免疫学杂志。作者手稿；PMC 2008年11月20日提供。
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神经一氧化氮合酶是消除蓝氏贾第鞭毛虫小鼠感染1
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Ping Zhou公司
*乔治敦大学生物系，华盛顿特区，20057
史蒂文·辛格
*乔治敦大学生物系，华盛顿特区，20057
*乔治敦大学生物系，华盛顿特区，20057
2通讯作者。通讯地址：华盛顿哥伦比亚特区乔治敦大学赖斯科学大楼生物系，406室，20057。电话：（202）687−9884。传真：（202）687−5662。电子邮件：ude.nwotegroeg@3sms. 摘要
诱导型一氧化氮合酶（NOS2）产生的一氧化氮（NO）对控制多种感染至关重要。在体外，NO抑制肠道原生动物寄生虫的复制和分化蓝氏贾第鞭毛虫然而，NO对这种寄生虫的作用尚未在体内进行测试。IL-6缺乏小鼠无法控制贾第虫属与野生型小鼠相比，感染后这些小鼠小肠中NOS2 mRNA的水平降低。然而，NOS2基因靶向小鼠和用NOS2抑制剂N-亚氨基乙基-L-赖氨酸治疗的野生型小鼠和对照小鼠都能消除寄生虫。相反，神经元型NOS（NOS1）缺陷小鼠和野生型小鼠接受非特异性NOS抑制剂NG公司-硝基-L-精氨酸甲酯和NOS1特异性抑制剂7-硝基吲哚唑均延迟了寄生虫清除。最后，贾第鞭毛虫感染增加了野生型小鼠的胃肠动力，但SCID小鼠没有。此外，N对野生型小鼠的治疗G公司-硝基-L-精氨酸甲酯或洛哌丁胺既阻止了运动能力的增强，也阻止了寄生虫的消除。这些数据表明，清除贾第虫属感染。他们还表明，胃肠动力增强有助于消除寄生虫，也可能导致寄生虫引起的腹泻。重要的是，这是NOS1参与消除感染的第一个例子。
关键词：寄生虫-原生动物、一氧化氮、粘膜、神经免疫学
介绍
感染蓝氏贾第鞭毛虫是世界上最常见的肠道疾病之一(1). 感染可导致急性腹泻、痉挛和恶心，尽管无症状感染是最常见的。虽然大多数感染是由有效的免疫反应控制的，但有些人会患上慢性病。目前尚不清楚什么免疫机制负责有效控制感染(2,三). 虽然IgA已被证明在控制感染方面发挥作用(4)很明显，IgA独立机制也能够消除贾第虫属IL-6似乎对这些途径起关键作用(5-7).
除了抗体外，还提出了一些不同的机制，这些机制可能会控制贾第虫属感染。这些包括抗菌肽、NO和肥大细胞产品(8-12). 我们最近发现，不能产生肥大细胞反应的小鼠在消除贾第虫属感染(13). 相反，Eckmann等人(三)据报道，由于控制苦参素的基因缺失，小鼠缺乏功能性α-防御素鼠八哥感染和野生型小鼠。
NO被认为在控制多种微生物感染方面发挥着关键作用，包括利沙曼原虫、弓形虫、鼠伤寒沙门氏菌和结核分枝杆菌(14,15). 由于NO也可以抑制蓝氏革兰菌我们决定检测NO在感染蓝氏革兰菌使用基因靶向小鼠和一氧化氮合酶（NOS）抑制剂三)我们发现，并不是NOS（NOS2）的诱导型亚型，而是负责消除这种感染的神经元亚型（NOS1）。
材料和方法
小鼠、寄生虫和感染-C57BL/6J、B6.129S2-伊尔6tm1Kopf公司/J、 B6.129第2页-2个tm1刘/J、 B6；129S4系列-1号tm1磅/J、 B6129SF2/J和B6.CB17-Prkdc科学情报部/SzJ小鼠均取自杰克森实验室（马里兰州巴尔港）。所有实验均选用5-8周龄的雌性大鼠。GS/H7克隆蓝氏革兰菌如前所述，在体外繁殖并用于感染(5). 简单地说，用10只老鼠灌胃6第0天在PBS中培养滋养体，并在感染后的不同日子处死。十二指肠远端和空肠近端的寄生虫数量通过将组织切碎放入冰镇PBS中，冷却15'，然后用血细胞仪计数来计算。所有动物实验均由乔治敦大学动物护理和使用委员会批准。
