AAV血清型1载体基因组在营养不良肌肉中的相对持久性
,1,2 ,1,2 ,
1,三和1,2,三 克里斯蒂娜·帕克
1美国佛罗里达州盖恩斯维尔佛罗里达大学鲍威尔基因治疗中心
2美国佛罗里达州盖恩斯维尔佛罗里达大学儿科
托马斯·康隆
1美国佛罗里达州盖恩斯维尔佛罗里达大学鲍威尔基因治疗中心
2美国佛罗里达州盖恩斯维尔佛罗里达大学儿科
凯瑟琳·马赫
1美国佛罗里达州盖恩斯维尔佛罗里达大学鲍威尔基因治疗中心
三美国佛罗里达州盖恩斯维尔佛罗里达大学儿科细胞和分子治疗部
巴里·拜恩
1美国佛罗里达州盖恩斯维尔佛罗里达大学鲍威尔基因治疗中心
2美国佛罗里达州盖恩斯维尔佛罗里达大学儿科
三美国佛罗里达州盖恩斯维尔佛罗里达大学儿科细胞和分子治疗部
1美国佛罗里达州盖恩斯维尔佛罗里达大学鲍威尔基因治疗中心
2美国佛罗里达州盖恩斯维尔佛罗里达大学儿科
三美国佛罗里达州盖恩斯维尔佛罗里达大学儿科细胞和分子治疗部
通讯作者。 收到日期：2008年6月10日；2008年10月15日接受。
版权©2008 Pacak等人；被许可方BioMed Central Ltd。 摘要
本研究的目的是评估假型重组腺相关病毒1型（rAAV2/1）载体基因组在营养不良骨骼肌中的行为。通过在发病前向2D型肢体带肌营养不良（LGMD-2D）小鼠模型注射后肢，对治疗载体和报告载体进行比较。我们假设，治疗载体将通过防止肌纤维周转建立长期持久性。相反，由于疾病相关的肌肉退化，报告载体基因组拷贝数会随着时间的推移而减少。
一日龄α-肌聚糖敲除小鼠(sgca公司-/-)注射1×1011rAAV2/1-tMCK载体基因组-sgca公司在一个后肢和相同剂量的rAAV2/1-tMCK-LacZ公司在对侧后肢。新生小鼠对外源转基因具有耐受性，允许标记基因和治疗基因在空白背景下长期表达。在载体给药后的2个时间点，采集后肢肌肉并分析LacZ或肌多糖的表达。我们的数据表明，与注射报告基因的后肢相比，注射治疗性转基因的后肢骨骼肌中的载体基因组持续时间更长。我们在骨骼肌中观察到载体基因组的丢失，而这些骨骼肌没有受到治疗性基因转移的保护。相比之下，表达肌多糖的治疗载体可减少或消除肌纤维丢失。缓解营养不良肌肉固有的膜不稳定性能够延长单个肌纤维的寿命。
调查结果
肢带肌营养不良2D型（LGMD-2D）是一种由α-肌多糖基因突变引起的常染色体隐性疾病(sgca公司)是最常见的肌糖蛋白病；一类营养不良症，其中6种跨膜肌多糖蛋白中的一种缺乏[1]. LGMD-2D对两性的影响相同，发病通常发生在生命的前十年[2]. 疾病表型的严重程度与患者体内sgca蛋白的含量相关[三]. 目前，该病尚无明确的治疗方法，护理的目的是尽量减少疾病进展。各种研究人员正在寻求一种临床上适用的LGMD-2D基因传递技术，以阻止肌多糖缺乏症和类似疾病的衰弱后果[4,5].
