核酸研究。2008年9月；36(15): 4902–4912.
包含FMRP结合位点的G-quartetFMR1（飞行管理1级）mRNA是一种有效的外显子剪接增强子
IGBMC（法国生物研究所），Inserm U596，CNRS UMR7104，UniversityéLouis Pasteur，Collège de France，Illkirch，F-67400 France
现住址：意大利米兰Dibit-San Raffaele科学研究所肾脏疾病分子遗传学室Dulbecco Telethon研究所神经生物学和遗传学系Céline Schaeffer作者希望大家知道，在他们看来，前两位作者应被视为联合第一作者
收稿日期：2008年5月9日；2008年6月30日修订；2008年7月7日验收。
- 补充资料
【补充资料】
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摘要
脆性X智力发育迟缓蛋白（FMRP）是一种RNA结合蛋白，被提议在转录后调节对神经元发育和突触可塑性重要的基因的表达。我们之前证明了FMRP与自身的结合FMR1（飞行管理1级）mRNA通过鸟嘌呤四分体（G-quartet）RNA基序。然而，此绑定对FMR1（飞行管理1级）未建立表达式。在这项工作中，我们描述了FMRP结合位点（FBS）在FMR1（飞行管理1级）通过定点诱变方法获得信使核糖核酸，我们研究了其对FMR1（飞行管理1级）表达式。我们展示了FBS在FMR1（飞行管理1级）mRNA采用两种可供选择的G-四重结构，FMRP可以与之平等结合。虽然FMRP与mRNA的结合通常被认为可以诱导翻译调控，但我们发现，FMRP的突变与mRNAs的翻译调控有关FMR1（飞行管理1级）mRNA抑制与FMRP的结合并不影响其在细胞模型中的翻译。相反，我们发现FBS是小基因系统中一个有效的外显子剪接增强子。此外，FMR1（飞行管理1级）选择性剪接受细胞内FMRP水平的影响。这些数据表明，G四重奏主题存在于FMR1（飞行管理1级）mRNA可以在负性自身调节环中作为其选择性剪接的控制元件。
简介
遗传性精神发育迟滞最常见的病因是脆性X综合征，它是由缺乏RNA-结合蛋白脆性X精神发育迟缓（FMRP）引起的。在神经元中，FMRP与脑mRNA的有限子集以及大核糖核颗粒中的其他蛋白质有关，其组成尚不完全清楚(1–3). 在这些mRNP中，FMRP被提议作为特定靶mRNA翻译或转运的调节器。然而，FMRP对特定靶mRNAs作用的分子机制尚不清楚。作为FMRP功能的线索，对其mRNA靶点的研究显得至关重要。鸟嘌呤四分体（G-quartet）结构基序被鉴定为FMRP与mRNA相互作用的高亲和力决定因子(4,5). 自富铀序列以来，RNA G-quartet并不是FMRP的唯一目标(6)，亲吻的主题(7)和BC-1 RNA(9)也发现它们能介导FMRP与mRNA的相互作用。然而，携带亲吻环基序的FMRP靶mRNA尚未被鉴定，通过BC1介导的相互作用仍在争论中(8). 因此，目前，G-quartet仍然是在与FMRP相关的哺乳动物基因的mRNA中发现的主要共识基序(10,11)，和/或被证明受到FMRP缺失的影响。携带潜在或经验证的G-quartets的基因包括微管相关蛋白1B地图1b(12)，突触后密度蛋白PSD95型(13,14)，蛋白磷酸酶2A的催化亚单位(PP2Ac（PP2Ac）) (15)或淀粉样前体蛋白应用程序(16)对神经元发育和突触可塑性都很重要。然而，FMRP/G-四聚体相互作用的作用尚不清楚，因为到目前为止还没有直接证据表明其对转录后控制的影响，最近的工作表明FMRP与多核糖体的关联(17)不会被G-quartets调停(7).