酶抑制剂-所有抑制剂均来自Sigma-Alrdrich公司（密苏里州圣路易斯）。非选择性NOS抑制剂NG公司-在饮用水中以0.5 mg/ml的浓度施用硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）(16). 每隔一天换一次水。将NOS1选择性抑制剂7-硝基吲哚唑（7-NI）溶解在二甲基亚砜中并以25 mg/kg的剂量腹腔注射(16). 将NOS2选择性抑制剂N-亚氨基乙基-L-赖氨酸（L-NIL）溶解在PBS中，并以10 mg/kg的剂量腹腔注射(16). 将蠕动抑制剂洛哌丁胺溶解在水中，并以25 mg/kg的剂量进行口服(17). 从感染后第2天开始给药，此后每隔一天给药一次。
RT-PCR-从空肠中分离出总RNA，位于使用RNA-STAT-60（德克萨斯州Friendswood Tel-Test Inc.）量化寄生虫数量的片段的最远端。用Superscript II逆转录酶（Invitrogen，Carlsbad，CA）合成cDNA，并用特异性引物扩增cDNA。GAPDH、NOS2、TNFα、IL-4和IFN-γTaqMan实时PCR引物和探针序列(18)和NOS1(19)前面已经描述过。使用TaqMan试剂和ABI7000（Perkin-Elmer公司，马萨诸塞州波士顿）进行反应。使用Perkin-Elmer所述的ΔΔCt方法对GAPDH进行归一化。
免疫组织学-远端空肠段被快速冷冻，并使用OCT（Miles Sceintific，Naperville，IL）切片。8μ切片在玻片上解冻，用冷丙酮固定5'，并用兔抗NOS1或兔抗NOS2抗血清染色（加州圣克鲁斯圣克鲁斯市圣克鲁斯生物技术公司）。用山羊抗兔FITC（Santa Cruz Biotechnologies）进行染色，用配备CoolSnap FX CCD相机（新泽西州特伦顿Roper Scientific）的蔡司Axiopot荧光显微镜进行可视化，并连接到运行OpenLab 3.0（马萨诸塞州剑桥Improvision Inc.）的Macintosh G3计算机。使用Photoshop（加利福尼亚州圣何塞Adobe Systems）对图像进行进一步处理。
胃肠运动能力-在测量运动能力之前，小鼠禁食一晚。在此期间，水是免费提供的。用0.2 ml 10%木炭和5%阿拉伯树胶（均来自Sigma-Aldrich，Inc.）灌胃小鼠。30分钟后，对小鼠实施安乐死，并小心取出肠道。测量幽门到盲肠的总长度，以及幽门到木炭前缘的距离。运动性表示为木炭穿过的肠道总长度的百分比。
统计数据-使用学生t检验统计数据（Prism 3.0，GraphPad Inc.）比较各组间的寄生虫数量、PCR结果和胃肠动力。非参数Mann-Whitney检验用于比较寄生虫数量数据，包括带有无法检测到的寄生虫的动物。
结果
因为IL-6缺乏小鼠在控制贾第虫属由于NO可以在体外抑制寄生虫的复制和分化，因此我们开始研究诱导型NOS（NOS2）在野生型小鼠感染期间是否上调，而IL-6缺陷小鼠感染时是否上调。结果表明，感染后5天，野生型小鼠的NOS2 mRNA水平升高了约3倍。在这个模型中，寄生虫数量通常在感染后五到七天内保持较高水平。到第十二天，当大多数寄生虫都被消灭时，NOS2 mRNA增加了17倍。未感染IL-6缺陷小鼠的NOS2 mRNA比野生型小鼠少约70%。与它们无法消除感染相一致，NOS2 mRNA在感染后第12天仅增加了3倍，并且仍低于未感染野生型小鼠。
