临床投资杂志。2008年6月2日；118(6): 2190–2199.
自噬相关蛋白beclin 1在早期阿尔茨海默病中表达减少，并调节小鼠淀粉样蛋白β的积累
,1 ,2 ,1 ,1 ,1 ,1,三 ,4 ,2 ,2 ,5和1,6
菲奥娜·皮克福德
1美国加利福尼亚州斯坦福大学医学院神经病学和神经科学系。2美国加州拉荷亚UCSD神经科学和病理学系。三德国柏林弗雷大学化学与生物化学研究所。4哥伦比亚大学内科和外科医生学院，美国纽约州纽约市。5美国德克萨斯州达拉斯市德克萨斯大学西南医学中心传染病科。6老年研究教育和临床中心，弗吉尼亚州帕洛阿尔托卫生保健系统，美国加利福尼亚州帕洛阿托。
埃利泽·马西利亚
1美国加利福尼亚州斯坦福大学医学院神经病学和神经科学系。2美国加州拉荷亚UCSD神经科学和病理学系。三德国柏林弗雷大学化学与生物化学研究所。4哥伦比亚大学内科和外科医生学院，美国纽约州纽约市。5美国德克萨斯州达拉斯市德克萨斯大学西南医学中心传染病科。6老年研究教育和临床中心，弗吉尼亚州帕洛阿尔托卫生保健系统，美国加利福尼亚州帕洛阿托。
马库斯·布里施吉
1美国加利福尼亚州斯坦福大学医学院神经病学和神经科学系。2美国加州拉荷亚UCSD神经科学和病理学系。三德国柏林弗雷大学化学与生物化学研究所。4美国纽约哥伦比亚大学内科医生和外科医生学院。5美国德克萨斯州达拉斯市德克萨斯大学西南医学中心传染病科。6老年研究教育和临床中心，弗吉尼亚州帕洛阿尔托卫生保健系统，美国加利福尼亚州帕洛阿托。
库尔特·卢辛
1美国加利福尼亚州斯坦福大学医学院神经病学和神经科学系。2美国加州拉荷亚UCSD神经科学和病理学系。三德国柏林弗雷大学化学与生物化学研究所。4美国纽约哥伦比亚大学内科医生和外科医生学院。5美国德克萨斯州达拉斯市德克萨斯大学西南医学中心传染病科。6老年研究教育和临床中心，弗吉尼亚州帕洛阿尔托卫生保健系统，美国加利福尼亚州帕洛阿托。
Ramya Narasimhan公司
1美国加利福尼亚州斯坦福大学医学院神经病学和神经科学系。2美国加州拉荷亚UCSD神经科学和病理学系。三德国柏林弗雷大学化学与生物化学研究所。4哥伦比亚大学内科和外科医生学院，美国纽约州纽约市。5美国德克萨斯州达拉斯市德克萨斯大学西南医学中心传染病科。6老年研究教育和临床中心，弗吉尼亚州帕洛阿尔托卫生保健系统，美国加利福尼亚州帕洛阿托。
菲利普·杰格
1美国加利福尼亚州斯坦福大学医学院神经病学和神经科学系。2美国加州拉荷亚UCSD神经科学和病理学系。三德国柏林弗雷大学化学与生物化学研究所。4哥伦比亚大学内科和外科医生学院，美国纽约州纽约市。5美国德克萨斯州达拉斯市德克萨斯大学西南医学中心传染病科。6老年研究教育和临床中心，弗吉尼亚州帕洛阿尔托卫生保健系统，美国加利福尼亚州帕洛阿托。
斯科特·斯莫尔
1美国加利福尼亚州斯坦福大学医学院神经病学和神经科学系。2美国加州拉荷亚UCSD神经科学和病理学系。三德国柏林弗雷大学化学与生物化学研究所。4哥伦比亚大学内科和外科医生学院，美国纽约州纽约市。5美国德克萨斯州达拉斯市德克萨斯大学西南医学中心传染病科。6美国加利福尼亚州帕洛阿尔托市弗吉尼亚州帕洛阿尔托医疗保健系统老年医学研究教育和临床中心。
布莱恩·斯宾塞
1美国加利福尼亚州斯坦福大学医学院神经病学和神经科学系。2美国加州拉荷亚UCSD神经科学和病理学系。三德国柏林弗雷大学化学与生物化学研究所。4哥伦比亚大学内科和外科医生学院，美国纽约州纽约市。5美国德克萨斯州达拉斯市德克萨斯大学西南医学中心传染病科。6老年研究教育和临床中心，弗吉尼亚州帕洛阿尔托卫生保健系统，美国加利福尼亚州帕洛阿托。
爱德华·罗肯斯坦
1美国加利福尼亚州斯坦福大学医学院神经病学和神经科学系。2美国加州拉荷亚UCSD神经科学和病理学系。三德国柏林弗雷大学化学与生物化学研究所。4美国纽约哥伦比亚大学内科医生和外科医生学院。5美国德克萨斯州达拉斯市德克萨斯大学西南医学中心传染病科。6老年研究教育和临床中心，弗吉尼亚州帕洛阿尔托卫生保健系统，美国加利福尼亚州帕洛阿托。
贝斯·莱文
1美国加利福尼亚州斯坦福大学医学院神经病学和神经科学系。2美国加州拉荷亚UCSD神经科学和病理学系。三德国柏林弗雷大学化学与生物化学研究所。4哥伦比亚大学内科和外科医生学院，美国纽约州纽约市。5美国德克萨斯州达拉斯市德克萨斯大学西南医学中心传染病科。6老年研究教育和临床中心，弗吉尼亚州帕洛阿尔托卫生保健系统，美国加利福尼亚州帕洛阿托。
托尼·怀斯·科雷
1美国加利福尼亚州斯坦福大学医学院神经病学和神经科学系。2美国加州拉荷亚UCSD神经科学和病理学系。三德国柏林弗雷大学化学与生物化学研究所。4哥伦比亚大学内科和外科医生学院，美国纽约州纽约市。5美国德克萨斯州达拉斯市德克萨斯大学西南医学中心传染病科。6老年研究教育和临床中心，弗吉尼亚州帕洛阿尔托卫生保健系统，美国加利福尼亚州帕洛阿托。
1美国加利福尼亚州斯坦福大学医学院神经病学和神经科学系。2美国加州拉荷亚UCSD神经科学和病理学系。三德国柏林弗雷大学化学与生物化学研究所。4哥伦比亚大学内科和外科医生学院，美国纽约州纽约市。5美国德克萨斯州达拉斯市德克萨斯大学西南医学中心传染病科。6老年研究教育和临床中心，弗吉尼亚州帕洛阿尔托卫生保健系统，美国加利福尼亚州帕洛阿托。
通信地址：Tony Wyss-Coray，斯坦福大学神经病学和神经科学系，SUMC室A343，Stanford，California 94305-5235，USA电话：（650）852-3220；传真：（650）849-0434；电子邮件：在cwt时的湿度. 收稿日期：2007年8月13日；2008年4月2日验收。