为了解决这些问题，我们在本研究中分析了FMRP与其自身mRNA之间的相互作用，FMR1（飞行管理1级）是FMRP中最具特征的目标之一，其中G-四重奏基序已被确定(2). 由于FMRP与其自身mRNA之间的相互作用暗示了一个自动调节回路，我们测试了FMRP是否可以控制其自身的表达。要确定FMR1（飞行管理1级）mRNA/FMRP相互作用，我们在FMRP结合位点（FBS）的G四分位基序中进行突变FMR1（飞行管理1级）废除了FMRP约束在体外在不改变蛋白质氨基酸序列的情况下，我们检测了FMRP/FBS相互作用在哪一水平上发挥作用。我们的数据为FBS及其与FMRP的结合在选择性剪接调控中的作用提供了几条证据FMR1（飞行管理1级）基因。
材料和方法
质粒和结构
质粒pTL1(18)用于短暂或稳定地表达FMR1（飞行管理1级）文本中描述的各种细胞系中最长的亚型1。Flag和cMyc标签被引入框架中，位于FMR1（飞行管理1级）给出pTL1-Flag-FMR1（飞行管理1级）和pTL1 cMyc-FMR1（飞行管理1级）在pTL1-Flag中引入了破坏FBS内G-quartet的突变-FMR1（飞行管理1级）使用Quick Change Site Directed Mutagenesis kit（美国德克萨斯州锡达拉克里克斯特拉赫内）。用于诱变的引物见补充材料在线提供。SXN13小基因结构(19)通过使用在外显子2内插入FBS的dsDNA片段产生SalI/BamHI公司地点。质粒pTAP–FMRP通过插入FMR1（飞行管理1级）框架中的Iso1位于其N端，带有pBS 1539的TAP标签(20)到穆卢伊pTRE2载体的位置（Clontech，Mountain View，CA，USA）。
细胞培养和转染
HeLa细胞和FMR1（飞行管理1级）−/−小鼠胚胎永生化成纤维细胞(21)在补充有10%胎牛血清、100µg/ml青霉素-链霉素的DMEM中培养。PC12 Tet-On细胞（Clontech）在添加10%马血清、5%胎牛血清、125µg/ml潮霉素、100µg/ml青霉素-链霉素的RPMI中生长，在5%CO中237°C培养箱。根据制造商建议，使用Lipofectamine（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）用pTAP–FMRP稳定转染PC12 Tet-On细胞。pHyg抗性载体作为选择标记用于共转染。将转染的细胞培养在含有125µg/ml潮霉素和1µg/ml多西环素的培养基中，并使用1C3抗FMRP的western blot检测单个双稳定选择的细胞是否存在TAP–FMRP融合蛋白。PC12 Tet-On克隆“1”因其对TAP-FMRP表达的严格调节而被选中。为了在稳定转染的细胞系中诱导外源性人FMRP Iso1表达，向细胞中添加最终浓度为250 ng/ml的多西环素48小时。
为了测定SXN小基因剪接效率，HeLa细胞或FMR1（飞行管理1级）−/−使用JetPEI（Polyplus）将1.5µg SXN载体转染到小鼠胚胎永生化成纤维细胞（40%融合）的60mm直径板中。24小时后，使用Genelute哺乳动物总RNA试剂盒（德国斯坦海姆Sigma）提取总RNA，并使用5µg的SXN引物进行延伸，如下所述。
底漆延长件
如中所述，进行引物延伸以检测RNA内的G-quartet结构(4)使用底漆5′-TCCATCTGTTGTTCTCCTTTFMR1（飞行管理1级）和SXN小基因外显子2的5′-AGACCTCTGGGTCCAGTAG。
RNA结合分析
使用RNAs T7进行RNA-结合分析在体外转录标记为[α-32P] ATP。利用竞争凝胶位移分析测定亲和力消费税–如前所述的FMRP(4). 简要地，32P标记FMR1型包裹FBS的mRNA片段N19与0.1 pmol GST–FMRP在未标记N19或突变N19-ΔG4竞争物RNA浓度增加的情况下孵育。
多聚体制备
从四个直径为10 cm的汇合HeLa细胞板制备多聚体。收获前20分钟，向培养物中添加90µg/ml环己酰亚胺。细胞在200 mM Tris–HCl（pH 7.5）和5 mM MgCl中溶解2，100 mM KCl，10 U/ml RNasin（法国普罗米加），1 mM DTE，4°C时0.5%NP40。将13 000 r.p.m.离心10 min的上清液加载到4°C下36 000 r.p.m离心2 h的15–45%蔗糖梯度上。用0.1 M NaCl和2.5 vol.乙醇沉淀多体部分，并用GenElute哺乳动物总RNA试剂盒（Sigma）纯化这些部分的mRNA。
现场杂交
现场按照中所述进行杂交(22)使用荧光团CY3修饰的寡核苷酸（法国GE Healthcare），并针对外源性的Flag序列FMR1（飞行管理1级）（5′-CTTGTCATCGTCGTCCTTAGTCCATGAATTCCCCTATA）。
西部和北部斑点
如前所述，使用1C3抗体（1/2000）、抗Flag（1/1000 Sigma）、抗cMyc（1/500，法国Ozyme）和抗β肌动蛋白（1/1000）进行免疫印迹分析(18).
