在化学定义的培养基条件下，人胚胎干细胞向区域特异性神经前体细胞的分化

摘要

介绍

人类胚胎干细胞（hESC）是一种可以繁殖的多能干细胞在体外在很长一段时间内，它代表了理论上取之不尽用之不竭的前体细胞来源，这些前体细胞可以分化成任何类型的细胞来研究人类的发展或治疗使人衰弱的疾病[1]–[3]因此，从人胚胎干细胞衍生神经祖细胞有望研究人类神经发生，研究中枢神经系统（CNS）的发育，并有可能应用细胞治疗帕金森病或脊髓损伤[4].

目前，人胚胎干细胞向神经谱系分化有几个问题。例如，目前用于诱导人胚胎干细胞神经转化的方案包括基质细胞系（PA6或MS5）、Matrigel或条件培养基的存在，包括涉及胚状体形成的多步骤程序[3],[5]–[13]这可能导致病原体交叉转移或与非神经细胞的污染，从而限制分化方案的效率和特异性以及分化hESC的未来医学应用。由于存在中胚层或内胚层来源的细胞，与EB的协议产生了一小部分神经谱系细胞。由于这些原因，已经开始努力为人类胚胎干细胞的生长和神经分化开发无饲料条件。信号调节器（bFGF、Wnt、Noggin和BMP）的操作促进了hESC向神经谱系分化的无馈条件的发展[6],[11]–[15].

因此，在无饲养和无动物的条件下控制神经祖细胞的生成，避免EB的形成，是在再生医学中进一步应用这些细胞的理想方法。

在这里，我们报告了人胚胎干细胞向非常明确的神经谱系的有效分化，应用了一种非常简单的方法在体外该协议包括使用细胞外基质（ECM）的无动物成分和化学定义的培养基。此外，该方案通过将玫瑰花结暴露于不同的信号因子，允许向区域特定类型的神经元细胞进行受控分化。

方法

结果

化学定义培养基中人胚胎干细胞在细胞外基质上的控制分化

未分化的hESC（H1和H9系）保存在人包皮成纤维细胞上。为了控制分化，将来自圆顶菌落的片段在D0处传代至先前在化学定义的培养基中用PBS中的人IV型胶原、纤连蛋白、玻璃体凝集素涂布的板。路德维希（Ludwig）及其合作者之前描述的一项修改后的协议[16]应用化学定义的hESC培养基。24小时后，细胞附着并显示出典型的hESC形态。D2时，神经分化的第一个迹象是典型的神经上皮结构或玫瑰花结(图1B和图1C)在D5-D7，细胞被组织成具有管腔的神经管状玫瑰花结(图1C). D7的免疫细胞化学分析显示，玫瑰花结中的柱状细胞对PAX6（未显示数据）。所有阶段（D2–D7）的细胞都表达Nestin，这是一种常见的神经前体标记物（未显示）。然后在D7处将培养基更换为GRM培养基（参见方法)再补充碱性成纤维细胞生长因子（GRM/bFGF）7天（见图1A). 2天后，玫瑰花结开始迅速扩张。为了评估在我们的方案中获得的细胞的神经分化潜能，在GRM/bFGF培养基中，机械切割玫瑰花结并将其镀在鸟氨酸/人层粘连蛋白涂层的室载玻片上。玫瑰花结集落在基质上迅速扩张，早期采用纺锤状形态，使人想起放射状胶质细胞[12],[17]在D14，这些细胞中的绝大多数是Nestin⁺（89±2%），RC2⁺（99±1%），Pax6⁺（87±3%）和BLBP⁺(95±2%) (图S1E). 一天后，Tuj1⁺神经元开始伸长(图S1A)在进一步分化过程中其数量增加(图S2E). D28时，细胞的以下神经外胚层标记物呈阳性：Nestin（数据未显示）、Musashi-1(图2B)，A2B5型(图2C)和MAP2(图2D). D14-D21期间的免疫细胞化学分析显示，这些细胞为Tuj1⁺（占细胞总数的20%；图2A)在D42达到总细胞的62%（61.8±3.1%；n=4），其中46%（45.7±2.7%；n=3）(图3E)是GABA⁺(图3F)，43%（42.8±2.4%；n=4）谷氨酸⁺(图3D)和7%（7.2±1.2%；n=4）5-羟色胺⁺单元格(图3C). 在此阶段，14%的细胞对星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白（GFAP）呈免疫反应(图3A)23%为早期少突胶质细胞O4标记物(图3B). 在长期维持期间，神经元的百分比随着胶质细胞百分比的增加而逐渐减少(图S2).