- 补充资料
补充数据
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摘要
自噬是降解长寿命蛋白质和细胞器的主要细胞途径，并调节细胞命运以应对应激。最近，自噬与神经退行性变有关，但它是有害的还是保护性的尚不清楚。在这里，我们报告了beclin 1，一种在自噬中起关键作用的蛋白质，在阿尔茨海默病（AD）患者发病早期受影响的大脑区域中减少。beclin 1的杂合缺失(贝肯1)在小鼠中，神经元自噬减少，导致神经变性和溶酶体破坏。在表达人类淀粉样前体蛋白（APP）（AD模型）的转基因小鼠中贝肯1表达增加了神经元内淀粉样β（Aβ）的积累、细胞外Aβ的沉积和神经变性，并导致小胶质细胞改变和严重的神经元超微结构异常。施用表达beclin 1的慢病毒载体可降低APP转基因小鼠的细胞内和细胞外淀粉样病变。我们得出结论，beclin 1缺乏会干扰小鼠的神经元自噬，调节APP代谢，并促进神经退行性变，增加beclin l水平可能对AD有治疗潜力。
介绍
家族性阿尔茨海默病（AD）突变增加淀粉样β（Aβ）肽的毒性和淀粉样变性，使淀粉样前体蛋白（APP）代谢和Aβ生成的中断成为AD发病的中心(1). 然而，不到2%的AD病例是由常染色体显性突变引起的。由这些突变引起的家族性AD和其余非显性散发性AD病例在病理上相似。因此，破坏APP代谢和Aβ生成的因素，如APP转录增加，淀粉样蛋白原性Aβ生成增加(2)和APP降解减少，也可能与散发性AD的发病机制有关。
AD的病因不同于其他神经退行性疾病，如帕金森病和亨廷顿病（HD），但所有这些疾病的病理特征都是存在异常蛋白聚集和神经元死亡(三,4). 蛋白质聚集体可通过蛋白质的异常折叠或蛋白水解过程或细胞内蛋白质降解途径的干扰形成(三,5). 自噬参与聚集蛋白α-突触核蛋白的细胞内降解(6)和亨廷顿(7,8). 自噬空泡以前在AD脑中的营养不良神经节中被发现，可能是aβ产生的场所(9,10). 同时，在没有其他损伤的情况下，基底神经元自噬的消除足以导致神经退行性变(11,12). 因此，我们有兴趣确定自噬是否以及如何参与AD的发病机制。
自噬是参与长寿蛋白质和细胞器降解、细胞重塑和营养饥饿期间存活的主要途径(5,13). 细胞溶质成分周围形成杯状隔离膜，最终融合形成双膜囊泡。这种自噬体在与溶酶体融合之前，经历了几次微管依赖性成熟事件，包括与内切体和多层囊泡的融合(14,15). Beclin 1在自噬中起关键作用(16–20)，调节Vps34的自噬促进活性(21)，参与细胞膜的募集以形成自噬体。Beclin 1也与Bcl-2相互作用(22)，因此可能参与调节细胞死亡，但也可能存在beclin 1–自噬的独立形式(23).BECN1公司信使核糖核酸和蛋白质在人和小鼠大脑的神经元和神经胶质中表达(22,24). 而敲除小鼠缺乏贝肯1(贝肯1–/–)胚胎发生期间死亡(17,18),贝肯1+/–小鼠存活；它们减少了骨骼肌、支气管上皮细胞和B淋巴细胞中自噬体的形成(17). 然而，据我们所知，这些小鼠的神经元表型之前还没有确定。
我们在此报告，AD患者大脑中的beclin 1显著降低。APP转基因小鼠中Beclin 1缺乏减少神经元自噬，破坏溶酶体，促进细胞内和细胞外Aβ积累，并导致神经退行性变。局部增加beclin 1表达可降低APP转基因小鼠的淀粉样病变。我们的数据提供了我们认为的第一个证据，即在一种主要的神经退行性疾病中，自噬途径的一个重要组成部分被减少，并揭示了一种潜在的治疗AD的新方法。
结果
AD患者大脑中的Beclin 1减少。
为了确定自噬（尤其是自噬诱导蛋白beclin 1）是否与AD有关，我们测量了8例中度至重度AD患者（平均年龄81.6±4.2岁；简易精神状态检查[MMSE]评分<14）、11例轻度认知功能障碍（MCI；平均年龄85.1±2.7岁；MMSE评分>26）和11名非强化对照组（平均年龄77.2±2.3岁）（图、A和B以及补充表1；本文的在线补充材料；数字对象标识：10.1172/JCI33585DS1号机组). 健忘症MCI患者的临床诊断，可被视为AD的早期前驱症状(25)经尸检发现轻度AD病理证实（数据未显示）。在这些MCI病例中，beclin 1水平降低到年龄匹配对照组检测水平的70%，在严重AD患者中，beclin 1水平降低至对照组水平的30%。相反，患有路易体变异型AD的患者的beclin 1水平没有显著降低（图B） ●●●●。有趣的是，HD患者的beclin 1水平总体上没有显著降低，尽管个别病例的AD范围有所降低。
在AD中，Beclin 1降低。(一和B类)AD患者尸检证实的大脑中额叶皮层灰质中beclin 1水平(n个=8），MCI(n个=11），AD的路易体变体（LBV；n个=5），高清(n个=7）和年龄匹配的非粘连非病理对照组（C；n个= 11). (一)用抗beclin 1、抗NSE和抗肌动蛋白抗体检测代表性Western blot。(B类)Beclin 1带归一化为肌动蛋白和NSE对照（未显示）。每个点代表一个样本。(C类)的比率BECN1公司对照组和AD患者内嗅皮质与齿状回mRNA的比较。(D类和E类)24个月龄T41小鼠皮层中的Beclin 1和APP水平(n个=6只APP转基因小鼠，3只非转基因小鼠）和34个月龄J20小鼠(n个=5个APP转基因，4个非转基因）。APP的表达和Aβ的沉积并没有降低beclin1的水平。数值为平均值±SEM；通过ANOVA和Dunnett检验比较平均差异(B类)或未成对学生的t吨测试(C类和E类).