根据(23). 使用“dsDNA一体随机时间”试剂盒（Sigma）制备放射性探针FMR1（飞行管理1级）-编码cDNA的3′UTR和28S rRNA。
实时PCR
使用通用哺乳动物总RNA试剂盒（Sigma）制备的总RNA（1µg）用上标逆转录三在MX4000仪器（Stratagene）上使用Brilliant SYBR-Green QPCR核心试剂盒（Stratange）进行随机引物（Invitrogen）和实时PCR。以下寡核苷酸用于qRT–PCR.16Ra 5′-GTGGACTATCTGTTCGGGAA、R15/16 5′-CGTCGTTCCTTTGAAGCC、P14/15F 5′-GATATCAGGAACTAATTC、P14/15.1F 5′-GATATACTCCAACACAG、P14-15.2F 5′-GATATCAGACTCCAACC、11/13F 5′-CAAAGAGAGAGGCAGAGAGGA、5′UTR-FMR1.F 5′/GCGGAGAGAGAGA、，5′UTR-FMR1.R 5′-TGGTGGGAATCTCACATGG、R13/15 5′-CAGAATTAGTTCCTTTAAGTAG、R13/41.5 5′-GTGGTCAGATTCTTAGTAG、R13/15.2 5-CTGTTGGAGCTTTAAG、F-GAPDH 5′-GGATGGAGTTC和R-GAPDH 5'-TGCACACACATGTAG。
2D-页面
蛋白质提取和第一维度：通过离心收集细胞，并将其重新悬浮在10 mM Tris、1 mM EDTA和250 mM蔗糖中。用复水缓冲液（7 M尿素、2 M硫脲、4%CHAPS、0.4%两性细胞、20 mM DTT）进行溶解。DNA通过3分钟超声消除。总共100µg蛋白质被稀释在135µl的复水缓冲液中，用于复水Biorad ReadyStrip IPG pH 3–10条。使用MultiphorII系统（GE Healthcare），在500 V和250 Vh下等电聚焦30分钟，在1000 V和500 Vh下聚焦30分钟以及在4000 V和8000 Vh下对焦1小时。第二维度：在50 mM Tris–HCl pH 8.8、6 M尿素、30%甘油、2%十二烷基硫酸钠、50 mM DTT中平衡板条20分钟。将条带放置在垂直1.0 mm 10%SDS聚丙烯酰胺凝胶上，并用0.5%琼脂糖密封溶液密封。电泳在150 V的标准运行缓冲液中进行1 h。
RT–PCR
总RNA是从10天大的野生型（Wt）或FMRP的皮层中制备的−/−雄性小鼠使用Trizol试剂（Invitrogen），然后进行RNeasy纯化（德国希尔登市齐根），根据(24). 用上标逆转录总RNA（1µg）三（Invitrogen）使用随机启动。使用1微升的RT反应（1/10）在25µl反应体积中用以下引物进行PCR反应：F13 5′-GTGGAACAAAAGAGAGACATCG、R15 5′-CTCTCGCAGGAGCTC、R4 CACCAACAGCAAGGCTTT、F2-3 5′-TTGAAACAACTGGCAACCACCA、F-GAPDH和R-GAPDH。反应按如下方式进行，初始变性在95°C下3min，然后在95°C下30s，在60°C下30s和在72°C下30 s，共40个循环。
结果
FBS包含两个由腺嘌呤稳定的独立G四重奏结构
FMRP与自身的mRNA特异结合在体外(4,25,26)和在单元格中(27). FMRP在其mRNA上的结合位点，这里称为FBS，由一个G四分体基序组成，该基序存在于FMR1（飞行管理1级）信使核糖核酸(4). G-quartet基序是由几个鸟嘌呤四分体单元堆叠而成的。腺嘌呤也被怀疑通过形成插入腺嘌呤的四分体来促进FBS的结构。为了研究FMRP与其自身mRNA之间相互作用的功能，我们构建了一系列突变体，通过破坏G-quartet结构来抑制FMRP/FBS相互作用。以前的工作表明存在两种不同的G-四重奏结构(4). 为了验证这个假设，我们构建了两组突变来破坏一个或两个潜在结构，称为ΔG1和ΔG2(A） ●●●●。在第一步中，突变本质上是在密码子摆动位置将As替换为Cs和Us，以保留编码的FMRP蛋白序列并测试腺嘌呤的贡献。如前所述，RNA中存在G-四分体是由钾依赖性逆转录停止所指示的(4). ΔG1突变位于1613位附近，抑制了1613（G1）的停止，而1647（G2）位的停止保持不变(B） ●●●●。相反，ΔG2突变有相反的效果，1613停止不变，1647停止被抑制。这些结果表明，FBS中存在两个独立的G-四分体结构。此外，由于突变使FBS中的鸟嘌呤含量基本保持不变，同时替换了几个腺嘌呤，我们的结果支持腺嘌呤s在稳定两个FBS G-四元体中的作用。如前所述，这种稳定效应可以通过在G-四重奏结构中形成A-四分体叠加来解释(4). 当两组突变组合在突变ΔG（1+2）中时，位置1647处的停止重新出现，而位置1613处的停止仍然缺失(B） ●●●●。尽管存在突变ΔG2，但在ΔG（1+2）RNA的G2位置仍然再现了G-四分体结构，这可以解释为双突变产生了不同且更稳定的G-四元体结构，因为G-含量基本上不受突变的影响。