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图1

人胚胎干细胞向神经祖细胞的分化。

（A） 无饲料和化学定义介质条件下不同步骤的示意图（见材料和方法）。（B和C）在粘附的无动物基质和改良的TESR1培养基中培养两天后，细胞被组织成玫瑰花结（用黑色箭头表示，也用插入物B和C表示）。（D–F）RT-PCR分析表明，通过分化方案的三个步骤，多能性和神经标志物的基因表达发生了变化：（D）少突胶质细胞和星形胶质细胞的表达谱；（E） 主要多能性标记和一般神经标记的基因表达变化。（F） 一些内胚层、中胚层、表皮和滋养层标志物的半定量RT-PCR。棒材：（B）100µm；（C） 200微米。

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图2

D28时hESC衍生神经元前体的免疫细胞化学特征。

这些细胞对神经前体标记物呈阳性，如（A）Tuj1（绿色）、（B）武藏（红色）、（C）A2B5（绿色）和（D）MAP2（红色与Tuj1共表达）。蓝色表示DAPI。棒材：（A–C）50µm；（D） 25微米。

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图3

人胚胎干细胞衍生的神经祖细胞产生（A）星形胶质细胞（GFAP红色）和（B）少突胶质细胞（O4，绿色）。

细胞是血清素⁺（C；红色与Tuj1共存），谷氨酸⁺（D；红色，与Tuj1共存）和GABA⁺（F；红色，与Tuj1共存）。蓝色表示DAPI。GFAP公司⁺和O4⁺细胞在D56染色。棒材：（A、B、D）25µm；（C、F）50µm。（E） 数据取平均值，表示为平均值±S。E.M.公司。

RT-PCR分析揭示了ES、D7和D42期常见hESC和神经标记物的表达变化。具体来说，多能性标记的逐渐强烈下调华侨城4号和REX1型观察到，伴随着人类神经元标记物的上调PAX6,SOX1标准,NCAM公司和地图2(图1E). 早期的下调(SOX10）晚期前体标记上调血小板衍生生长因子-R [9],[18]和PLP公司显示成熟少突胶质细胞的存在(图1D). 的级别GFAP公司和S100β星形胶质细胞谱系的标记物也增强，这与免疫染色结果相关。然而，半定量RT-PCR分析显示，在D42，内胚层的表达(α-胎蛋白、α1-抗胰蛋白酶、HNF-3α)，中胚层(混合，短切和KALLIKREIN），表皮(角蛋白5、角蛋白14、高硫角蛋白）和滋养层（HCG）被完全压制了(图1F). 只有中胚层标记物GATA2上调，但先前的研究表明，该标记物也在神经系统中早期大量表达[19]为我们细胞的神经形态提供了更多证据。

成熟神经元群体的位置一致性和规格

为了明确所获得的神经元群体类型，我们首先使用RT-PCR方法测定了头-尾中枢神经系统标记物的表达。几乎所有的嘴-尾同源性基因最初都在D7表达。有趣的是，在D42，细胞表达腹面间脑标记物接收，端脑标记BF1型 [20],[21]以及后脑标记千兆字节2(图4E). 为了评估生成细胞的多巴胺能谱，我们分析了转录因子第2页 [22],[23],PTX3系列,LMX1b型 [24]–[27]参与多巴胺能分化发现它们上调。相反，我们观察到转录物的表达非常弱EN1公司，中脑细胞的特征[28]和NURR1号机组在中脑前体分化为多巴胺神经元中起作用[29]–[32]揭示了所生成细胞的可能前脑特征。最后，与成熟多巴胺能神经元表型相关的标记之一酪氨酸羟化酶（TH）也表达(图4E).