与8名年龄匹配的对照组相比，8名AD患者未受影响小脑灰质中的Beclin 1水平没有降低（相对Beclin l，AD，0.900；对照组，0.963；P（P）= 0.8; 平均年龄，AD，79.4±3.2岁；对照组72.9±4.3岁）。Beclin 1水平与死亡间隔、年龄或性别无关。免疫组织化学分析显示人皮层神经元中有beclin 1免疫反应。随着AD的进展，整体beclin 1免疫反应性和阳性细胞数量均减少（补充图1）。虽然人类死后大脑切片的免疫染色很难验证，但染色似乎与泛神经细胞一致BECN1公司艾伦脑图谱中报告的小鼠mRNA表达模式(24). 其他人也报道了beclin 1在神经元和神经胶质细胞中表达(8,22,26).
Beclin 1在AD脑中的mRNA水平也降低。我们依赖AD的时空分布(27)解决微阵列固有的分析局限性，并确定AD大脑与对照组中差异表达的mRNA(28). 使用先前生成的微阵列数据集(28)我们通过相对受保护的齿状回中的mRNA水平来划分脆弱的内嗅皮层中的mRNA水平，以控制个体间的差异。减少50%BECN1公司与对照组相比，AD患者中观察到mRNA（图C） ●●●●。
总之，内嗅皮层的AD脑中beclin 1水平显著降低。由于神经元蛋白神经元特异性烯醇化酶（NSE）的水平在任何情况下都没有显著降低（图A） beclin 1的减少不太可能完全归因于神经元细胞的丢失。另一方面，免疫组化显示，在AD晚期，beclin 1免疫阳性细胞较少，神经元的丢失可能也导致了beclin l的减少。
转基因小鼠的AD-like病理学不会导致beclin 1缺乏。
AD大脑受影响区域中beclin 1的减少（图A–C）可能导致或促成AD的发展，可能与AD无关，也可能是AD病理学的结果。为了研究这个问题，我们分析了两个不同品系的高龄APP转基因小鼠（J20，34个月龄；T41，24个月龄，见方法）的皮质beclin 1蛋白水平。两个品系均表达高水平的突变人类APP，并形成广泛的Aβ沉积(29,30)从而再现了AD病理学的关键方面。与非转基因、年龄匹配的同窝对照小鼠相比，T41或J20小鼠的Beclin 1水平没有降低（图、D和E）。这些数据表明，突变APP的过度生产和淀粉样病变的发展不足以导致小鼠的beclin 1缺乏，并使AD病例中观察到的beclin-1减少可能发生在APP病变的上游。
贝肯1+/–小鼠减少了神经元自噬。
Beclin 1在自噬中起关键作用，并参与外周细胞自噬体的形成(16). 为了确定beclin 1水平降低是否影响神经元自噬体的形成，我们交叉了贝肯1+/–在鸡β-肌动蛋白启动子的控制下，转基因小鼠全身表达GFP标记的微管相关蛋白1轻链3（GFP-LC3）融合蛋白(31). 因为LC3是自噬体的标志物(32)，我们能够在培养的初级海马神经元中计数GFP-LC3点形成标记的自噬体GFP-LC3型+贝肯1+/+和GFP-LC3型+贝肯1+/–小鼠（图A） ●●●●。野生型beclin 1表达的神经元显示出许多自噬体。Beclin 1缺陷神经元的自噬体数量少于一半（图，A和B），表明神经元自噬减少。这些数据与这些小鼠外周组织自噬减少的报道一致(17).