腺相关病毒（AAV）是将基因转移到骨骼肌的有用载体，在骨骼肌中，它被证明是一种持续存在的上位体[6,7]. 在这里，我们试图检测AAV基因组在营养不良肌肉中的持续性。为此，我们注射了4个1天大的α-淀粉聚糖基因敲除的骨骼肌(sgca公司-/-)1×10的小鼠后肢11我们先前证明具有治疗作用的载体rAAV2/1-tMCK的载体基因组-sgca公司[4]. 该载体含有人类α-肌聚糖(sgca公司)基因和先前描述的截断小鼠肌酸激酶（tMCK）启动子[4]. 对侧后肢骨骼肌注射1×1011报告基因载体rAAV2/1-tMCK的载体基因组-LacZ公司包含驱动β-半乳糖苷酶的相同启动子(LacZ公司)基因。通过诱导低温麻醉新生小鼠，并使用29.5-G结核菌素注射器对磷酸盐缓冲盐水配制的每种载体进行单次肌肉内（IM）注射（每次注射总体积为35μL）。针头斜面朝上插入踝关节前室肌腱附近，并沿着胫骨指向胫骨前部进入上后肢区域。在拔针的同时注射病毒溶液，以最大限度地扩大载体的分布面积。
给药后4个月或12个月，采集肌肉，量化并比较载体基因组。如前所述，从冷冻组织样本中分离出基因组DNA[8]. 使用以下针对小鼠肌酸激酶（tMCK）启动子的PCR引物/探针组来确定载体基因组的持久性。正向底漆：5'-GGCACTCTATTGGTCTACTGACCA TC-3‘反向底漆：5'-GAGTGCTCAGCACTGTGGTGGTA-3'探头：6FAM-CT CTCCACAGTGCCACGTCA-TAMRA。
我们的结果表明，在病毒给药后4个月和12个月，注射rAAV2/1-tMCK的后肢肌肉中存在的载体基因组数量在统计学上显著增加-sgca公司与注射rAAV2/1-tMCK的患者相比-LacZ公司（图). 给药后2个月，各后肢间转导肌纤维数量的差异很小（如免疫组织化学和冷冻骨骼肌冰冻切片的LacZ染色所示，以确定α-肌糖蛋白[绿色]和β-半乳糖苷酶[蓝色]）（图)但随着时间的推移而增加（图). 载体基因组评估指长伸肌（EDL）和胫骨前（TA）被合并，因为它们都由快速抽搐肌纤维组成（图). 在病毒给药后4个月，两种载体在营养不良的肌肉中持续生存的能力明显不同。这种差异仍然存在，但在注射后12个月时没有那么明显，因为rAAV2/1-tMCK中的载体基因组总数-sgca公司注射EDL，TA肌肉随时间减少。
载体基因组持久性（A-C）显示下半身肌肉中载体基因组数量的对数图sgca公司-/-rAAV2/1-tMCK给药后4个月或12个月的小鼠后肢-sgca公司（黑色条）或rAAV2/1-tMCK-LacZ公司（灰色条）。在sgca公司注射肌肉（*表示统计显著性[p值≤0.05]，**表示p值=0.29）。（A） 右侧所有肌肉的组合数据(sgca公司注入）和左侧(LacZ公司注射）注射后4或12个月后肢。分析的肌肉包括：指长伸肌（ED），腓肠肌（镓），比目鱼（所以），胫骨前（TA），以及股四头肌（Qu）。（B） 注射后4个月和12个月的综合（主要）快速抽搐肌肉数据（ED和TA）。（C） 注射后4个月和12个月的混合/慢切换肌肉数据（Ga、So和Qu）。（D） 描述注射后4个月（黑色）或12个月（灰色）时单个肌肉中载体基因组拷贝数差异的条形图。在给药后4个月，两种构建体之间的表达水平差异大于给药后12个月。（E） 免疫荧光图像股四头肌肌肉冷冻切片（rAAV2/1-tMCK后2个月-sgca公司给药）显示α-淀粉聚糖位于细胞膜（绿色），细胞核维持在细胞外周（DAPI染色-蓝色）。（F） β-半乳糖苷酶染色股四头肌肌肉冷冻切片（rAAV2/1-tMCK后2个月-LacZ公司给药）显示转导肌纤维染色（蓝色）。（G-H）图像指长伸肌肌肉（分娩后4个月sgca公司或LacZ公司[分别]）。（I-J）图像比目鱼肌肉（分娩后4个月sgca公司或LacZ公司[分别]）。
相反，对主要由慢开关或混合数量的每种纤维类型组成的肌肉进行载体基因组评估(腓肠肌[乔治亚州]，比目鱼[So]，和股四头肌[Qu]）显示了两个向量在两个时间点的相对持久性之间的显著差异（图). 具体来说，在Ga肌肉中检测到的载体基因组数量仅略有减少，而在相同后肢的So肌肉中所检测到的基因组数量并没有随着时间的推移而减少。