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图4

使用含或不含RA的方案获得的细胞的神经规范。

人胚胎干细胞衍生的神经祖细胞表现出嘴侧表型：（A）细胞为Gbx2⁺（红色，与Tuj1）和（B）OTX2共压制⁺（红色，与Tuj1共存）。（C） 几乎所有GABA⁺单元格（红色）为TH⁺（绿色）。（D） 口腔标志物阳性细胞的百分比。（E） RT-PCR分析伴或不伴RA的人胚胎干细胞源性神经祖细胞的吻侧标记物。（F和G）脊髓标志物的RT-PCR分析。经RA治疗的人胚胎干细胞衍生神经祖细胞显示脊髓表型；（H） 几乎所有的HB9细胞（红色）都是胆碱能细胞（绿色）。（一） 细胞主要是HB9⁺（红色）和Tuj1⁺（绿色）正极。（J） HB9的百分比⁺，聊天⁺和HOXC8⁺细胞。（K） 电池也是HOXC8⁺（绿色）。蓝色表示DAPI。棒材：（A）50µm；（B、C、H、I、K）100µm。（D，J）数据取平均值，表示为平均值±S。E.M.公司。

免疫细胞化学分析显示了这些神经元多巴胺能表型的进一步证据。所有Tuj1⁺祖先也是GABA⁺(图3D)（46%；45.7±2.7%；n=3）和GBX2标准 ⁺(图4A和4D)（79%；79.2±6.5%；n=5），但运动神经元祖细胞为阴性(HB9型⁻,林⁻,数据未显示）。GABA的大多数⁺细胞（93%）共表达TH(图4C). Tuj1的总人口⁺这些细胞含有2%的多巴胺阳性细胞（数据未显示），表明这些神经元具有不成熟的多巴胺能表型。RT-PCR分析未显示感觉神经元特异性标记的表达(图S3). 然而，TH⁺细胞阳性OTX2型(图4B)（Tuj1的85%⁺细胞；85.4±3.6%; n=5），前脑细胞表达的转录因子[20]，暗示了前脑的身份在体外-生成神经上皮细胞。

为了确定神经祖细胞是否具有严格的嘴侧特征，我们接下来检查了尾侧标志物的表达(图4F和4G)例如I类(IRX3、PAX6、PAX7）和II级(OLIG2公司,NKX2.2型,NKX6.1标准)，同源球蛋白对运动神经元分化很重要[33],[34]发现它们在D7和D42高度表达。此外，我们观察到一些涉及神经群体背腹侧同一性的基因共表达。神经细胞表达同源结构域蛋白HOXC8型和HOXC5型，标记物在胸部区域表达，以及脊髓标记物的弱表达HOXB1型和HOXB6型(图4G). 这种神经的轮廓HOXC公司表达表明脊髓细胞具有头颈部特征[35]这表明我们的方案，使用bFGF（D7–D14），有效地支持向吻侧细胞的分化，以及尾侧标记物的激活，但不支持类似于神经管最腹面区域的细胞的生成。

我们试图通过在D7-D14期间将细胞暴露于RA（一种众所周知的尾状化信号）来改变神经元祖细胞的吻-尾身份(图1A). 在D28，我们观察到与bFGF方案相比，神经祖细胞的表达谱相同（数据未显示）。由于RA治疗完全抑制或显著下调了头端标记物，神经祖细胞获得了脊柱位置的认同RX、BF1、GBX2以及中脑多巴胺能标记物PTX3系列,第2页,NURR1、LMX1B、，和真实航向(图4E和4F). 成绩单EN1公司已完全表达（而EN2公司被下调）。相反，尾侧标记物被强烈上调或保持不变。重要的是，暴露于RA后IRX3系列被压制奥利2上调，表明RA对背室神经元特性有影响在体外有趣的是，所有这些因素的协调表达促进了HB9型运动神经元的常见标记。D42的免疫细胞学分析表明Tuj1⁺细胞中含有87%的HB9⁺细胞（87.3±4.1%；n=4；图4E和4J)，74%聊天⁺（74.5±3.3%；n=4；图5H与HB9共表达）和76%的HoxC8⁺细胞（76.3±4.4%；n=4；图4K). 这些结果表明，在化学定义的条件下最初分化为前脑样神经细胞的人胚胎干细胞，在暴露于RA后可以尾化为运动神经元。