Beclin 1和神经元自噬减少贝肯1+/–老鼠。(一和B类)对50个原代海马神经元中的自噬体（箭头）进行计数GFP-LC3型+贝肯1+/+和GFP-LC3型+贝肯1+/–老鼠(n个=每组3人）。所示为代表性图像(一)和量化(B类). (C类和D类)RIPA缓冲液–来自9个月大雌性大脑皮层的可溶性蛋白质应用程序+贝肯1+/–和应用程序+贝肯1+/+老鼠(n个=7个/组），用Western blot分析并检测beclin 1；值被归一化为肌动蛋白水平。(E类和F类)RIPA缓冲液–来自16个月大男性大脑皮层的可溶性蛋白质应用程序+贝肯1+/–和应用程序+贝肯1+/+老鼠(n个=每组4人），用Western blot分析并检测LC3；将数值归一化为α-微管蛋白水平，并计算LC3-I和LC3-II之间的比率。数值为平均值±SEM；平均差异由未配对学生的t吨测试。原始放大倍数，×400。
Beclin 1缺乏促进APP转基因小鼠细胞外和神经元内Aβ沉积。
研究贝肯1AD模型中淀粉样蛋白病理缺陷，贝肯1+/–老鼠(17)与上述T41 APP杂合子转基因小鼠杂交，这些小鼠在3-5个月大时开始在额叶皮质形成进行性AD样淀粉样病变(30). 正如预期的那样，beclin 1蛋白水平在应用程序+贝肯1+/–小鼠与应用程序+贝肯1+/+两个9岁的室友（图（C和D）和3.5个月大（未显示数据）。beclin 1的这种缺乏与自噬减少有关，如LC3-II相对水平与LC3-I相比下降所示（图、E和F）。虽然LC3-I存在于细胞溶质中，但脂化LC3-II型主要与自噬体膜有关，是自噬小体的良好指示物(32,33). 这些数据与神经元自噬减少相一致GFP-LC3型+贝肯1+/–小鼠（图、A和B）。
在9个月大的女性中，Beclin 1缺乏和自噬减少伴随着细胞外aβ免疫反应性沉积物增加近2倍应用程序+贝肯1+/–小鼠与应用程序+贝肯1+/+窝友控制（图、A和B）。与雄性T41小鼠相比，雌性小鼠的Aβ沉积加速；因此，我们在这里只分析了女性。与Aβ结果一致，球形硫黄素S阳性斑块（细胞外原纤维淀粉样蛋白）的数量在应用程序+贝肯1+/–小鼠与应用程序+贝肯1+/+老鼠(应用程序+贝肯1+/+, 0.5 ± 0.15;应用程序+贝肯1+/–, 1.88 ± 0.3;n个=每个基因型7–8个；P（P）= 0.002). 此外，神经元内Aβ在应用程序+贝肯1+/–鼠标（图（C和D）。细胞内Aβ在AD中的作用尚不清楚，但来自人类神经病理学研究的证据表明，它在疾病过程的早期积累，这一发现已在一些AD小鼠模型中复制（参考文献。34). 在T41小鼠中，我们发现显著的细胞内Aβ随着年龄增长而增加，而APP水平保持不变（补充图3和4）。有趣的是，神经元内Aβ部分与组织蛋白酶D（补充图4）共定位，组织蛋白酶是溶酶体和成熟自噬体的标记(35).
应用程序+贝肯1+/–小鼠淀粉样病变加重。(一和B类)9月龄女性额叶皮层Aβ免疫反应应用程序+贝肯1+/–和应用程序+贝肯1+/+老鼠。冠状脑切片用生物素化抗Aβ免疫染色1–5抗体（3D6）。Aβ沉积由Aβ免疫反应（IR）的百分比面积定义。(C类和D类)9个月龄雌性大鼠海马（Hip）和额顶叶皮层（Ctx）的细胞内Aβ免疫反应性（4G8）应用程序+贝肯1+/–和应用程序+贝肯1+/+老鼠。(E类)总甲酸-可溶Aβ1倍ELISA法测定女性大脑皮层中的水平应用程序+贝肯1+/–和应用程序+贝肯1+/+老鼠。(F类)总甲酸-可溶Aβ1–x大脑皮层中的beclin 1蛋白水平与beclin的相对水平呈负相关。数值为平均值±SEM；平均差异由未配对学生的t吨测试。n个=每个基因型7–8个。比例尺：100μm(一); 10微米(C类).
为了支持这些组织学数据，甲酸-可溶性Aβ水平1–x用ELISA测定应用程序+贝肯1+/–与应用程序+贝肯1+/+小鼠的大脑皮层（图E） 海马显著增加（表). 甲酸可溶性Aβ增加的趋势1–42也出现在应用程序+贝肯1+/–老鼠（表). 重要的是，这些小鼠的甲酸可溶Aβ水平与新皮质中的beclin 1蛋白水平呈负相关（图F） 进一步将beclin 1水平降低与Aβ沉积增加联系起来。Beclin 1缺乏并未导致幼年小鼠APP或APP C末端片段（APP-CTF）稳态水平或甲酸可提取Aβ水平的显著差异，尽管注意到总Aβ水平有增加的趋势（表以及补充图2）。总的来说，这些数据表明，幼年小鼠中缺乏beclin 1并不会显著改变APP的处理或周转。
表1
beclin 1缺乏对APP转基因小鼠脑内Aβ蓄积的影响
Beclin 1缺乏导致APP转基因小鼠的小胶质细胞改变。
大脑中的小胶质细胞是脑损伤的一个敏感指标，我们试图确定这些细胞是否表现出异常激活或变化，以应对与beclin 1缺乏相关的aβ积累增加。女性新皮质中小胶质细胞CD68的相对表达应用程序+贝肯1+/–与对照组相比，小鼠增加了2.5倍应用程序+贝肯1+/+在Aβ沉积物周围聚集（图、A和B）。CD68或macrosilin是一种高度糖基化的跨膜蛋白，在晚期内体中表达，在较小程度上表达于髓细胞的细胞表面。CD68表达增加以前被用来表示巨噬细胞和小胶质细胞的活化或吞噬活性增加(36,37). 另一方面，APP小鼠中另一种功能未知的巨噬细胞/小胶质细胞标记物电离钙结合相关蛋白-1（Iba-1）的表达并没有因beclin 1缺乏而改变（图、A和C）。在没有Iba-1表达变化的情况下，聚集在Aβ沉积物周围的小胶质细胞CD68表达增加，表明beclin 1缺乏改变了小胶质细胞对Aβ的反应。
