能量状态的调节。
SREBP1激活和脂质生成需要mTORC1
mTORC1的活性受生长因子信号转导、营养物质可用性和能量平衡调节(Sarbassov等人。,2005). 因此,我们测试了Akt对SREBP1的调节是否涉及mTORC1。雷帕霉素可阻止mSREBP1对Akt激活的核累积(A) ●●●●。同样,雷帕霉素治疗阻断了FASN和ACLY mRNA和蛋白水平的诱导(B和3C)。重要的是,雷帕霉素治疗完全消除了核糖体蛋白S6的磷酸化诱导,但仅对GSK3或ACLY的磷酸化有轻微影响,表明myrAkt-ER融合蛋白的活性不受雷帕霉素的影响(C) ●●●●。此外,雷帕霉素治疗还阻断了胰岛素依赖性诱导的FASN蛋白和mRNA(图S5A和S5B)和mTOR的异位表达足以在U2OS细胞中诱导mSREBP1和FASN的表达,而无myrAkt-ER激活(图S5C) ●●●●。
依赖Akt激活SREBP1和脂肪生成需要mTORC1活性
(A) RPE-myrAkt-ER细胞在含有1%LPDS的培养基中培养16小时,并用100 nM 4-OHT处理2小时,用或不用50 nM雷帕霉素预处理30分钟。制备核提取物并分析mSREBP1的表达。
(B) 细胞在含有1%LPDS的培养基中培养,并在存在或不存在50 nM雷帕霉素的情况下用100 nM 4-OHT或溶剂处理24小时。提取总RNA并用qPCR分析ACLY和FASN的表达。值被标准化为GAPDH,并且代表三个独立实验中的一个。
(C) 用(B)中处理的细胞的全细胞裂解液测定FASN、ACLY和flSREBP1的丰度以及ACLY与GSK3α/β的磷酸化。
(D) 用1μg myc-SREBP1(aa 1-490)野生型或T426A/S430A突变体表达载体转染细胞。转染24小时后,将细胞置于含有1%LPDS的培养基中,用100 nM 4-OHT或溶剂在50 nM雷帕霉素存在或不存在的情况下处理24小时。使用9E10抗体测定myc-mSREBP1的丰度。
(E) 用SREBP1和SREBP2(BP1+BP2)、mTOR、raptor、rictor或非特异性对照的100 nM siRNA寡核苷酸转染细胞。转染72小时后,将细胞置于含有1%LPDS的培养基中,用4-OHT处理24小时。用裂解液确认沉默效率并测定FASN和ACLY的表达。
(F) 平行于(E)处理的细胞用于测定D-[6的掺入-14C] 葡萄糖,[2-14C] -丙酮酸或[1-14C] -将醋酸盐转化为脂肪组分。误差条代表SD。
成熟的SREBP蛋白高度不稳定,并通过泛素依赖途径快速降解(Hirano等人。,2001). 已经证明,GSK3可以磷酸化mSREBP。这种磷酸化使Fbw7泛素连接酶结合并诱导SREBP蛋白降解。接下来,我们询问Akt是否影响mSREBP的稳定性。Akt的激活增加了转染的myc标记的野生型mSREBP1(氨基酸1-490)的水平(D) ●●●●。当GSK3的两个磷酸化位点突变为丙氨酸时,这种效应被消除。有趣的是,在雷帕霉素存在的情况下,仍然可以观察到外源野生型mSREBP的Akt依赖性积累,这表明mTORC1功能对于响应Akt激活的mSREBP1的稳定是可有可无的。此外,使用化学抑制剂SB216763抑制GSK3并不能阻止内源性mSREBP1的Akt依赖性积累、FASN蛋白的诱导或对Akt激活的FASN启动子活性的反应(图S6). 这些结果表明,内源性SREBP的Akt依赖性激活不仅涉及SREBP稳定性的调节,而且还暗示了一个额外的mTORC1依赖性途径,该途径有助于SREBP激活。