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图5

bFGF和RA治疗新生神经元的神经元兴奋性和电压依赖性通道的研究。

（A） 去极化电流阶跃（40 pA）在两个不同神经元中诱发的动作电位导致不同的放电模式。在这两种情况下，用1µM TTX（红色）完全阻断尖峰。（B） 在10 mV升压协议中，从–30 mV到+50 mV从V获得的电压相关电流系列_小时 = −70 mV。早期内向电流表明存在电压依赖性钠通道，而第二向外分量与电压依赖性K的存在一致⁺通道，如I-V关系所示。（C） 阻断TTX敏感电压依赖性钠⁺频道。用1µM TTX（红色痕迹）（n=39）完全阻断（B）中的早期成分。（D） 外向电流被2 mM 4-AP（红色迹线）阻断（n=10）。

成熟神经元前体衍生神经元的功能特性

通过膜片钳分析在培养的D28至D42评估这些分化的神经元前体在吻侧（+bFGF）或尾侧化（+RA）信号下的功能特征。对神经元进行视觉评分的细胞进行常规标准的斑贴灯记录。为了测试细胞激发动作电位的能力，从-70 mV的保持电位向细胞注入20-100 pA去极化电流图5A在D42，79%（n=117）的受试细胞在GRM/bFGF中诱发至少一个过冲动作电位，而9%的细胞出现重复放电。有趣的是，100%（n=57）的细胞在GRM/RA中激发了动作电位，其中18%的细胞表现出多个棘波。Na人⁺将1µM的通道阻滞剂TTX施加到镀液中，可逆地阻断了动作电位(图5A).

电压门控钠的存在⁺-和K⁺-研究了电压灯配置下的信道。在存在细胞内钾的情况下⁺，在20 ms电压步进脉冲（从−30到+50 mV，从V步进10 mV）后，早期快速瞬态内向电流随后是持续外向电流分量_小时 = −70毫伏(图5B). 对于内向和外向电流分量获得的电流-电压关系是Na的特征⁺和K⁺电流。通过分别研究这些成分并用特异性拮抗剂阻断它们，这一发现得到了进一步的支持。对于Na⁺电流，从V到−10 mV的去极化步骤_小时导致流入电流被TTX完全阻断(图5C). 对于K⁺电流，V在+60 mV时诱发的外向分量_小时2 mM 4-AP部分阻断（～70%）(图5D)和～85%，外加10 mM四乙基铵（TEA）（数据未显示）。

然后，我们测试了培养物中神经元的神经递质对GABA、谷氨酸、多巴胺和乙酰胆碱的敏感性。如所示图6B当在GRM/bFGF分化的细胞中应用100µM GABA时，大多数受试细胞（77）诱发的全细胞电流为1267±115 pA（n=53），类似比例的GABA能神经元（81%）导致GRM/RA条件，870±144 pA（n=40）。这些电流被特异性GABAA受体阻滞剂荷包牡丹碱完全阻断(图6B). 对于这两种暴露因子，谷氨酸100µM在～60%的受试细胞中诱发小内向电流（55±6 pA）(图6A)被100µM CNQX阻断，但未被APV阻断，因此证明了非NMDA受体对此电流的贡献。

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图6

神经递质敏感性。

（A） 通过同时应用拮抗剂CNQX（n=11）对100µM谷氨酸（Glu）的反应和阻断电流。水平条指示激动剂（红线）和/或拮抗剂（蓝线）或调节剂（绿线）应用的持续时间。（B） ：细胞对100µM GABA的反应和用特定GABA阻断电流_A类受体拮抗剂荷包牡丹碱（Bic）（n=25）。（C） ：通过向细胞（n=8）施加1 mM代谢性神经递质多巴胺（DA）两分钟，bFGF处理的细胞中Glu电流可逆下调。（D） ：RA处理的细胞对100µM乙酰胆碱（Ach）的反应（n=8）。用100µM（−）管箭毒碱（Cur）（n=6）完全阻断电流。

为了评估多巴胺对这些神经元的电流调节，我们分析了多巴胺对谷氨酸受体的不同影响。据报道哺乳动物新纹状体[35]在GRM/bFGF培养基中，1 mM多巴胺可逆性下调约47%的谷氨酸诱发电流(图6C). 有趣的是，在GRM/RA条件下，约40%的受试细胞产生对乙酰胆碱（Ach）敏感的55±13 pA内向电流。这些电流被特定阻断剂（−）筒箭毒碱完全阻断，图6D).