小胶质细胞变化应用程序+贝肯1+/–老鼠。(一–C类)9个月龄女性额叶皮质小胶质细胞的变化应用程序+贝肯1+/–和应用程序+贝肯1+/+用CD68和Iba-1抗体对小鼠进行免疫染色。所示为代表性图像(一)和量化(B类和C类). 箭头表示淀粉样沉积物周围的小胶质簇。数值为平均值±SEM；平均差异由未配对学生的t吨测试。n个=每个基因型7–8个。比例尺：50μm。
Beclin 1缺乏可促进APP小鼠的突触树突状变性并导致神经元丢失。
AD发病早期发生突触变性(38–41)和2个重要自噬基因的完全敲除(附件5或附件7)在神经元中导致泛素化蛋白的积累和神经元损失(11,12). 我们假设，与在AD中观察到的情况类似，beclin 1缺乏会促进AD转基因小鼠模型中的神经退行性变应用程序+贝肯1+/–小鼠导致新皮质突触素免疫反应性突触终末显著减少(应用程序+贝肯1+/–; 21.8 ± 0.95,应用程序–贝肯1+/+; 26.5 ± 0.60,P（P）= 0.0003; 图A） 和海马（图B） 与野生型雌雄同体对照相比。同样，树突状标记物微管相关蛋白2（MAP-2）的表达在应用程序+贝肯1+/–小鼠与野生型同窝鼠对照组的比较（图、C和D）。在野生型小鼠中，在体细胞和神经元过程中都检测到强烈的MAP-2免疫反应性，而在应用程序+贝肯1+/–小鼠神经元突起的免疫反应被破坏。这些突触-脊髓炎完整性标记物已被用作AD和各种疾病小鼠模型中神经元变性的敏感早期指标(29,42–45). 钙结合蛋白免疫反应性也有类似的下降，这与APP小鼠的APP-相关记忆缺陷密切相关(46)中也观察到应用程序+贝肯1+/–鼠标（图E） ●●●●。值得注意的是，仅beclin 1缺乏应用程序–贝肯1+/–小鼠的3个标记物均显著下降。
9个月大的儿童神经变性应用程序+贝肯1+/–老鼠。(一–E类)突触体素(一和B类)，地图-2(C类和D类)和钙结合蛋白(E类)9月龄女性的免疫反应应用程序+贝肯1+/–老鼠和对照鼠。分析的大脑区域是额叶皮层(一,C类、和D类)，海马(B类)和齿状回(E类). 冠状脑切片用相应抗体进行免疫染色，平均免疫反应面积百分比(一–D类)或外径(E类; 通过方差分析和Tukey-Kramer事后检验计算和分析每只小鼠的二氨基联苯胺染色(n个=每个基因型7–8个）。(一和C类)注意突触和树突形态的破坏应用程序–贝肯1+/–和应用程序+贝肯1+/–老鼠。(F类)使用光学解剖器法估计内嗅皮层第二层的神经细胞计数。结果通过方差分析和Tukey-Kramer事后检验进行分析(n个=每个基因型3个）。数值为平均值±扫描电镜。原始放大倍数，×980(一); ×720 (C类).
有趣的是，beclin 1缺乏导致内嗅皮层第二层神经元的大量丢失应用程序+贝肯1+/–与野生型或应用程序–贝肯1+/–小鼠（图F） ●●●●。与其他研究一致(47),应用程序+贝肯1+/+小鼠神经元无明显丢失；类似地，应用程序–贝肯1+/–小鼠没有明显的损失（图F） ●●●●。海马体或额叶皮层的大小在应用程序+贝肯1+/+或应用程序+贝肯1+/–小鼠（补充表2）。总之，这些发现表明，在人类APP无过度表达的情况下，beclin 1缺乏足以导致突触变性，并且beclin 2是维持神经元完整性所必需的。
APP溶酶体破坏+贝肯1+/–老鼠。
为了进一步了解beclin 1缺乏引起的大脑病理变化，对5个月大的神经元的超微结构进行了研究应用程序+贝肯1+/–用电子显微镜检查小鼠（图和补充图5）。Beclin 1缺乏导致异常、增大的溶酶体与电子密度物质显著聚集（图). 虽然这在应用程序–贝肯1+/–在小鼠中，APP和Aβ的过度生产在应用程序+贝肯1+/–小鼠，突显了这两种基因改变之间的潜在协同作用。如前所述，APP转基因小鼠（即。，应用程序+贝肯1+/+)显示营养不良神经突中的多层致密核心体，其中一些可能是自噬体(35). 然而，这些小鼠没有表现出我们在应用程序+贝肯1+/–老鼠。此外，应用程序+贝肯1+/–小鼠表现出突触中的板层小体、自噬体样的层流小体以及轴突中的纤维和电子致密小体的堆积（补充图5）。这些超微结构变化支持免疫组织化学记录的突触-树突状细胞异常（图).
异常溶酶体应用程序+贝肯1+/–老鼠。5月龄小鼠神经元的电子显微照片。应用程序–贝肯1+/+小鼠的溶酶体正常（单箭头）。应用程序+贝肯1+/+小鼠在营养不良的神经突中有多层致密核心体（双箭头）。应用程序–贝肯1+/–小鼠的溶酶体含有电子致密体（单箭头）。应用程序+贝肯1+/–小鼠的溶酶体大量增大，含有电子致密体（双箭头）。原始放大倍数，×25000。
Beclin 1过度表达降低细胞内和细胞外Aβ。
为了确定增加beclin 1水平是否可以减少AD样病理，在6个月大的APP转基因小鼠的额叶皮层和海马注射慢病毒编码小鼠beclin 1（右侧大脑）或GFP（左侧大脑，内部控制）。8周后，GFP和小鼠beclin 1显著表达（图A） ●●●●。表达beclin 1的小鼠大脑半球的细胞内Aβ免疫反应性显著低于其各自表达GFP的大脑半球（图、B和C）。此外，通过硫黄素S在额叶皮层评估的细胞外Aβ沉积也因小鼠beclin 1的表达而减少（图D） ●●●●。
增加beclin 1表达可减少淀粉样病变。将编码GFP或小鼠beclin 1（mbeclin 1）的慢病毒注射到6个月龄APP转基因小鼠的左侧（GFP）或右侧（beclin 2）海马和皮层。(一)慢病毒注射到海马8周后，GFP和小鼠beclin 1表达。(B类和C类)随着小鼠海马区beclin 1过度表达，细胞内Aβ（4G8）减少(B类)和额顶皮层(B类和C类)8个月大的小鼠。(D类)通过硫黄素S染色测量额叶皮层细胞外β-折叠Aβ沉积也因beclin 1过度表达而减少。结果由未配对学生的t吨测试(n个=每组4人）。数值为平均值±SEM。原始放大倍数，×10(一); ×40 (B类).