NOS亚型和TNFα的表达贾第虫属感染。在感染后的指定天数，从未感染（第0天）或感染的小鼠收集来自野生型（填充条）和IL-6缺陷（开放条）C57BL/6小鼠的肠道RNA。RNA被逆转录，NOS2（A）、NOS1（B）和TNFα（C）cDNA水平用实时PCR测定。通过GAPDH标准化值测定未感染C5LBL/6小鼠的相关表达水平。n=3/组。数据代表重复实验*与野生型小鼠相比p<0.05。
TNFα是NOS2表达的关键诱导因子(20)而IL-4已被证明抑制NOS2诱导(21). 因此，我们检测了这些小鼠小肠中的TNFα和IL-4 mRNA水平。与Bienz等人之前在肠系膜淋巴结中看到的结果类似(7)与12天感染的野生型小鼠或未感染的IL-6缺陷小鼠相比，感染12天的IL-6缺乏小鼠的IL-4 mRNA水平增加（数据未显示）。未观察到IFN-γmRNA水平的显著差异（数据未显示）。与NOS2类似，TNF-αmRNA水平在贾第虫属感染IL-6缺陷小鼠与野生型小鼠的比较(). 然而，这些差异在第五天仅为3倍，在第十二天为2倍。TNFα和IL-4的差异可能是IL-6缺陷小鼠NOS2表达减少的原因贾第虫属感染。
为了测试NOS2产生NO对控制感染是否必要，我们感染了NOS2缺陷小鼠(22)带有蓝氏革兰菌我们还用异型非特异性NOS抑制剂L-NAME治疗野生型小鼠(16).研究表明，感染后五天，L-NAME处理的小鼠小肠中的寄生虫数量是未处理小鼠的3-4倍，几乎与IL-6缺陷小鼠的寄生虫数量相同。相比之下，NOS2缺陷小鼠感染后五天的寄生虫数量是野生型对照小鼠的8-10倍。感染后10天，未经治疗的野生型小鼠和NOS2缺陷小鼠不再有可检测的寄生虫，而所有L-NAME治疗的小鼠仍有可检测的寄生虫负荷。NOS2缺陷小鼠和L-NAME治疗小鼠之间的这种差异可能代表基因缺陷小鼠的代偿机制或L-NAME对NOS其他亚型的抑制，例如神经元亚型NOS1或内皮亚型NOS3。为了确定NOS缺乏或L-NAME治疗的小鼠是否显著改变了免疫反应，我们分析了受感染小鼠中抗寄生虫IgA和细胞因子反应的产生。在IgA或细胞因子反应中没有发现差异（数据未显示），这表明NOS2的操作在该系统中没有广泛的影响。然而，我们可以得出结论，NOS2并非控制感染的绝对必要条件蓝氏革兰菌在小鼠中。事实上，IFN-γ和IL-4缺陷小鼠控制感染的能力(5)提示可能有多余的机制能够控制这种感染。
抑制NOS活性，但不删除NOS2基因，会延迟寄生虫清除。小鼠感染了贾第虫属并在感染后第5天（填充符号）或第11天（开放符号）测定小肠中的寄生虫数量。野生型C57BL/6小鼠未服用任何药物（正方形）或L-NAME（三角形）。NOS2缺陷小鼠（倒三角形）和IL-6缺陷小鼠（菱形）未接受药物治疗。每个符号代表一个单独的鼠标。数据代表三个独立实验。*p<0.05。
为了确定L-NAME对NOS1或NOS3的抑制是否影响贾第虫属，我们感染NOS2缺陷小鼠并用L-NAME治疗。如果L-NAME的观察效果是由于对NOS2的抑制，我们推断NOS2突变小鼠的治疗对这些小鼠应该没有效果。然而，研究表明，L-NAME对NOS2缺陷小鼠的作用与对野生型小鼠的作用相似。因此，抑制NOS1或NOS3的L-NAME必须参与消除贾第虫属因此，野生型小鼠也使用7-硝基吲哚唑（7-NI）进行治疗，7-NI是一种对NOS1具有选择性活性的NOS抑制剂(16). 7-NI治疗导致与L-NAME治疗类似的扩大感染()支持NOS1对消除贾第虫属.