讨论

我们已经证明，使用无饲料和化学定义的条件，可以一步高效地生成神经祖细胞，但不会形成EB。hESC暴露于不同的人类ECM底物导致产生高度富集的神经前体细胞，而不存在具有中胚层或内胚层特征的其他细胞。我们还证明，通过将神经外胚层细胞暴露于不同外源性因素的组合中，可以诱导神经前体细胞的背侧和腹侧CNS分化。

我们的受控协议与许多不同的协议相比具有某些优势[1],[4],[7],[8],[11]–[13],[36],[37]已经存在描述神经祖细胞生成的方法。这些方案大多基于人胚胎干细胞自发分化为多种细胞类型的混合物[5],[36]或产生涉及细胞聚集或EB形成的神经祖细胞。我们的方法包括hESC在化学定义的培养基和粘附底物中的初始分化，从而导致形态学改变，包括之前被确定为典型神经祖细胞的玫瑰花结和神经管状结构[3],[13],[36]玫瑰花结表达多种早期神经细胞标记物的数据SOX1标准,PAX6和巢蛋白并有效地分化为神经元和胶质细胞，这表明在我们的方案中获得的神经玫瑰花结细胞是多潜能神经祖细胞，与通过EB等方法获得的神经祖细胞具有相似的特性[36]同时，我们发现多能性标志物的表达随着早期神经标志物表达的开始而逐渐减少。电镀后，玫瑰花结衍生的祖细胞产生高度富集的双极细胞，表达TUJ1公司,穆萨西,内斯廷,A2B5型、和地图2hESC衍生神经祖细胞中典型的标记物[14]神经祖细胞的产量与以前公布的方案相同甚至更高，其中使用了化学定义的培养基和粘附条件[11]–[13],[38]然而，这些研究并没有证明向具有更特定区域神经元表型的细胞分化。根据我们的方案获得的神经祖细胞代表三种主要的神经谱系：神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，与之前描述的方法类似[5],[9],[15]使用相同条件的细胞长期生长增加了神经元的百分比。甚至可以观察到从神经元到胶质细胞命运的逐渐转变。D42时少突胶质细胞的百分比为23%，这与EBs方案中观察到的效率相似[11],[15]我们发现，神经元祖细胞亚型会导致分化神经元产生超调动作电位，以响应去极化电流的注入。电压门控通道的进一步表征揭示了钠的存在⁺-和K⁺-通道作为分化的生理标志。此外，K⁺-4-AP部分阻断的电流既出现在未成熟神经元中，也出现在成熟神经元中，但TEA对阻断的敏感性先前已在发育中的神经元中发现[39]此外，大多数神经元样细胞对γ-氨基丁酸（GABA）有反应，对谷氨酸（谷氨酸）的反应较小，而谷氨酸以前曾在发育中和成年动物的新生神经元中报道过[40]–[42]。我们进一步描述了在我们的方案中获得的神经元的位置规范，证明这些细胞可被控制分化为特定类别的CNS神经元。以前的几项研究表明，可以使用不同的方法（主要是使用EB或共培养）从ESC生成特定的神经元[1],[4],[7],[8],[13],[36],[37]并使用不同浓度的可溶性生长因子[36],[43]我们方案中的成熟神经元大多具有吻侧特征，这与先前的共培养研究相一致，研究表明大多数神经元产生的吻侧神经标记物表达[44],[45]与这些研究相比，我们的方案仅在获得前脑多巴胺能神经元方面效率更高。在中枢神经系统发育过程中，无论其最终位置如何，神经板细胞最初都具有吻侧特征[45]成熟神经祖细胞弱表达端脑标记，但强表达BF1型,EN2公司和OTX2型但不是EN1公司揭示了他们的前脑特征。EBs方案中产生的神经上皮细胞，使用含有bFGF的化学定义培养基，也显示前脑特征[36],[43].我们的结果与以前的研究相一致[46],[47]在无血清和EBs样条件下获得的原始神经上皮细胞仅用bFGF处理后显示出嘴侧表型。例如，Watanabe等人。[48]利用EBs形成技术，从小鼠ESC中产生具有吻侧表型的端脑前体，但这些神经元的百分比远低于我们的研究。