讨论
我们的数据表明beclin 1和自噬在AD发病机制中的作用。他们认为，在AD中观察到的beclin 1缺乏症（但在相关痴呆中未观察到）可以促进神经退行性变并加速Aβ的积累。在AD早期，受影响的额叶中皮层的Beclin 1水平降低（图，A和B），但在大部分未受影响的小脑中没有减少，即使在疾病晚期。无论是与肌动蛋白水平还是与神经元标记物NSE相比，Beclin 1水平都同样降低，这表明每个神经元的Beclin l相对量减少。然而，免疫组织化学也显示，随着疾病的进展，神经元数量和染色的相对强度都减少了，这可能是由于整体表达减少和神经元丢失导致的beclin 1水平降低。与路易体变异相关的AD患者的额叶中叶皮质中的beclin 1没有减少，这表明beclin l的显著减少对最常见的AD形式具有特异性。在最近的研究中，HD自噬与自噬有关(7,8)并且观察到beclin 1在本病中被招募到神经元内包涵体(8)有趣的是，一些HD患者的beclin 1水平很低（图B） ●●●●。beclin 1的保留可能提供了一种局部降低beclin 1水平的机制，这种降低可能会影响神经元的完整性，其方式类似于此处描述的净beclin l降低。
在这一点上，询问AD病理学本身是否通过过度刺激或耗尽自噬途径来驱动beclin 1减少是恰当的。事实上，之前已经在AD患者大脑中的营养不良神经突中发现了越来越多的自噬空泡(35,48)和APP转基因小鼠(10,35). 我们还发现，中度和重度AD患者的beclin 1水平低于早期AD和/或MCI患者。另一方面，BECN1公司阿尔茨海默病患者内嗅皮层中的mRNA特异性降低（图C和参考。28)、和BECN1公司人类大脑中的mRNA和蛋白质水平随着年龄的增长而降低，与AD病理学无关(8). 此外，在2个过度表达APP的AD小鼠模型中，beclin 1没有减少（图D） ●●●●。这些发现表明，在小鼠中观察到的AD样淀粉样病变不足以耗尽体内的beclin 1水平，尽管它们不排除AD中更慢性损伤的神经元中beclin l降低的可能性。
目前尚不清楚beclin 1是如何在神经元中调节的，以及为什么它会随着年龄或AD而减少。未来的研究将显示与AD病理学相关的其他因素是否会促进beclin 1缺乏，以及大脑中beclin l水平低的个体是否有发生神经退行性变和AD的风险。Bcl-2、Vps34和最近描述的蛋白UV抗辐射相关基因（UVRAG）都能与beclin 1结合从而调节自噬(20,21,49–51). 这些因素是否也影响beclin 1转录尚不清楚。此外，beclin 1缺乏可能对这些或其他独立于自噬的蛋白质产生影响。AD自噬可能不仅由于beclin 1缺乏，而且还由于轴突运输中断而被错误调节(52–54)早老素是γ-分泌酶复合体的一部分，早老素的功能失调曾被认为与自噬体与溶酶体的融合有关(10,55,56).
通过免疫组织化学和生物化学方法评估，Beclin 1缺陷APP小鼠在9个月龄时的Aβ水平高于APP小鼠（图和表). 相反，beclin缺乏并没有显著改变幼年小鼠的Aβ、APP或APP-CTF水平（补充图2和表)因此，不太可能在很大程度上影响APP的处理。细胞和分子研究将有必要确定自噬或beclin 1对APP代谢和Aβ分泌酶活性是否有更微妙的影响。beclin 1缺乏促进Aβ积累的机制备受关注。一种可能性是beclin 1是通过自噬降解细胞内Aβ或APP所必需的。为了支持这一点，我们发现beclin 1缺陷神经元的自噬减少（图). Beclin 1缺乏促进神经元中Aβ的积累（图和细胞内Aβ与溶酶体水解酶组织蛋白酶D共定位（补充图4）。此外，电子显微镜显示，beclin 1缺陷的神经元具有异常的溶酶体，其中含有电子致密体，并且这些溶酶体在APP的存在下更为普遍和扩大。此外，病毒传递导致的beclin 1过度生成降低了神经元内（和细胞外）Aβ（图). AD患者内体/溶酶体系统的破坏一直有报道(57); 然而，据我们所知，由beclin 1缺乏引起的超微结构破坏以前是未知的。在beclin 1缺乏的情况下，神经元自噬减少和溶酶体破坏可通过beclin l对自噬和内切体/溶酶体融合的单独作用来解释(58)，如在酵母中发现的。最近的数据表明，Vps34/beclin 1复合物可能受到额外结合蛋白的差异调节，以在自噬或内体途径中发挥作用(51). 例如，UVRAG在哺乳动物细胞中结合Vps34/beclin 1并形成几种不同的复合物(51). 或者，beclin 1可能只直接参与自噬，但自噬途径的破坏可能随后影响其他细胞内细胞器（例如内体）的流量，导致溶酶体的破坏。beclin 1仅调节哺乳动物细胞中Vps34的自噬功能的证据支持了这一解释(21).