NOS1而非NOS2活性是消除贾第虫属A.四只老鼠被感染贾第虫属感染后第10天测定寄生虫数量。野生型C57BL/6小鼠用非特异性NOS抑制剂L-NAME或NOS1特异性抑制剂7-硝基吲哚唑（7-NI）治疗，NOS2缺乏小鼠只用L-NAME治疗。L-NAME和NOS2−/−数据是三个独立实验的代表。7-NI数据是两个独立实验的代表。B.野生型（填充方块）和NOS1缺陷型（开放方块）B6X129 F2小鼠感染贾第鞭毛虫感染后5天和10天测定肠道滋养体数量。每个点代表一个单独的鼠标，条表示方法。数据代表两个独立实验。*p<0.05。
为了进一步证实NOS1而非NOS2的作用，我们用L-NIL治疗野生型小鼠（数据未显示），一种对NOS2比对NOS1有偏好性的抑制剂(16). 正如NOS2缺乏小鼠的结果所预期的那样，经L-NIL治疗的C57BL/6小鼠在感染后10天内没有检测到寄生虫，与未经治疗的小鼠相似（n=4/组）。我们还感染了NOS1缺陷小鼠，以确认7-NI的结果。虽然野生型B6X129 F2小鼠和NOS1缺乏小鼠在接种寄生虫五天后都很容易检测到感染，但此时NOS1缺失小鼠中的寄生虫/小鼠数量显著增加(). 此外，到感染后12天，野生型小鼠已经消除了所有可检测到的寄生虫，而NOS1缺陷小鼠仍然受到严重感染。这些结果证实NOS1在消除贾第鞭毛虫感染。
NOS1阳性神经元已在肠道中被描述，并已知在调节肠道运动中发挥作用(23,24).表明NOS2在未感染和感染小鼠的小肠中主要表达在绒毛上皮细胞层下面(). 与实时PCR结果一致()，感染小鼠中出现更多NOS2()比未感染的小鼠(). 重要的是，在NOS2缺陷小鼠中未发现NOS2染色()，确认用于这些研究的试剂的特异性。
NOS2在大鼠小肠中的定位贾第虫属感染小鼠。未感染（A）和10天的冰冻切片贾第虫属-用NOS2抗体对感染（C，D）的野生型小鼠进行染色，如方法所述。NOS2未染色贾第虫属-感染NOS2缺陷小鼠（B）证实了初级和次级抗体的特异性。D是以与C中相同的原始放大倍数拍摄的图像的大视图。
NOS1在肠肌层内的长突起和粘膜下的细胞斑块中表达(). 因此，NOS1产生的NO不太可能直接影响贾第虫属在小肠内腔内。nNOS表达神经元和Cajal的间质细胞（ICC）先前已在肠神经系统的肌间和粘膜下丛中进行了描述(25-27). 绒毛内也可见一些nNOS免疫反应，可能反映了进入该组织的神经元突起。未感染和感染小鼠的NOS1染色水平变化不大。这与中提供的实时PCR数据一致这表明未感染和感染、野生型和IL-6缺陷的C57BL/6小鼠的NOS1 mRNA水平基本相同。
NOS1在大鼠小肠中的定位贾第虫属感染小鼠。未感染（A）或感染10天的野生型小鼠冰冻切片贾第虫属（B） 用NOS1抗体染色，如方法中所述。NOS1未染色贾第鞭毛虫-感染NOS1缺陷小鼠（C）或用正常兔IgG（D）染色的野生型小鼠证实了初级和次级抗体的特异性。