以前有人认为雷帕霉素治疗也会影响某些细胞类型中mTORC2的活性(Sarbassov等人。,2006). 我们自己的研究结果表明,长期使用雷帕霉素治疗可通过抑制此处使用的细胞系中的负反馈环而激活Akt磷酸化(图S7). 为了解决mTORC2在调节脂肪生成基因表达中的任何潜在参与,我们使用siRNA分别选择性地消除mTORC1或mTORC3的组成部分猛禽或猛禽的表达。沉默mTOR和猛禽显著降低S6磷酸化(E) rictor沉默导致苏氨酸450的Akt磷酸化降低(图S8),已被证明是mTORC2的底物(Facchinetti等人。,2008; Ikenoue等人。,2008). 沉默mTOR或猛禽,但不沉默rictor,可阻止Akt依赖性诱导FASN和SREBP1表达(E) ●●●●。沉默mTORC1或mTORC2组分不会影响SREBP2的表达。沉默mTOR还可以阻断U2OS细胞中Akt依赖性FASN和ACLY的诱导(图S9). 我们还探讨了SREBP在Akt激活诱导从头合成脂质中的作用。F表明,沉默SREBP1和2会阻止葡萄糖、丙酮酸或醋酸盐并入细胞脂质。此外,mTOR或猛禽的沉默,而不是猛禽的沉默,消除了对Akt激活的脂肪生成诱导(F) ●●●●。
哺乳动物细胞生长需要SREBP
接下来,我们询问SREBP诱导脂肪基因表达是否参与哺乳动物细胞生长的调节。以SREBP1和2为靶点的siRNA寡核苷酸的转染以剂量依赖性的方式显著降低了RPE细胞中Akt激活引起的细胞大小增加(A和4B)。同样,当SREBP1和2被沉默时,对Akt激活的FASN表达诱导减少(C) ●●●●。当使用不同的siRNA序列沉默SREBP1和2时,获得了类似的结果(数据未显示)。这些结果表明,SREBP的激活和SREBP靶基因的表达是哺乳动物细胞体外高效生长所必需的。
沉默SREBP1抑制Akt诱导的哺乳动物细胞生长
(A) 用SREBP1和SREBP2(BP1+BP2)特异性的50或100 nM siRNA寡核苷酸或非特异性对照物转染RPE-myrAkt-ER细胞。转染后72小时,将细胞置于含有1%LPDS的培养基中,用100 nM 4-OHT或溶剂处理24小时,并测定细胞大小。
(B) 相对于溶剂对照,Akt活化后中位细胞体积(MCV)的变化。
(C) 用与(A)平行处理的细胞的全细胞裂解液测定FASN、SREBP1、SREBP2和磷酸化Akt-ER的水平。误差条代表SD。
SREBP在细胞和器官大小控制中的作用果蝇
HLH106型已被鉴定为苍蝇中单个SREBP亚型的基因编码,dSREBP在其DNA结合域内与人类SREBP1具有显著的序列同源性(Seegmiller等人。,2002).
我们首先测量了dSREBP或dFAS的瞬时沉默对果蝇细胞系Kc167。A和5B显示dSREBP或dFAS的沉默导致G1细胞的平均细胞体积和FSC的显著降低。同时沉默TSC2并不能挽救观察到的细胞大小减少。有趣的是,Kc167细胞的胰岛素治疗导致脂肪酸和磷酸甘油酯水平增加,与哺乳动物细胞中Akt激活后的结果类似(图S10).
dSREBP的沉默降低了细胞和器官的大小果蝇
(A) 在没有或存在dTSC2 dsRNA的情况下,用对应于GFP、dSREBP或dFAS的dsRNA处理Kc167细胞5天,并测定电子细胞体积。
(B) 用流式细胞仪(FACS)测定G1群体FSC-A。
(C) dSREBP RNAi在胚胎发生过程中使用无女儿-GAL4(da-GAL4)驱动程序。用qPCR方法检测二龄幼虫dSREBP(白条)和dFAS(灰条)的表达。转录水平归一化为肌动蛋白mRNA水平,代表三个独立的实验。(RNAi-S1,单插入,RNAi-S2和RNAi-S3,双插入)。
(D) 表达dSREBP RNAi的雌性苍蝇的代表性表型da-GAL4号机组驾驶员与控制装置的比较(yw公司).
(E) 表达dSREBP的果蝇翅膀RNAi-S3在翅膀的背侧细胞层。
(F) 机翼控制面积分析(yw公司)、dSREBPRNAi-S1、dSREBPRNAi-S2和dSREBPRNAi-S3. (∗)p≤10−5.