另一种可能性是，beclin 1缺乏会破坏细胞内细胞器动力学，从而将APP的分布转移到产生更多Aβ的不同亚细胞隔室。虽然APP处理发生在许多细胞内隔间，但Aβ在酸性内体/溶酶体系统中高水平生成(59). 电子显微镜显示，该隔间的扩张应用程序+贝肯1+/–神经元（图和补充图5），可能导致Aβ生成增加。这些可能性并非相互排斥，也可能不限于神经元。有趣的是，在beclin 1缺乏的APP小鼠中，聚集在aβ沉积物周围的小胶质细胞中，CD68（小胶质细胞的晚期内体标记物）的水平显著增加（图). 因此，可能这些细胞在清除细胞外环境中摄取的Aβ方面效率较低。此外，Aβ的主要毒性作用是发生在细胞内还是细胞外，还有待证明(34). 我们发现beclin 1缺乏导致细胞内和细胞外Aβ积累增加，这为蛋白质的细胞内作用（或缺乏）如何影响Aβ的细胞外积累提供了一个示例。
在缺乏人类APP转基因的情况下，仅Beclin 1缺乏就足以在体内引起突触-树突状变性，这表明Beclin-1缺乏并不需要Aβ引起神经变性。在beclin 1缺陷小鼠中，突触素、钙结合蛋白和MAP-2免疫反应性降低。MAP-2分布被破坏（图)，溶酶体中含有异常的电子致密颗粒（图). 虽然这并没有导致内嗅皮层第二层神经元的明显丢失（图F） ，这些数据支持了之前的报道，即自噬基因完全被敲除附件5或附件7在出生后的神经元中导致神经退行性表型(11,12). 我们的数据还扩展了先前的发现，表明另一个关键自噬蛋白的病理相关减少足以导致模拟AD的神经变性。应用程序+贝肯1+/–小鼠突触-树突状变性加重，内嗅皮质第二层测得的神经元数量显著减少。这些数据与以前的报告一致，即AD中突触变性先于神经元的粗大丢失(40,41).
总之，我们在AD小鼠模型中确定了beclin 1和自噬是神经退行性变和Aβ积聚的重要调节剂。我们还发现beclin 1在AD早期受累脑区显著降低。由于beclin 1的过度表达可以降低小鼠的Aβ病理学，因此恢复beclin-1和自噬可能是治疗AD的新方法。
方法
老鼠。
APP转基因小鼠J20（PDGF-hAPP695751770V171F，KM670/671NL)和T41（mThy-1-hAPP751V171I，KM670/671NL)已在前面描述过(29,30).贝肯1+/–老鼠(17)与杂合T41转基因小鼠或杂合CAG-GFP-LC3转基因小鼠杂交(31). 所有品系均保持在C57BL/6遗传背景上。用400 mg/kg水合氯醛（Sigma-Aldrich）麻醉小鼠，并用0.9%生理盐水经心灌注。解剖大脑，将1个半脑在4%多聚甲醛中固定24小时，并在30%蔗糖中冷冻。用冷冻切片机（Leica）切取连续冠状切片（30μm），并保存在低温保护介质中。另一个半脑被解剖成海马体、新皮质和大脑的其余部分；称重组织，并立即在-80°C下冷冻。所有动物程序都是在斯坦福大学和帕洛阿尔托VA医学中心动物护理和使用委员会的批准下进行的。
免疫组织化学和免疫印迹抗体。
使用了以下抗体：3D6（1μg/ml；Elan Pharmaceuticals），人Aβ特异性生物素化小鼠单克隆抗体1–5，使用EZ-link NHS生物素进行生物素化（皮尔斯生物技术）；4G8（稀释1:500；Senetek），人Aβ特异性小鼠单克隆抗体17–24; 8E5（Elan Pharmaceuticals），人APP的小鼠单克隆抗体444–592; beclin（1:1000稀释，克隆20；BD Biosciences），鼠IgG2a单克隆人beclin 1特异性171–291（与小鼠和大鼠beclin 1交叉反应）；LC3（稀释比例1:1000；Ab2389，斯坦福大学R.Kopito慷慨提供），对人类LC3B N末端特异的兔多克隆；APP-CTF（稀释比例为1:1000；由美国佛罗里达州杰克逊维尔梅奥诊所T.Golde慷慨提供），人类APP C末端特异性兔多克隆；肌动蛋白（A-5060；Sigma-Aldrich），兔肌动蛋白特异性多克隆；α-微管蛋白（1:2000稀释；Invitrogen），牛α-微管蛋白的小鼠单克隆抗体；MAP-2（Chemicon），MAP-2的小鼠单克隆抗体；突触素（Chemicon），突触素特异的小鼠单克隆；CD68（稀释1:50，FA-11；Serotec）；对小鼠CD68特异性的大鼠多克隆；Iba-1（稀释1:2500；Wako Bioproducts），兔抗-Iba-1；NSE（稀释1:200；Labvision），人类NSE特异的小鼠单克隆。
蛋白质分析。
用1×放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液和70%甲酸连续提取蛋白质。如前所述进行蛋白质印迹(60). 多次曝光以选择胶片动态范围内密度的图像。显影后，在600 dpi下扫描胶片，并使用Metamorph软件（6.1版；分子器件）量化带强度。如图所示，将感兴趣的条带标准化为相应的肌动蛋白、NSE或α-微管蛋白条带。对于人类和小鼠数据，大多数样本各运行3次，并确定每个样本的平均值，以减少实验误差。在每个凝胶上运行多个对照样品，使其在斑点上正常化。
组织化学和免疫组织化学。