由于肠神经系统中NOS1表达神经元参与调节胃肠运动贾第虫属受感染的沙鼠增加了肠道转运率，我们询问运动能力的改变是否与消除贾第虫属。我们通过喂食小鼠木炭餐和测定木炭在固定时间内行驶的距离来测量胃肠动力(17). 该方法同时测量胃排空和肠道转运。我们用L-NAME或洛哌丁胺治疗感染小鼠，作为抑制运动的阳性对照。洛佩拉明是一种μ-阿片受体激动剂常用于抑制胃肠动力和治疗腹泻(28,29). 它还可以抑制钙++神经元的通道功能(28). 洛哌丁胺延长治疗贾第虫属与L-NAME治疗相似的野生型小鼠感染(). 正如预期的肠道转运结果贾第虫属感染沙鼠(30)感染可显著提高感染C57BL/6小鼠的运动速度(). 重要的是，用L-NAME阻断NOS活性可部分逆转转运过程中NOS活性的增加()与洛哌胺治疗一样(). 最后，SCID小鼠感染贾第鞭毛虫()尽管这些小鼠体内存在大量寄生虫(5). 因此，由于洛哌丁胺和L-NAME都能阻止运动增加并延长贾第虫属感染，我们得出结论，肠道运动的增加是由贾第虫属感染对消除肠道寄生虫很重要。此外，由于在SCID小鼠中未观察到任何变化，因此运动能力的增加取决于适应性免疫反应。
胃肠动力抑制延迟消除贾第虫属感染。A.野生型C57BL/6小鼠感染贾第虫属并且从感染后第2天开始不治疗（正方形）或每天治疗。使用L-NAME（三角形）或loperamide（倒三角形）。在感染后第10天测定寄生虫数量。每个符号代表一个单独的鼠标。B.在未感染C57BL/6小鼠（钻石）和未经治疗的感染贾第虫属（正方形）和感染小鼠在感染后2-7天接受L-NAME（倒三角形）治疗。C.在未感染C57BL/6小鼠（钻石）和未经治疗的感染贾第虫属（正方形）和感染小鼠在感染后第2、4和6天接受洛哌丁胺（倒三角形）治疗。D.在感染（菱形）或（方形）病毒7天后，分别测量C57BL/6（填充符号）和C57BL/6 SCID（开放符号）小鼠的胃肠动力贾第虫属对于B、C和D，在感染后第7天测量运动能力。数据表示为20（B和C）或30（D）分钟内小肠移动的百分比。每个点代表一个单独的鼠标。数据代表两个独立实验。*p<0.05。
讨论
控制肠道感染需要有效的免疫反应，必须与破坏性病理学相平衡。与大多数人类一样，感染了蓝氏贾第鞭毛虫，寄生虫被免疫系统有效清除，不会引起严重炎症或腹泻。多种机制已被证明能够抑制或杀死贾第虫属体外试验。然而，迄今为止还没有发现对控制体内感染至关重要。例如，虽然体外抗疟原虫的IgA明显有毒，但B细胞和IgA缺陷小鼠在感染后一到两周内可消除90%或更多的疟原虫(4,5). 这与SCID小鼠和c-kit形成对比w/wv型保持感染至少几个月，IL-6缺乏小鼠在感染后4-8周内消除感染(5,6,13). 这可能反映了这样一个事实：贾第虫属通过多种冗余机制发生，只有在缺乏多种或非冗余机制的小鼠突变体中才能观察到明确的表型。
我们已经证明IL-6缺陷小鼠感染了蓝氏革兰菌与野生型小鼠相比，小肠中的TNFα和NOS2 mRNA水平降低。虽然肠上皮细胞产生NOS2可以阻止体外寄生虫复制(9)用L-NIL对野生型小鼠进行治疗，L-NIL能特异性抑制NOS的这种亚型，而对缺乏NOS2基因的小鼠进行感染，这清楚地表明，这种途径对消除体内感染是不必要的。然而，这些数据并不排除NOS2在寄生虫消除中的非冗余作用。相反，同种型非特异性抑制剂L-NAME和NOS1特异性抑制剂7-NI都能抑制寄生虫的消除，这表明神经元酶NOS1对于控制贾第虫属感染。NOS1缺陷小鼠的感染增强证实了NOS1被指定为消除这种感染的必需NOS亚型。