(G) 表达dSREBP的果蝇翅膀RNAi-S3在发育中的翅膀的后部。
(H) 对照苍蝇(白色条)或在翅膀后室表达SREBP RNAi-2(灰色条)或SREBP RNA Ai-3(黑色条)的苍蝇的翅膀面积变化。(∗)p≤10−8.
(一) 如(G)所示,机翼前后舱室的高分辨率图像。
(J) 表达GFP(白条)或dSREBP的苍蝇翅膀上皮细胞数量的变化RNAi-S3(黑条)位于机翼后部。误差条代表SD。
为了探讨dSREBP在体内细胞生长调节中的作用,我们在UAS启动子的控制下,产生了一系列表达反向重复RNA的转基因果蝇。使用三种不同的飞行路线(RNAi-S1、RNAi-S2和RNAi-S3)进行分析。使用没有女儿的(da)-镀锌4驱动因子导致幼虫中dSREBP和dFAS的表达降低(C) ●●●●。三个RNAi株系的沉默效率存在差异,RNAi-S3的沉默效果最强(C) ●●●●。胚胎发生过程中dSREBP的沉默导致幼虫和蛹期的剂量依赖性发育延迟和死亡(图S11). 成年后的苍蝇表现出显著的体型缩小、体重减轻和翅膀面积减小(D和第12节). RNAi-S3飞行系与da-GAL4号机组驱动程序。这与dSREBP在幼虫发育过程中的重要作用一致(Kunte等人。,2006).
胰岛素信号通路成分的缺失或过度表达以细胞自主方式影响细胞大小(Weinkove等人。,1999). 因此,我们询问了dSREBP是否在细胞的特定隔室中沉默果蝇翅膀会影响细胞和器官的大小。E和5F显示dSREBP RNAi盒在背翼室的表达(MS1096-GAL4)导致成虫翅膀面积的剂量依赖性减少。类似地,使用雕刻的(英语)-GAL4驾驶员导致机翼后室面积缩小(G和5H)。此外,后室的缩小伴随着翅膀上皮细胞密度的增加(I和5J),表明dSREBP沉默会导致细胞尺寸减小。我们还研究了通过基因沉默以外的方式抑制dSREBP功能是否会导致类似的生长抑制。哺乳动物SREBP中N末端反式激活结构域的缺失导致SREBP功能的显性抑制(佐藤等人。,1994).MS1096-镀锌4-N末端缺失的dSREBP(DN75)或除N末端(DN75T)外跨膜结构域被删除的突变体的驱动表达导致翅膀面积显著减少(图S13).
SREBP是PI3K通路的靶点果蝇
接下来我们询问PI3K/Akt通路是否调节苍蝇SREBP的活性。PI3K、dp110或dAkt催化亚基的瞬时沉默降低了Kc167细胞中dFAS和dSREBP的mRNA丰度(A) ●●●●。相反,dPTEN沉默导致两种转录物的表达增加(A) ●●●●。使用da-GAL4号机组与对照组相比,驱动因子导致二龄幼虫的dSREBP和dFAS表达增强(B) 表明PI3K/Akt途径激活dSREBP功能。
dSREBP受PI3K通路调节,是dp110依赖性细胞生长所必需的
(A) 用对应于GFP、dSREBP、dFAS、dp110、dAKT和dPTEN的dsRNA处理Kc167细胞5天。qPCR检测dSREBP(白色条)和dFAS(灰色条)的表达。数值被归一化为肌动蛋白mRNA水平,并显示了重复进行的三个实验的代表性。
(B) 通过qPCR分析发育过程中普遍表达dp110的二龄幼虫的dSREBP(白条)和dFAS(灰条)。数值标准化为肌动蛋白mRNA水平。
(C) 在UAS启动子控制下表达fl-dSREBP或m-dSREBP的苍蝇与表达GAL4的苍蝇杂交(MS1096-G4型)或翅膀背细胞层的dp110和GAL4(MS1096-G4-UAS-dp110). 显示了具有代表性的单个苍蝇。箭头表示翅膀严重畸形。
(D) 表达dSREBP果蝇的翅膀大小分析RNAi-S2或dSREBPRNAi-S3带有(MS1096-G4-UAS-dp110)或不带(MS1096-G4型)dp110的共表达。n≥7个机翼;(∗)p≤5×10−8.