FBS中有两个独立的G-quartet(一)Wt和突变体（ΔG1、ΔG2、Δ的G1+2）FBS的序列。突变用粗体表示。图中显示了在存在150 mM KCl的情况下，RT在1613和1647的两个主要终止点的位置（+1是起始密码子的A）。序列上方的圆圈表示（B）中确定的RT停止状态（黑圈，停止；开圈，无停止）。(B类)全长Wt或突变株逆转录的自动放射自显影FMR1（飞行管理1级）mRNA构建和变性PAGE分离后（详见材料和方法部分）。1613和1647位置的阳离子依赖性阻滞显示了两个不同的G-四重奏结构的3′边。车道K和Na：分别使用150 mM KCl和NaCl进行扩建。RT停止的位置和状态用圆圈显示，如（A）所示。显示了突变体的测序通道。凝胶上部（顶部）的全长延伸产物反映了不同G-四分体结构的强度。
FMRP与自身mRNA结合对FMR1（飞行管理1级）翻译
接下来，我们通过凝胶位移试验测试了这些不同突变RNA与FMRP相互作用的能力，如前所述(4). 突变RNA（ΔG1和ΔG2）以与Wt FBS相同的亲和力与FMRP结合（数据未显示）。这表明FMRP对一个或另一个结构具有同等的约束力。为了完全破坏FBS中G四重奏的形成，进行了一组新的突变，主要由密码子摆动位置的a到C取代组成，并有利于发夹结构(A） ●●●●。突变被完整插入FMR1（飞行管理1级）mRNA和G-四分体结构的破坏通过逆转录酶（RT）延伸试验得到证实(B） ●●●●。我们之前已经证明了一个425长的RNA片段（N19）FMR1（飞行管理1级）含有FBS的mRNA再现了Wt结合效率(4). 为了证实FMRP在ΔG4-FBS上失去相互作用，将突变插入N19片段（N19-ΔG4），并用凝胶位移法测试其与FMRP的相互作用(C） ●●●●。与Wt N19 RNA相比，N19-ΔG4 RNA的结合效率降低了100倍以上(D） ●●●●。如前所述，在微摩尔范围内，这种相互作用水平被指定为非特异性结合(4).
四国集团内部的分裂FMR1型mRNA消除与FMRP的相互作用。(一)Wt或G-quartet-less的核苷酸序列FMR1（飞行管理1级）突变体结构（ΔG公司4） 及其氨基酸序列。下划线的核苷酸表示ΔG4中突变的核苷酸。(B类)反转录的阳离子依赖性阻滞显示ΔG4“全长”中没有G四聚体FMR1（飞行管理1级）mRNA。(C类)竞争实验，通过凝胶位移法比较包含Wt-FMRP结合位点N19和突变ΔG4-N19的425-nt长RNA片段的FMRP相对结合强度。车道“–”是没有竞争对手RNA的控制。自由和FMRP的位置复杂32显示了P标记的N19 RNA。图的顶部给出了未标记竞争者的摩尔浓度(D类)图中描绘了结合标记的N19 RNA相对于竞争对手RNA浓度的分数，该浓度由C测定。每个点都是至少三个独立实验的平均值和标准偏差。
然后分析FBS内G-quartet结构的破坏对不同细胞类型[HeLa、Cos-7和成纤维细胞FMR1（飞行管理1级）−/−老鼠(21)]通过短暂或稳定地表达FMR1（飞行管理1级）携带ΔG4突变。在这些细胞中，表达Wt或ΔG4的细胞之间未检测到FMRP蛋白水平的差异FMR1（飞行管理1级）(A） ●●●●。此外，在Wt和突变株之间也没有检测到差异FMR1（飞行管理1级）mRNA水平(B） ●●●●。此外，尽管有报道称，在缺乏FMRP的情况下，携带G四聚体的信使核糖核酸与多核糖体有不同的关联(10)，我们无法检测到ΔG4关联性的变化-FMR1型HeLa和HeLa中含有多聚体的mRNAFMR1（飞行管理1级）−/−小鼠成纤维细胞(C） ●●●●。最后，我们没有观察到Wt和ΔG4之间的任何显著差异FMR1（飞行管理1级）mRNA在HeLa细胞中的定位(D） ●●●●。因此，我们得出结论，FMRP和FBS之间的相互作用对FMR1（飞行管理1级）mRNA在受试细胞中的稳定性、翻译和定位。