几个因素可以刺激多巴胺能神经元的发育。Nurr1、Lmx1b和Ptx3转录因子是中脑特异性的，而信使分子SHH和FGF8似乎促进多巴胺能表型，而与大脑区域无关[49]–[51]我们的结果清楚地表明，当我们仅将神经外胚层细胞暴露于bFGF时，主要多巴胺能标志物在D42处强烈上调。电生理记录证实了获得细胞的多巴胺能性质。事实上，在我们的方案中，多巴胺能神经元揭示了DA对谷氨酸受体的调节作用，正如之前在哺乳动物新纹状体中所显示的那样[52]据报道，非人类灵长类ESC与小鼠骨髓间充质PA6细胞（SDIA）共同培养可导致TH⁺中脑神经元细胞系表达NURR1号机组和LMX1B型基因[8],[44],[53]Perrier和合作者[54]表明人胚胎干细胞也能分化为多巴胺Pax2（帕克斯） ⁺神经元与小鼠骨髓间充质细胞共同培养时，这与我们的无喂养方案类似。bFGF在神经命运决定中的作用可以通过参与脊髓分化的一些Hox基因的表达来解释。研究表明，作为对FGF信号的反应，预期尾神经板的细胞最初被指定为头端后脑细胞或Hoxb4细胞⁺/b8号机组⁺/c9号机组⁺典型的尾/胸/脊髓区细胞[55]缺乏感觉和成熟的多巴胺神经元表明，进一步应用更特异的诱导因子（例如FGF8和SHH）可以改善hESC向中脑多巴胺能神经元的定向分化。

我们已经研究了使用细胞外诱导信号（更具体地说是RA）是否可以有效地将人胚胎干细胞分化为特定类别的中枢神经系统神经元。众所周知，RA和FGF在后脑和脊髓祖细胞的口-尾叶区域身份确定过程中发挥相反的作用[56]GRM/RA方案产生了口侧转录因子的下调，特别是与多巴胺能表型相关的基因的下调，以及类似于胚胎神经管的口侧轴中RA的正常模式的尾侧基因的上调。在体节早期阶段，由近轴中胚层和新形成的体节提供的RA促进了具有脊髓头端水平特征的Hox基因的表达[56]–[58]同样，暴露于RA的玫瑰花结细胞获得了这种脊髓位置表型，如所有观察到的尾侧基因的表达谱所示。RA的腹侧化作用也通过上调OLIG2公司表达，可能以牺牲IRX3系列与之前的研究结果一致OLIG2公司抑制IRX3系列 [59]与前体同源结构域蛋白相互作用，从而激活运动神经元分化途径和HB9型基因。事实上，HB9和Chat的高表达以及胆碱能受体的功能性表达揭示了获得神经元的脊髓运动神经元表型。这表明，与基质细胞的分化方案相比，我们的分化方案是一个改进[60]或EB[36],[60],[61]使用了。以前的研究[62]证明溶血磷脂酸通过激活Rho/ROCK和PI3K/Akt通路抑制神经球的形成和来源于人胚胎干细胞的神经干细胞的分化。因此，需要进行进一步的研究，以最终解决区域特异性标记物、信号通路的表达，并确定是否可以使用人类胚胎干细胞和在体外定义的系统。

在这项研究中，我们表明，高浓缩的神经前体细胞，特别是神经元，可以在无饲料和化学定义的系统中从人胚胎干细胞有效地衍生出来。我们已经证明，RA治疗后，神经分化是可控的，尤其是当神经元获得不同的区域位置认同时。这里报告的结果提供了一个非常简单有效的协议，可以作为一个实验工具来研究人类神经发育中的特定因素和过程在体外条件。这对于发育生物学、疾病建模、药物开发和细胞移植的研究非常重要。

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