(E) 果蝇翅膀面积的量化dSREBP公司RNAi-S3带有(dpp-G4-UAS-dp110[KD])或不带(dpp-G4型)激酶头dp110的共表达。误差条代表SD。
成熟dSREBP(m-dSREBP)的表达MS1096-镀锌4当苍蝇在25°C下饲养时,驾驶员造成了显著的致命性(数据未显示)。当苍蝇在18°C下饲养时(导致GAL4/UAS系统活性降低),观察到翅膀严重变形(C) ●●●●。即使在25°C下饲养苍蝇,翅膀中全长型dSREBP(fl-dSREBP)的表达也不会造成严重的翅膀畸形。然而,dp110和全长dSREBP的共同表达导致翅膀严重变形,这与m-dSREBP表达引起的表型相似(C) ●●●●。这一结果表明,全长dSREBP的活性被PI3K信号增强。
dp110的表达导致翅膀过度生长表型,表现为翅膀表面积增加15%–20%(Leevers等人。,1996; Radimerski等人。,2002) (D) ●●●●。dSREBP的沉默减弱了dp110表达诱导的翅膀尺寸增加(D) ●●●●。使用靶向dSREBP的非重叠RNAi序列或通过dSREB基因的杂合缺失获得了类似的结果(图S14).
PI3K激酶域突变体(dp110[KD])的表达降低了细胞和器官的大小果蝇(Leevers等人。,1996). 使用十脑麻痹(dpp)-GAL4驱动程序使dpp(数据处理程序)隔间。dSREBP RNAi发夹的表达导致翅膀面积小而显著的减少(E) ●●●●。然而,dSREBP RNAi与dp110KD的共表达并没有进一步减小该区室的大小。(E) ●●●●。综上所述,这些结果表明,dp110和dSREBP是调节细胞生长的相同途径的组成部分果蝇.
讨论
细胞生长受到有丝分裂信号通路的严格控制,需要激活生物合成途径来生成大分子,包括蛋白质和脂质。mTOR复合物1(mTORC1)的激活增加了翻译和核糖体的生物生成(Wullschleger等人。,2006)但mTORC1对其他合成代谢过程的影响尚不清楚。
我们在这里表明,在缺乏有丝分裂原的情况下,Akt的异位激活会导致细胞体积显著增加,并且Akt依赖性的大小增加被mTORC1抑制剂雷帕霉素阻断。NMR对培养基代谢物的分析表明,Akt活化会增加葡萄糖和氨基酸的摄取以及乳酸的分泌。mTORC1参与了Akt依赖性葡萄糖和氨基酸转运蛋白向质膜的移位(爱丁格尔和汤普森,2002年). 我们观察到脂肪酸和磷酸甘油酯在Akt激活后显著积累,并增强了标记的葡萄糖、丙酮酸或醋酸盐并入Akt活化细胞的脂质部分,所有这些都被雷帕霉素阻断。这些结果表明,Akt激活了从头开始的脂肪生成,并且这种作用需要mTORC1活性。
肝细胞对胰岛素治疗或Akt表达的反应显示SREBP1c mRNA水平增加(Azzout-Marniche等人。,2000; Fleischmann和Iynedjian,2000年). 我们之前已经证明,Akt激活导致mSREBP1的核积累,并增强许多SREBP靶基因的表达(Porstmann等人。,2005). 在这里,我们表明mSREB1的核积累很快,并且先于SREBP靶基因的转录诱导以及flSREBP1的增加。应该注意的是srebf1型该基因是正向前馈调节的靶点,因为在其启动子区已鉴定出功能性SRE(Amemiya Kudo等人。,2000). 因此,Akt激活后flSREBP的诱导可能是由于该基因的SRE依赖性转录增强所致。Akt对SREBP1的激活被葡萄糖饥饿、糖酵解抑制或AICAR对AMPK的激活完全阻断。能量剥夺后,AMP/ATP比率增加会激活AMPK。AMPK通过磷酸化ACC调节脂质代谢并诱导脂肪酸生物合成转化为脂肪酸氧化(哈迪和卡林,1997年). 因此,AMPK对SREBP活性的调节可能反映了对能量限制的额外适应。