FMRP结合自身mRNA对FMR1型翻译规则。(一)pTL1标记的Western blot分析-FMR1（飞行管理1级）和pTL1标志-ΔG4-FMR1（飞行管理1级）HeLa细胞中的表达。HeLa细胞（6×106细胞）转染指定数量的质粒（µg）。使用抗cMyc、抗Flag和抗肌动蛋白抗体对15µg总细胞提取物进行Westerns印迹，显示Wt和突变Δ之间没有差异G公司4-FMR1（飞行管理1级）编码蛋白水平（提出了三个独立实验之一，P（P）<0.05，在Cos-7和FMR1（飞行管理1级）−/−成纤维细胞）。(B类)Northern印迹分析FMR1（飞行管理1级）15µg HeLa细胞总RNA提取物的mRNA表达水平（使用编码pTL1的特异探针）FMR1（飞行管理1级）mRNA和28S rRNA作为内部控制。pBS为无控制车道FMR1（飞行管理1级）编码质粒。Wt和Δ之间没有差异G公司4个表达水平。(C类)Wt和突变体Δ的定位G公司4FMR1型HeLa细胞多核糖体中的mRNA。上部描绘了在254nm光密度下，以15-45%的线性蔗糖梯度分离的多核糖体的典型轮廓。下图表示通过qRT–PCR对FMR1（飞行管理1级）所示混合组分中的mRNA使用GAPDH公司mRNA作为内部控制。Wt和ΔG4之间未观察到显著差异-FMR1（飞行管理1级）mRNA在不同核糖体亚群中的定位。在FMR1（飞行管理1级）−/−细胞。(D类)Wt和ΔG4 mRNA的荧光细胞内定位就地HeLa细胞中的杂交。Cy3标记的反标记寡核苷酸探针（Flag）显示两种mRNA的细胞质和核周定位相似。细胞核DAPI染色。
FBS是一种有效的外显子剪接增强子
许多事实让我们接下来要研究FBS在剪接中的潜在含义。首先，FBS位于备选拼接位置附近FMR1（飞行管理1级）(A） ●●●●。其次，由于其高嘌呤含量，FBS的序列与ESE共识类似(28). 第三，由于其穿梭活性，FMRP被提议结合已经存在于细胞核中的mRNA，因此应该能够与前mRNA相互作用(29,30).
FBS具有ESE属性。(一)人体结构示意图FMR1（飞行管理1级）FBS定位基因。未翻译的区域以黑色表示，并显示可选拼接。(B类)SXN13小基因的结构示意图。RSV和Rous肉瘤病毒启动子。(C类)插入到Sal1公司和巴姆H1SXN13小基因外显子2的位点。序列12mu3是体外筛选的中度ESE(19). G4-FBS是FBS的最小片段，仍然能够形成G-四重奏结构（见下文B）。ΔG4-FBS是遗传密码被保留和G-quartet被破坏的相应突变体。内含子序列是小写的，外显子序列是大写的。这个SalI公司和巴米希网站有下划线。(D类)体外通过反转录分析SXN13 G4-FBS前mRNA中是否存在G-四分体，而ΔG4-FBS中没有。RNAs由T3转录产生，G-四元体的形成通过RT延伸试验进行分析，如B.车道K和N：分别使用KCl和Na进行延伸。显示了带有全长延伸产品的凝胶顶部。(E类)HeLa细胞中SXN13 G4-FBS和ΔG4-FBS-小基因的剪接效率。通过RT对从转染不同SXN13微基因结构的HeLa细胞中提取的5µg总mRNA进行引物SXN延伸。在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳上迁移后，通过放射自显影术显示结果。指出了不同转录本的外显子内容。
使用SXN13微基因系统测试FBS在体内充当ESE的能力(19)派生自β-珠蛋白基因，由四个外显子组成，其中一个（外显子2）交替剪接(B） ●●●●。具有ESE特性的序列（12MU3）在外显子2中的存在诱导了外显子2的包含，并导致更长的mRNA产物(C和E）。在小基因的第二外显子中插入一段仍能形成G四分位结构的FBS片段或其相应的ΔG4突变，以确定其ESE特性(C和D）。将含有不同微基因结构的质粒瞬时转染HeLa细胞后，使用5′端直接对从细胞中提取的总RNA进行RT延伸32小基因外显子3内的P标记寡核苷酸启动。通过测量珠蛋白小基因选择性剪接的长RT产物（含外显子2）和短RT产物（无外显子2中）之间的比率来评估FBS片段的ESE特性。虽然12MU3序列能够在大约80%的剪接事件中指定外显子2的内含子(E） ，G4-FBS片段诱导了外显子2的完全包含。同时，ΔG4-FBS突变体的外显子2被完全切除。这些数据表明，FBS对小基因具有强大的外显子剪接增强特性，这些特性与其形成G-四分位结构的能力有关。
一种FMRP亚型的过度表达改变了FMR1（飞行管理1级）PC12细胞中的选择性剪接模式