与对侧后肢同一肌肉中的基因组相比，每一肌肉中可检测基因组数量的差异或扩散揭示了一个有趣的模式。检测到的每个基因组的平均数量LacZ公司从每个时间点检测到的基因组平均数中减去肌肉sgca公司两个时间点的肌肉，以便比较后肢各肌肉随时间的差异（或平均基因组数的范围）。在本研究中评估的肌肉中，So由慢速抽搐肌纤维组成，是唯一一块在12个月时间点的载体基因组数量之间比4个月时扩散更大的肌肉。然而，EDL主要由快速抽搐肌纤维组成。与本研究中的其他肌肉相比，它显示出每条腿肌肉中持久性载体基因组之间传播的减少最大。我们的结果表明，与我们分析的其他单个肌肉相比，无论使用哪种载体，EDL的整体肌肉周转量都更大。这可能表明快速抽搐（II型）纤维（EDL主要由[≥97%]组成）[9])与由混合纤维或主要是缓慢抽搐纤维（I型）组成的肌肉相比，具有更快的周转趋势。
据我们所知，尚未对肌营养不良小鼠模型和患有该疾病的人类中营养不良病变的随机发展做出解释。我们的数据进一步证明，该疾病模型中的单个肌肉可能并非都具有相同的肌纤维转换率，从而导致组织纤维化/坏死。
本研究中使用的IM传递方法并没有以平等的方式将载体充分传递到每个肌肉纤维。因此，可能有一些受保护的肌肉区域确实含有治疗性转基因，以及随着时间的推移而恶化的未受保护肌肉区域，最终可能会压倒经治疗的肌纤维，这可能是EDL更高水平转换的另一种解释。此外sgca公司蛋白质是膜结合的，不分泌，因此单个细胞的转导不足以为周围区域提供治疗。由于我们的输送方法简单，并且允许单次注射将多块肌肉转换到高度，因此这是一种有用的概念验证技术。使用替代的静脉给药方法可以提供更均匀的生物分布，可能更适用于临床[5,10].
我们的数据表明，治疗载体能够保持转导肌肉纤维的完整性，从而提高肌纤维存活率。我们的结果来源于用报告基因载体转导的肌肉，可作为确定该疾病模型中各种肌肉之间肌纤维周转量的模型。未来的研究表明，保护肌肉免受退行性疾病的影响，可以结合Salic等人开发的细胞增殖试验，以进一步揭示[11]. 当身体的天然肌肉再生机制试图修复受损组织时，作为外显体存在于正常肌肉中的非治疗性（报告基因）AAV基因组与患病肌纤维数量成比例丢失。rAAV2/1-tMCK的能力-sgca公司防止肌纤维膜损伤的载体有可能成为未来重要的治疗策略。需要进一步研究该载体促进现有肌营养不良患者肌肉修复的潜力。
缩写
AAV：腺相关病毒；预计起飞时间：指长伸肌; 乔治亚州：腹痛; IM：肌内；LacZ：β-半乳糖苷酶；LGMD-2D：2D型肢体带状肌营养不良；PCR：聚合酶链反应；曲：股四头肌; sgca：α-淀粉聚糖；因此：比目鱼; 助教：胫骨前肌; tMCK：截断的小鼠肌酸激酶。
竞争性利益
约翰·霍普金斯大学、佛罗里达大学和B.J.B.有权获得与本文研究结果相关的发明专利使用费。
作者的贡献
CAP参与了研究的设计，进行了注射，采集了组织，进行了免疫组织化学分析，并起草了手稿。CSM参与了研究的设计并帮助起草了手稿。TJC参与了该研究的设计，并进行了载体基因组分析，并帮助起草了手稿。BJB参与了该研究的设计。所有作者阅读并批准了最终手稿。
致谢
我们要感谢爱荷华大学的Kevin P.Campbell博士提供sgca公司-/-这些研究中使用的小鼠模型。我们还要感谢佛罗里达大学鲍威尔基因治疗中心毒理学工作人员对载体基因组进行量化，以及鲍威尔基因疗法中心病毒载体核心对这些实验中使用的AAV进行制造。这项工作得到了美国心脏协会10月前奖学金授予佛罗里达和波多黎各附属机构（CAP）、NIH国家心脏、肺和血液研究所拨款PO1 HL59412的部分支持；国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所授予PO1 DK58327；AT-NHLBI-U01 HL69748；和AHA国家中心（致C.S.M.）。
工具书类
- Moore SA、Shilling CJ、Westra S、Wall C、Wicklund MP、Stolle C、Brown CA、Michele DE、Piccolo F、Winder TL等。美国肢体带状肌营养不良。神经病理学实验神经学杂志。2006;65:995–1003. doi:10.1097/01.jnen.000235854.77716.6c。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