mTORC1的活性受有丝分裂原调节,但也对细胞能量状态作出反应(Sarbassov等人。,2005). AMPK激活TSC2,从而抑制mTORC1(Inoki等人。,2003). 葡萄糖剥夺或AMPK激活后SREBP1活性的抑制可能由mTORC1介导。我们的结果表明,SREBP1的核积累和SREBP靶基因的诱导需要mTORC1活性。有人认为Her2诱导乳腺癌细胞中FASN和ACC的表达与增加蛋白翻译有关(Yoon等人。,2007). 然而,我们观察到,随着Akt激活,FASN和ACLY mRNA丰度增加。雷帕霉素阻断了FASN和ACLY mRNA的诱导,表明mTORC1参与了SREBP依赖性转录的调节。此外,mTOR或猛禽(而非猛禽)的沉默可消除SREBP1、FASN和ACLY表达的激活,从而证实SREBP依赖性基因表达的调控仅限于mTORC1。
研究表明,GSK3通过诱导泛素连接酶Fbw7的结合来调节mSREBP1的稳定性,从而导致SREBP1的快速降解(Sundqvist等人。,2005). 我们观察到外源性mSREBP对Akt激活的稳定性增加。这取决于两个GSK3磷酸化位点的存在,但在雷帕霉素的存在下仍然可以观察到。因此,Akt可能至少以两种方式调节SREBP活性。Akt通过抑制GSK3依赖性磷酸化增加mSREBP1的稳定性。然而,我们的结果表明,Akt也以GSK3独立、mTORC1依赖的方式调节SREBP1活性。研究表明,显性阴性Akt可阻止SCAP的ER/Glgi易位(Du等人。,2006). TOR与酵母中的囊泡运输有关(Neufeld,2007年)mTOR在内质网和高尔基体的定位在其调节和下游信号传导中起着重要作用(Drenan等人。,2004). 因此,mTORC1或mTORC1-signaling下游的蛋白质,如S6K或4-EBP,似乎可能参与这些隔室中SREBP处理的调节。
我们的结果明确表明,mTORC1参与上皮细胞脂肪生成的调节。沉默mTOR或猛禽,但不沉默rictor,足以消除葡萄糖、丙酮酸或醋酸盐在细胞脂质中依赖Akt的掺入。这种作用似乎对乙酸盐的掺入最为明显,乙酸盐只需要ACC和FASN的活性。猛禽参与脂肪生成的调节也与其在小鼠发育过程中的基本功能相一致(Guertin等人。,2006). 有趣的是,沉默SREBP1和2足以阻止Akt依赖性脂肪生成,并显著降低细胞对Akt激活的反应。这一结果证实了SREBP依赖性基因表达是细胞生长过程中调节脂肪生成的重要机制。
与SREBP在哺乳动物细胞的细胞大小调节中的作用一致,我们观察到dSREBP或其靶基因dFAS的沉默导致细胞大小显著降低果蝇Kc167细胞。有趣的是,dSREBP或dFAS沉默完全阻止了TSC2沉默引起的细胞体积增加。dSREBP在发育中的翼想象盘不同隔室中的沉默导致了成虫相应隔室的缩小,并且是由细胞大小而非细胞数量的减少引起的。
令人惊讶的是,m-dSREBP在翅膀中的表达会导致严重的生长缺陷。此前已有研究表明,mSREBP1a的过度表达通过诱导cdk抑制剂p21、p27和p16导致细胞周期阻滞(Inoue等人。,2005; Nakakuki等人。,2007). SREBP的过度激活也可能导致蛋白质和脂质生物合成之间的失衡,这表明需要严格控制SREBP活性,以允许正常组织发育。Kunte及其同事检测到发育中的脂肪体、中肠以及嗜酸细胞(一种在脂质代谢中具有肝细胞样功能的特殊细胞类型)中的dSREBP激活(古铁雷斯等人。,2007; Kunte等人。,2006). 这种表达模式表明其在脂质代谢中的作用类似于哺乳动物肝脏中SREBP1c的功能。我们的结果与dSREBP的细胞自主作用一致,并表明dSREBP是外周幼虫组织正常生长所必需的。
dSREBP沉默了由dp110在翅膀中过度表达诱导的限制组织生长,并且没有增强表达激酶-dead dp110的翅膀隔室的缩小。这些结果表明,这两种因子是同一途径的组成部分,并表明激活dSREBP是PI3K途径诱导苍蝇细胞生长所必需的。研究PI3K下游dSREBP的调节是否需要TOR是一件有趣的事情。需要进一步的研究来阐明通过参与苍蝇生长调节的信号通路调节dSREBP活性的确切机制。