在所有实验中，研究人员对小鼠的基因型都是盲的。通过海马体和额叶皮层以360-μm的间隔进行冠状切片（30μm）(n个=每个区域3–6个），使用标准免疫组织化学技术进行染色。使用Metamorph软件在Olympus IX71显微镜上放大×4或×10倍分析Aβ和CD68免疫反应性，并计算每只小鼠的平均免疫反应面积百分比。MAP-2和突触素分别是突触和树突状损伤的可靠指标，此前已证明在神经退行性变小鼠模型和AD患者中与认知功能丧失密切相关(41,46,61,62); 它们的相对丰度如前所述进行了测量(46,63). 简言之，用MAP-2或突触素一级抗体对切片进行免疫染色，然后用二级FITC-标记的抗鼠IgG，并用激光扫描共聚焦显微镜（BioRad）进行分析。然后使用NIH图像版本1.63对数字化图像进行分析(http://rsb.info.nih.gov/nih-image/)确定MAP-2免疫反应树突或突触素免疫反应突触前终末所占神经膜的百分比面积。为了进行钙结合蛋白定量，使用安装在蔡司显微镜上的摄像机以最终放大倍数×30获得免疫染色切片的数字化图像，然后使用Image ProPlus软件（4.5.1版；媒体控制论）进行分析。对于每个鼠标，选择3个部分，并从每个部分分析3个1024×1024像素的随机字段。阳性细胞的总密度取平均值，并表示为标准化、校正OD。对于4G8，切片在培养前在88%甲酸中预处理。按照钙结合蛋白使用的方案分析细胞内或细胞外免疫反应区域。为了评估APP小鼠中β-折叠淀粉样蛋白沉积的水平，如前所述用硫黄素S染色大脑切片(64). 简单地说，在超霜载玻片上对每只小鼠的5-6个切片进行空气干燥，用1%的硫黄素S水溶液染色8分钟，并用几次乙醇和水冲洗显影。如Aβ和CD68所述，使用荧光显微镜和Metamorph软件定量硫黄素S荧光沉积物的面积。
刻板印象。
为了进行体视学分析，如前所述，用光学解剖仪分析切片(65). 简单地说，用甲酚紫对穿过内嗅皮层第二层的3个随机间隔的冠状切片（30μm）进行染色，并计算46.3×31.5×6μm解剖器中的细胞核数。每只小鼠的45个解剖器中至少有100个细胞核被计数。从每个基因型中随机选择3只小鼠，并对每只小鼠的3组计数进行平均。平均结果显示为每毫米的总数三.
AβELISA。
ELISA如前所述执行(60)使用抗体266（5μg/ml，Aβ13–28; Elan Pharmaceuticals）作为总Aβ或抗体21F12（5μg/ml，Aβ）的捕获抗体37–42; Elan Pharmaceuticals）作为Aβ的捕获抗体x–42和生物素化3D6（2μg/ml，Aβ1–5; Elan Pharmaceuticals）作为检测抗体。在与第二抗体孵育后，将样品与抗生物素-HRP（稀释1:4000；Vector Laboratories）孵育，并使用1步Turbo TMB ELISA溶液（Pierce Biotechnology）产生信号。
神经元自噬试验。
如前所述制备分离的海马神经元(66)从1日龄开始GFP-LC3型+贝肯1+/–和GFP-LC3型+贝肯1+/+老鼠(17)并在神经基础A培养基（Invitrogen）中培养。培养10天后，用4%多聚甲醛固定神经元，用Axioplan Zeiss显微镜和×100 Plan Neofluar物镜观察GFP-LC3染色。对于每种基因型3只小鼠，每只小鼠每只小鼠50个神经元的GFP-LC3点状点的数量被测定。
电子显微镜。
如前所述进行电子显微镜检查(67). 简单地说，在4°C下，将灌注的大脑固定在2%戊二醛和2%多聚甲醛的0.15二羧酸缓冲液中24小时。固定后，将大脑按矢状方向分割，从右侧大脑额叶皮层和海马区取0.2×0.2cm的块体进行加工并植入epon。用Reichert Ultracut-E超薄切片机（Leica）对环氧树脂包埋的块体进行切片，放置在200米厚的铜网格上，并在饱和乙醇/乙酸铀酰和亚硝酸铋中染色。用蔡司EM10电子显微镜分析切片（80 nm厚）。
Beclin 1慢病毒。
表达小鼠beclin 1或GFP（8.8×10）的慢病毒9转换单位/ml）如前所述生成(68). 在6个月大时，将病毒注射（2μl）到每只小鼠的额叶皮层和海马。将表达慢病毒的小鼠beclin 1注射到右半球，将表达GFP的慢病毒注射到左半球作为内部对照。8周后处死小鼠并进行免疫组织化学分析。
统计。
数据以平均值±SEM表示。各组之间的差异通过ANOVA（有或没有Tukey-Kramer事后检验或Dunnett检验）或未配对学生的t吨测试，如图和表图例所示。一P（P）值小于0.05被认为是显著的。
致谢
我们感谢加州大学圣地亚哥分校的Shiley-Marcos阿尔茨海默病研究中心、加州大学欧文分校的脑老化和痴呆组织库研究所以及斯坦福大学的斯坦福脑库提供人类脑组织；N.Mizushima（东京都医学科学研究所，日本东京），用于提供GFP-LC3小鼠；以及M.Buckwalter和J.Luo（斯坦福大学）对这份手稿进行了评论。这项工作得到了NIH拨款AG20603（给T.Wyss-Coray）、CA84254（给B.Levine）和AG5131、AG18440、AG22074、AG10435和AG02270（给E.Masliah）的支持；美国癌症协会拨款RSG-98-339（给B.Levine）；约翰·道格拉斯法国阿尔茨海默病基金会（致T.Wyss Coray和F.Pickford）；以及退伍军人管理局老年医学研究、教育和临床中心（GRECC；T.Wyss-Coray）。
脚注
使用的非标准缩写：Aβ，淀粉样β；阿尔茨海默病；淀粉样前体蛋白；HD、亨廷顿病；Iba-1，游离钙结合相关蛋白-1；微管相关蛋白1轻链3；微管相关蛋白2；MCI，轻度认知障碍；NSE，神经元特异性烯醇化酶。
利益冲突：提交人声明，不存在利益冲突。
本文引文： 临床杂志。投资。 118:2190–2199 (2008). doi:10.1172/JCI33585
参见第页开头的相关评论2015.
工具书类
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