在之前的分析中贾第虫属Bienz等人在IL-6缺乏小鼠的感染中发现肠系膜淋巴结中IL-4 mRNA升高，但在该部位未检测到NOS2表达(7). 他们还报告说，无论是野生型还是IL-6缺陷型小鼠，在感染后的肠系膜淋巴结中均未检测到NOS2 mRNA。然而，因为贾第虫属如果只在小肠内腔进行复制，人们会认为肠上皮细胞产生的NO与埃克曼建议的消除感染更相关(9). NOS2的免疫定位显示NOS2存在于肠上皮下的细胞中。这与肠系膜淋巴结中NOS2的表达缺失以及抑制这种酶对感染结果的影响缺乏一致。
正常的肠道运动是肠道平滑肌协调收缩和放松的结果。这种协调是通过肠道神经系统实现的。平滑肌收缩是平滑肌胆碱能刺激的结果，而松弛部分是通过一氧化氮的抑制信号介导的。我们认为，感染期间的免疫反应会增加运动能力，L-NAME对NOS活性的抑制会通过干扰肌肉松弛而导致胃肠动力降低。我们对胃肠动力的测量反映了胃排空和肠道转运，因此胃排空和/或肠道动力可能对消除这种感染很重要。事实上，NOS1缺陷小鼠的胃排空减少(31). 相反，洛哌丁胺的主要作用是减少肠道转运，而不是胃排空(32,33). 然而，虽然洛哌丁胺主要是μ-阿片受体，也可以阻断钙++通道和抑制钙调素介导的神经元效应(28). 由于NOS1活性受钙调蛋白调节(34)，我们认为洛哌丁胺在延长贾第虫属感染可能是通过以下途径降低肠道运动来介导的μ-阿片受体，可能还通过抑制NOS1活性。还需要进一步的研究来确定胃排空的改变是否在消除贾第虫属感染。
肠道感染对运动的影响以前已经在几个模型中进行过研究。沙鼠感染蓝氏革兰菌结果显示，肠道转运率增加，但转运和一氧化氮在消除感染中的作用尚未研究(30). 线虫感染是研究感染引起运动改变的最佳模型之一旋毛虫感染会导致运动过度和肥大细胞增多，类似于贾第虫属感染(35). 有趣的是，用L-NAME治疗可以防止旋毛虫感染了老鼠，但导致蠕虫排出量增加(36)，与L-NAME对体内寄生虫数量的影响相反贾第虫属感染小鼠。这表明，虽然运动过度不需要消除旋毛虫属，需要消除贾第虫属.
人类感染蓝氏革兰菌经常导致严重的腹部痉挛和吸收不良性腹泻。我们现在已经证明了贾第虫属小鼠感染会导致肠道转运率增加，而肠道转运是消除感染所必需的。人类肠道转运过程中的类似变化可能会导致与这种感染相关的症状。进一步研究贾第虫属由于尚未确定致病机制，因此需要感染。此外，这些数据表明，由酶NOS1介导的信号在消除这种感染中起着关键作用，但NOS2显然不需要产生NO。虽然NOS2参与了许多感染的消除，但这是我们了解到的第一个需要NOS1活性的例子。
致谢
作者感谢Heidi Elmendorf博士建议进行洛哌丁胺实验，感谢Terez Shea-Donohue博士的有益讨论。作者没有相互冲突的经济利益。
脚注
1这项工作得到了国家卫生研究院向S.M.S.提供的AI-49565拨款的支持。这些研究是使用由NCI-CCSG支持的动物核心设施以及由国家研究资源中心的研究设施改进拨款C06 RR14567支持建造的组织病理学和组织共享资源设施进行的，美国国立卫生研究院。
三缩写：NOS，一氧化氮合酶。7-硝基吲唑。L名称，NG公司-硝基-L-精氨酸甲酯。L-NIL，N-亚氨基乙基-L-赖氨酸。
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