综上所述,我们的数据与一个模型一致,该模型将SREBP激活置于细胞内信号通路下游,将有丝分裂信号与能量状态和营养物质可用性结合起来(). 它还表明,蛋白质生物合成和脂肪生成在细胞生长过程中以协同方式进行调节。
Akt和mTORC1调节脂质生物合成的模型
Akt和mTORC1在多个水平上调节脂质生物合成。生成线粒体柠檬酸盐需要激活葡萄糖摄取和诱导糖酵解。Akt激活SREBP1可诱导脂类生物合成相关酶的表达,包括ACLY、FASN和ACC。Akt通过抑制GSK3稳定mSREB1。通过未知机制抑制mTORC1阻止mSREBP1的积累,以响应Akt激活。
实验程序
细胞培养和试剂
RPE myrAkt-ER和U2OS myrAct-ER细胞之前已有描述(Porstmann等人。,2005). RPE-myrAkt-ER细胞保存在含有10%FCS、谷氨酰胺和碳酸氢钠的DMEM/HAMS F12(1:1)培养基中。U2OS myrAkt-ER细胞在含有10%FCS和谷氨酰胺的DMEM中生长。对于低固醇浓度的培养,细胞生长在含有1%脂蛋白缺乏血清(LPDS,细胞内)的培养基中。Kc167细胞在含有10%FCS、青霉素/链霉素和谷氨酰胺的施耐德培养基(GIBCO)中培养。抗体、化学物质和质粒的列表在补充实验程序.
细胞大小测定和流式细胞术
使用胰蛋白酶分离RPE myrAkt ER细胞,洗涤并重悬于PBS中。使用Z2库尔特计数器(Multisizer II,Beckman Coulter)一式三份测定中位电子细胞体积。采用离心法收集Kc167细胞并进行上述分析。对于G1特异性细胞大小,将KC167细胞固定并用碘化丙啶染色,测定G1-FSC。实验至少重复了三次。
代谢物分析
收集了两毫升培养基样品,用于分析代谢物浓度。450微升培养基样品与50μl D混合2O、 添加25μl 10 mM TSP钠用于化学位移校准和定量。如前所述,使用双相提取方法提取细胞内代谢物(Tyagi等人。,1996). 在600μl氘化氯仿中重新配制脂质提取物,并使用0.008%v/v四甲基硅烷作为化学位移基准(0ppm)。在600μl D中重建水溶性代谢物2O、 添加25μl 1 mM TSP用于定量和化学位移校准。质子核磁共振谱是使用Bruker 600 MHz(Bruker Avance)核磁共振系统获得的。水溶性和脂质代谢物的光谱峰根据Sitter等人。(2002)和Sze和Jardetzky(1990)分别是。代谢物水平根据细胞数量进行标准化,每个实验至少重复六次。
脂质合成
细胞在含有1%LPDS的培养基中,在100 nM 4-OHT或乙醇存在下生长24小时。2.5μCi/ml D-[6-14C] 葡萄糖(最终浓度为45μM,Amersham),2.5μCi/ml[2-14C] -丙酮酸(166μM最终浓度)或10μCi/ml[1-14C] 添加-醋酸盐(最终浓度85μM,均为Perkin Elmer),并在37°C下培养细胞4小时。细胞在PBS中清洗三次,并在0.5%Triton X-100中溶解。通过连续添加2 ml甲醇、2 ml氯仿和1 ml dH提取脂质2O.通过1000 rpm离心15分钟实现相分离。回收有机(低)相并干燥。脂质在Ultima Gold LSC鸡尾酒(Perkin Elmer)中溶解,并在Beckman LS 6500闪烁计数器上计数。每次测量重复进行,结果归一化为总蛋白质含量,实验重复至少两次。
细胞裂解和免疫印迹