事实上，FBS在一个小基因中具有强大的ESE活性，这表明FMRP可以通过与FBS结合来调节其自身的剪接。为了验证这一假设，我们首先测试了携带FBS片段的珠蛋白小基因的剪接效率是否会受到FMRP的影响。SXN13-G4-FBS小基因的拼接在FMR1（飞行管理1级）−/−小鼠成纤维细胞(21). 在这些细胞中，FMRP主要细胞质亚型7或核亚型6的表达(18)通过瞬时或稳定转染，对SXN13-G4-FBS表达无明显影响（数据未显示）。FMRP对小基因系统没有影响可能是因为FBS超出了其自然环境或对小基因剪接有太强的ESE影响。
然后我们测试了FMRP过度表达对FMR1（飞行管理1级）前mRNA剪接。FBS位于FMR1型FBS的3′侧位于第15外显子三个不同受体5′端下游的110、74或35个核苷酸(4,31). 在这三个位点发生的选择性剪接导致六种类型的外显子15变体，这取决于外显子14是否被跳过。这三个受体位点在不同组织中的使用比例不同(32)表明在这一层面进行监管的可能性。因为FBS高度保守(4)我们测试了大鼠细胞中FMRP/FBS相互作用的可能影响。使用在可诱导启动子Tet-On控制下稳定转染标记的人类亚型1 FMRP（iso-1h）的大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞（PC12-1′细胞）。我们在这些细胞中测试了iso-1h FMRP增加对内源性（大鼠）的影响FMR1（飞行管理1级）mRNA交替剪接。诱导iso-1h表达后(A） 通过强力霉素处理细胞FMR1（飞行管理1级）在PC12细胞中发现mRNAs（大鼠+人）比其基础水平增加了30多倍(B左）。同时，全球内生水平FMR1（飞行管理1级）mRNA（大鼠）未受影响(B右）。在内源性FMR1（飞行管理1级）使用大鼠特异性引物集通过qRT-PCR进行分析(A） ●●●●。我们的数据表明，外显子15第一受体位点的产物（包括最长的亚型1、最常见的亚型7和亚型13和17）减少了2倍以上(B） ●●●●。这种减少伴随着次要亚型、外显子15第二和第三受体位点使用量的增加（分别是1.4倍和1.8倍），包括次要亚型2、3、8、9、14、15、18和19。因此，全长FMRP亚型的过度表达改变了FMR1（飞行管理1级）FBS周围的剪接事件表明主亚型和次亚型之间的平衡发生位移。这些数据与FMRP与FBS结合在调节FMR1（飞行管理1级）拼接。
外源性的过度表达FMR1（飞行管理1级）PC12细胞内的亚型1不影响内源性FMR1（飞行管理1级）mRNA。(一)右图（1C3），多西环素诱导后正常PC12细胞（PC12）和表达标记人FMRP亚型（PC12-1′）的PC12中FMRP表达的western blot分析。左侧（蛋白A），用TAG特异性抗体进行对照蛋白质印迹，以揭示PC12-1′提取物中不存在降解或流产产物。(B类)qRT-PCR数据比较总（内源性大鼠+外源性人类）和内源性（大鼠）水平FMR1型PC12（白条）和PC12-1′细胞（黑条）中的mRNA。数据是使用至少两种独立的RNA制剂进行qRT-PCR三倍扩增的平均值。PC12值被任意设置为1。使用内部标准GAPDH进行归一化。
外源性的过度表达FMR1（飞行管理1级）PC12细胞内的亚型1改变FMR1（飞行管理1级）拼接图案。(一)的示意结构FMR1型根据用于分析的大鼠特异性引物组列表进行选择性剪接的区域。给出了用它们能够测量的亚型进行引物定位的方法。(B类)通过qRT-PCR对不同的FMR1（飞行管理1级）使用（A）中的引物集，PC12（白条）和PC12-1′（黑条）细胞之间的异构体比率。数据是来自qRT-PCR三倍体的平均值，用GAPDH标准化，并使用至少两种独立的RNA制剂。PC12的值被任意设置为1*学生测试P（P）< 0.05. (C类)用2D-PAGE分离的PC12和PC12-1′细胞提取物上的抗FMRP（1C3）抗体进行Western blot。文章中描述的斑点从a到f进行识别。pH值范围显示在2D PAGE顶部。