- 康培凯。第216章：肌肉营养不良。在：斯克里弗·CRBA，Valle D，Sly WS，编辑。遗传疾病的在线代谢和分子基础。8.麦格劳-希尔；2007.[谷歌学者]
- Eymard B、Romero NB、Leturcq F、Piccolo F、Carrie A、Jeanpierre M、Collin H、Deburgrave N、Azibi K、Chaouch M等。原发性黏液病（α-淀粉样糖蛋白病）：20例常染色体隐性肌营养不良患者的临床、病理和遗传相关性。神经病学。1997;48:1227–1234.[公共医学][谷歌学者]
- Pacak CA、Walter GA、Gaidosh G、Bryant N、Lewis MA、Germain S、Mah CS、Campbell KP、Byrne BJ。LGMD-2D小鼠模型基因转移后的长期骨骼肌保护。分子热学。2007;15:1775–1781. doi:10.1038/sj.mt.6300246。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
- Fougerousse F、Bartoli M、Poupiot J、Arandel L、Durand M、Guerchet N、Gicguel E、Danos O、Richard I。通过动脉注射肌肉特异性血清型1 rAAV载体对α-淀粉聚糖缺乏症的表型纠正。分子热学。2007;15:53–61. doi:10.1038/sj.mt.6300022。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
- Kessler PD、Podsakoff GM、Chen X、McQuiston SA、Colosi PC、Matelis LA、Kurtzman GJ、Byrne BJ。基因传递到骨骼肌导致持续表达和系统传递治疗蛋白。美国国家科学院程序。1996;93:14082–14087. doi:10.1073/pnas.93.24.14082。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
- Schnepp BC、Clark KR、Klemanski DL、Pacak CA、Johnson PR。肌肉中重组腺相关病毒载体基因组的遗传命运。《维罗尔杂志》。2003;77:3495–3504. doi:10.1128/JVI.77.6.3495-3504.2003。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
- Pacak CA、Mah CS、Thattaliyath BD、Conlon TJ、Lewis MA、Cloutier DE、Zolotukhin I、Tarantal AF、Byrne BJ。重组腺相关病毒血清型9导致体内优先心脏转导。圆形Res。2006;99：e3-9。doi:10.1161/01.RES.0000237661.18885.f6。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
- Warren GL、Ingalls CP、Armstrong RB。小鼠EDL肌肉离心收缩后力损失和Ca（2+）稳态的温度依赖性。美国生理学杂志Regul Integr Comp Physiol。2002;282：R1122–1132。[公共医学][谷歌学者]
- Arruda VR、Stedman HH、Nichols TC、Haskins ME、Nicholson M、Herzog RW、Couto LB、High KA。在大型动物模型中，将AAV-2-F.IX局部血管内输送至骨骼肌可实现血友病B的长期矫正。鲜血。2005;105:3458–3464. doi:10.1182/bloud-2004-07-2908。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
- Salic A，Mitchison TJ。一种快速灵敏检测体内DNA合成的化学方法。美国国家科学院程序。2008;105:2415–2420. doi:10.1073/pnas.0712168105。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