对于总细胞裂解,用冰镇PBS清洗细胞,并将其溶解在裂解缓冲液中(1%Triton X-100、50 mM Tris pH 7.5、300 mM NaCl、1 mM EGTA、1 mM DTT和1 mM NaVO4和蛋白酶抑制剂[Roche])。核裂解物的制备如所述(Porstmann等人。,2005). 为了检测mSREBP,细胞在裂解前用25μg/ml ALLN处理1小时。在SDS-PAGE上分离等量的细胞裂解物,并将其印在PVDF膜(Immobilon)上。蛋白质通过免疫印迹和ECL检测进行检测。
RNA制备和定量PCR
使用RNeasy试剂盒(QIAGEN)从RPE myrAkt-ER或Kc267细胞中分离出总RNA,并用DNase I(QIAGE)处理。用于从果蝇将10–20龄幼虫在液氮中均质并溶解在缓冲液RLT(QIAGEN)中,然后根据制造商的方案进行RNA纯化。使用2.5微克总RNA与SuperScript II RT和寡核苷酸dT引物(Invitrogen)进行第一链cDNA合成。使用SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)进行实时PCR。所有反应至少进行两次。引物序列见补充实验程序.
转染和RNA干扰
根据制造商的说明,使用Fugene(Roche)转染RPE-myrAkt-ER细胞。转染后20小时,将细胞置于含有1%LPDS的培养基中,并用100 nM 4-OHT诱导,如图所示。
在基因检测实验中,使用DharmaFECT试剂1(Dharmacon)按照反向转染方案转染细胞。转染后20小时,将细胞分裂并分成平行培养物进行不同处理。SiRNA序列见补充实验程序.
对于Kc167细胞的耗竭实验,使用MEGASCRIPT T7转录试剂盒(Ambion)通过体外转录生成dsRNAs。引物序列见补充实验程序使用25μg dsRNA进行沉默,5天后对细胞进行分析。
转基因飞行路线
由5′端的700 bp组成的序列dSREBP公司通过PCR从基因组DNA中扩增该基因,并将其作为反向重复序列插入pWIZ-UAST(Lee和Carthew,2003年). 转基因苍蝇是在yw公司背景。将单个转基因插入染色体2和染色体3组合,以提高沉默效率。dSREBP公司RNAi-S1:一次插入,dSREBPRNAi-S2和dSREBPRNAi-S3:两次插入。
UAS-Dp110WT、UAS-Dp110[KD]和dpp-GAL4/UAS-Dp110[KD]飞线已在前面进行了描述(Weinkove等人。,1999). MS1096-GAL4/UAS-Dp110WT苍蝇是Ernst Hafen(ETH,Zuerich)赠送的礼物。dSREBP公司189苍蝇是Robert B.Rawson(达拉斯德克萨斯大学西南医学中心)送的礼物。无人机dSREBP飞行线是从布卢明顿股票中心获得的。dSREBP RNAi线T1是从维也纳获得的果蝇RNAi中心。所有飞行路线的基因型见补充实验程序.
机翼面积和单元数分析
雄性苍蝇的翅膀在乙醇中脱水,装在Euparal(琼脂科学公司)并拍照。通过测量像素数确定机翼面积。细胞数量是通过计算前后翼室中固定大小区域的翼毛来确定的。除非另有说明,数据表示每个基因型至少20只翅膀产生的值。
统计分析
假设方差相等,使用双尾学生t检验计算P值。
致谢
我们感谢S.Marygold、B.Thompson和N.Tapon的有益讨论。我们也感谢J.Downward的建议和讨论。我们非常感谢E.Hafen、H.Stocker和R.Rawson提供航线。我们还感谢J.Ericsson提供材料。我们感谢S.Basu提供细胞株。我们感谢T.Gilbank产生转基因苍蝇,A.Schmukle帮助我们进行分析,感谢LRI设备园和FACS实验室提供的宝贵帮助。C.R.S.得到EMBO长期奖学金的支持。这项工作由英国癌症研究所资助。
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