我们还检测了导致外显子14跳跃的剪接事件。在全长FMRP过度表达后，发现所有缺少外显子14的转录物都减少了2倍。尽管导致第14外显子跳跃的剪接事件可能与发生在第14和第15外显子之间的剪接相关，但与后者相比，它们是相当罕见的事件[(26)我们的数据未显示]。确认变更FMR1（飞行管理1级）在iso-1h过度表达的RNA水平上观察到的表达，我们在2D PAGE后通过western blotting分析了FMRP亚型的表达。使用单克隆抗FMRP 1C3抗体（识别N末端表位）确实揭示了在iso-1h过度表达时FMRP亚型的显著差异(C） ●●●●。然而，由于剪接产物的复杂性，识别每个蛋白点极其困难。仅在表达iso-1h的细胞中可见的最高产物(C、 对，spot a）由于分子量较大，可能对应于外源iso-1h的无效转移。与PC12相比，斑点b和d显示PC12-1′细胞较宽，可能包含几个分子量相似的亚型物种。PC12-1′细胞中出现的c点的起源尚不清楚。最显著的是斑点f的减少，这可能对应于发现在mRNA水平上减少的最短的FMRP亚型10和11（分别为48和47kDa）。总之，这些数据表明一种FMRP亚型的过度表达能够改变FMR1型RNA和蛋白质水平的选择性剪接模式。
的拼接模式FMR1（飞行管理1级）外显子15在大脑皮层发生改变FMR1（飞行管理1级）−/−老鼠
在观察到细胞中FMRP的过度表达导致其第15外显子剪接的改变后，我们接下来测试FMRP的缺失是否会导致类似的缺陷。因此，我们分析了FMR1（飞行管理1级）Wt和中的mRNAFMR1（飞行管理1级）−/−FMRP蛋白缺失但FMR1型mRNA仍有表达。FMR1（飞行管理1级）−/−小鼠是通过在外显子5内插入新霉素盒产生的(33). 用RT-PCR分析外显子15剪接事件(A） 从10天龄Wt和FMR1（飞行管理1级）−/−小鼠以及这些提取物中的突触神经体部分（SN），其中FMRP功能被认为是突出的(34). 同时，RT-PCR也在FMR1（飞行管理1级）mRNA（外显子3，D） 和上的GAPDH公司信使核糖核酸(E） 用于规范化。如前所述，虽然FMRP蛋白表达在FMR1（飞行管理1级）−/−(C） ，FMR1（飞行管理1级）mRNA仍保持表达，尽管降低到Wt水平的65%左右(A和7D，比较车道3至4和车道5至6），可能是由于NMD事件。RT-PCR在外显子15上进行(A） 揭示了与外显子14和外显子15交替分支产生的三种亚型相对应的三条带。毫不奇怪，缺乏外显子14的亚型在这些PCR条件下没有检测到，因为它们的发生频率低得多(26). Wt和FMR1（飞行管理1级）−/−外显子15 RT-PCR产物(B） 揭示了与小剪接mRNA变异体相对应的小分子产物的显著差异。因此，这些外显子15的小剪接在FMR1（飞行管理1级）−/−总皮层提取物和SN组分(A车道4和6）。这些数据表明，FMRP的缺失改变了FMR1（飞行管理1级）第15外显子位于皮层。虽然FMRP的过度表达导致第15外显子小剪接的增加，但FMRP的缺失具有相反的效果。总之，这些数据支持FMRP在控制其第15外显子剪接中的作用。
FMRP的缺失改变了外显子15FMR1（飞行管理1级）小鼠皮层提取物中的信使核糖核酸剪接。(一)使用引物F13和R15对外显子15的剪接事件进行RT-PCR分析，并分别在外显子13和15中进行杂交。显示了在1.8%琼脂糖凝胶上分离的溴化乙锭染色PCR产物（负片）。1、无Taq聚合酶对照；2、不以Wt总皮层RNA进行RT对照；3、Wt总皮层RNA；4、KO总皮层RNA；5、皮层突触神经体的Wt总RNA；6、皮层突触体KO总RNA；7、控制pTL1质粒；五十、 DNA阶梯。每个PCR产物的预期大小显示在凝胶的右侧。(B类)RT-PCR产物的密度分析如（A）所示，表示为第3、4、5和6道第15外显子亚型的比率，色码与（A）中剪接方案的色码相同。误差线是标准偏差n个= 3. (C类)皮层提取物中FMRP表达的Western blot分析。抗FMRP抗体条带FMR1（飞行管理1级）−/−（KO）对应于与FXR的交叉反应性。(D类)利用引物F2-3和R4进行RT-PCR，分别对外显子2、3和4进行杂交。测试样品与（A）中的相同。(E类)RT-PCR使用引物F-GAPDH和R-GAPDH在GAPDH中与（A）中相同的样品杂交。
讨论
在这项工作中，我们分析了FMRP、脆性X综合征中缺失的蛋白及其自身mRNA中确定的结合位点之间相互作用的功能影响(4). 我们之前证明，FBS位于FMRP RGG域的编码区域内。该位点的一个主要结构特征是能够采用鸟嘌呤四链体或G-四链体基序。我们在这里表明，FBS的结构比最初想象的更复杂。因此，我们在FBS中鉴定了两个独立的G-quartet结构。在425nt长的片段（N19）的情况下，废除一个或另一个结构（突变体ΔG1和ΔG2）的突变对FMRP的结合效率没有影响，这表明FMRP可以模糊地与一个或另一个结构结合。此外，我们还证明了FBS的几个腺嘌呤在G-四元结构的微分稳定性中起作用，支持了最初的假设，即该结构涉及插入腺嘌呤-四元结构(4)以及其他G-四重奏结构(35). 然而，嘧啶取代这些腺嘌呤并不阻止FBS内形成G-四分体结构，也不影响与FMRP的结合在体外两种结构（突变体ΔG4）的消除，在保持编码蛋白序列不变的同时，显著降低了FMRP结合到非特定水平，并证实了G-quartet对有效结合的绝对要求。然后，我们测试了突变ΔG4在FMR1（飞行管理1级）mRNA在细胞中表达。令人惊讶的是，在HeLa细胞中，G-quartet缺失对mRNA翻译和定位以及多核糖体结合均无影响。因此，这些观察结果不支持最初提出的FMRP与自身mRNA结合的翻译控制的自身调节环中的作用(4). 事实上，FBS位点富含嘌呤，并且定位在接近替代剪接位点的位置，这暗示了其作为剪接调节因子的潜在功能FMR1（飞行管理1级）事实上，哺乳动物ESE最初被鉴定为富含嘌呤的序列，与特定的SR家族蛋白相关，并促进相邻剪接位点的利用(28). 当在小基因系统中测试FBS的一段保留其形成G-四分体能力的片段时，观察到一个强大的外显子剪接增强子活性。这种活性在一个突变株中被完全消除，该突变株虽然保留了一个富含G的序列（ΔG4），但已失去形成G四分体的能力。因此，我们的数据表明，FBS是一个强大的ESE，有趣的是，FBS的ESE活动似乎依赖于其采用G四重奏结构的能力。这些数据表明，FBS可能是FMR1（飞行管理1级）选择性剪接和FMRP的结合可以在控制中发挥作用。事实上，我们表明，外显子15选择性剪接产生的短和长FMRP亚型之间的平衡通过调节FMRP蛋白水平（通过过表达最长亚型1或FMR1（飞行管理1级）KO单元，其中FMR1（飞行管理1级）mRNA仍有表达）。这支持了FMRP与FBS位点结合控制自动调节环中不同亚型之间的比率的观点。FMRP最长亚型1与FBS的结合可以抵消或调节其ESE功能（例如通过干扰SR蛋白），从而有利于小位点包含。两个可选的G-四分位结构与外显子15中的两个可选剪接位点距离相等（分别为39和36 nt），这表明它们可以作为控制外显子十五可选剪接的分子开关。然而，目前不能排除FMRP对其自身mRNA选择性剪接的观察效果可能是间接的，例如涉及到FMRP对剪接因子的翻译控制。
FMR1选择性剪接调控的生物学意义目前尚不清楚，特别是因为不知道FMRP的不同亚型（其中一些亚型的含量很低）是否具有不同的功能。它们比率的变化可能对FMRP的功能有影响。例如，第二和第三受体位点的选择性剪接产生的第15外显子5′端缺失的亚型都缺乏丝氨酸499，丝氨酸499FMRP的主要已知磷酸化位点(36,37). 在果蝇中，这个磷酸化位点可以调节FMRP与mRNA的关联(37)并影响哺乳动物细胞的翻译(36). 根据我们的观察，增加FMRP与FBS的结合将导致FMRP主要亚型（携带一个完整的外显子15）的合成减少，同时增加次要亚型（缺乏丝氨酸499），下调负性自身调节环中的FMRP功能。
总之，虽然我们无法显示FMRP与自身结合的翻译效应FMR1（飞行管理1级）信使核糖核酸，我们的数据支持FMRP/G-四重奏相互作用对外显子15周围FMRP选择性剪接的调节的影响。事实上，FMRP细胞内水平的扰动导致外显子15亚型表达的调节，从而容易改变其RNA-结合特性，这表明存在一个可能的自我调节环。我们的数据还表明，FMRP可能参与其他基因的剪接调控，这些基因的蛋白质编码序列中含有G-quartet基序。这在FMRP表达水平最高的神经元中尤其明显，甚至在存在FMRP且有剪接发生的树突中也应如此(38).
致谢
我们要感谢芭芭拉·巴多尼（Barbara Bardoni）、伯纳德（Bernard）和香塔尔·埃里斯曼（Chantal Ehresmann）、J.塔齐（J.Tazzi）、尼古拉斯·查莱特（Nicolas Charlet）和西里尔·布尔乔伊斯（Cyril Bourgeois）的有益讨论，感谢M.Beauland和埃里克·弗拉特（Eric Flatter）的技术援助，感谢恩佐·拉利（Enzo Lalli。这项工作得到了美国国立卫生研究院（R01 HD40612-01）、国家癌症研究所（ANR-06-NEURO-015-01）、勒琼基金会（H.M.）、墨西哥医学研究基金会（X.T.）、癌症研究协会（M.C.D.）的支持。GIE CERBM为支付本文的开放存取出版费用提供了资金。
利益冲突声明。未声明。
参考文献
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