阐明肿瘤发生的分子机制对于人类癌症诊断和治疗的未来进展至关重要。抑癌基因失活是肿瘤发生和生长病因学中的一个重要步骤。大量的研究都集中在p53抑癌基因在癌症中的作用上1
2观察到p53突变是人类肿瘤中最常见的基因改变，这一观察结果强调了其关键地位。
p53在基因毒性应激后诱导生长停滞或凋亡中起关键作用三
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8缺乏p53的细胞能够在DNA受损的情况下增殖，因此能够积累多种潜在致癌突变9
10此外，p53控制细胞衰老的开始，这一过程限制了细胞可能分裂的次数，并可能作为一种抗肿瘤机制11克服p53功能可延长潜在寿命并直接促进细胞永生12
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在多种肿瘤中，p53功能失活，但基因保持完整15
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17在这些肿瘤中，p53调节器的活性可能会改变。因此，p53活性新调节因子的鉴定和表征可能对理解多种肿瘤类型的病因具有直接影响。
虽然炎症与肿瘤发展之间的关系在分子水平上仍不清楚，但最终肿瘤的形成与几种慢性炎症状态有关18
19肿瘤的发生是由致癌突变事件和细胞控制的丧失共同促成的，这些细胞控制在DNA损伤的情况下阻止细胞分裂，导致这些突变的固定和繁殖9在炎症部位，活化吞噬细胞释放活性氧与邻近细胞的遗传毒性损伤有关20
21然而，目前尚不清楚这些细胞如何绕过正常对照，以防止DNA受损的细胞增殖。
在这里，我们进行了两次功能筛选，以确定p53抑癌活性的负调控因子。我们从每个筛选中分离出巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）。1我们观察到，MIF是一种在炎症部位释放的促炎细胞因子，能够在功能上使p53失活，p53是一种通常用于阻止携带基因毒性损伤的细胞增殖的肿瘤抑制因子，这可能提供了炎症和癌症之间的机械联系。
材料和方法
tet-GFP-p53 p53的构建−/−小鼠胚胎成纤维细胞系。
第53页−/−小鼠胚胎成纤维细胞（MEF；来自马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院T.Jacks）依次感染pWZL-Blast-rtta，一种表达四环素诱导系统反向反式激活因子的速溶素选择性逆转录病毒载体22和pBabe-puro-tet-GFP-p53-sin，一种在四环素诱导启动子控制下表达GFP-p53融合蛋白的自激逆转录病毒。对细胞进行药物筛选，分离出一个克隆（TGP53-4），在向培养基中添加1μg/ml多西环素后，该克隆显示出明显的GFP-p53表达和细胞生长停滞。
重组MIF。
通过PCR将EcoRI和SalI位点立即导入人类MIF的开放阅读框5′和3′，并将该EcoRI-SalI片段克隆到pMal-C2（新英格兰生物实验室）的EcoRI-XhoI位点。在BL21中表达了麦芽糖结合蛋白（MBP）-MIF融合大肠杆菌细胞，通过直链淀粉色谱法亲和纯化，并使用因子Xa切割。通过直链淀粉色谱裂解后去除MBP。由于MBP在任何使用的分析中都没有影响，所以在切割后立即使用rMIF进行一些实验。
绕过p53诱导的生长抑制。
TGP53-4细胞感染pHygroMarx I衍生的含有MIF cDNA的前病毒或空载体对照。潮霉素筛选后，细胞以约5000个细胞/板的速度培养。加入1μg/ml多西环素诱导p53在适当的平板中表达。每3天更换一次培养基，必要时更换含有新鲜多西环素的培养基。10天后，细胞在1%戊二醛中固定，并用0.25%结晶紫染色。对于使用可溶性rMIF的实验，在有或无150 ng/ml rMIF添加到生长培养基中的情况下，将TGP53-4细胞以约10000个细胞/板的速度培养。24h后加入强力霉素诱导p53表达。每3天更换一次含有新鲜强力霉素和/或rMIF的培养基。9天后，细胞按上述方法固定和染色。
小鼠原代成纤维细胞寿命的延长。
从14天CD1小鼠胚胎制备MEFs，并重复传代。必要时，在第2代细胞中感染pMARXIV-p53αs、pWZLneo-MIF或对照病毒，并通过耐药性选择作为可选标记。在衰老开始前的一个传代（通常在传代4-5前后），在有或无rMIF的情况下，细胞在约300000个细胞/板处分裂和电镀。每3天更换一次新鲜组织培养基（适当时含有rMIF）。15–17天后，将细胞固定在1%戊二醛中，并用结晶紫染色。为了测定细胞浓度，将结晶紫重新溶解在10%乙酸中，并使用Bio-Rad 550微孔板阅读器分析595nm处的吸光度。
Rat-1/mycER细胞的凋亡。
Rat-1/mycER细胞被表达LacZ、MIF或Bcl2 cDNA的逆转录病毒感染。药物筛选后，将细胞以低密度放置在酸洗过的盖玻片上，并转移到含有0.1%胎牛血清（FBS）和0.1μM雌二醇的培养基中，以诱导细胞凋亡。24小时后，用4mg/ml Hoechst 33342将细胞染色10分钟，然后洗涤并通过荧光显微镜进行评分。含有浓缩或破碎DNA细胞的细胞被评为凋亡细胞。两名独立观察员对至少100个场/张幻灯片进行了分析。
RAW264.7巨噬细胞的凋亡。
用不同浓度的MIF预处理RAW264.7巨噬细胞24小时，然后用0.25–1.0 mM硝普钠（SNP）或0.5–1 mMS公司-亚硝基谷胱甘肽（GSNO）作用8小时至2天。含有浓缩或碎片DNA的细胞经多聚甲醛固定并用Hoechst 33258染色后，记为凋亡细胞。
荧光显微镜。
在存在或不存在150 ng/ml MIF的情况下，将TGP53-4细胞分裂到盖玻片上。24小时后，向培养基中添加1μg/ml多西环素。添加多西环素后16 h，在PBS中清洗细胞，并将其固定在2%多聚甲醛中，使用标准FITC过滤器组用蔡司Axiophot荧光显微镜观察GFP-p53。
西部印记。
细胞在PBS中清洗，在PBS内收获，离心并溶解。将等量的总蛋白（30–300μg）进行热变性，在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，并用硝酸纤维素进行印迹。用识别p53（DO-1，FL-393；圣克鲁斯生物技术）、MDM2（SMP-14；圣克鲁兹生物技术），Bax（BaxΔp21；圣克鲁茨生物技术）或p21的抗体检测印迹23然后是辣根过氧化物酶结合的抗鼠抗体，并用增强化学发光法检测。
北方印记。
在诱导GFP-p53后，从TGP53-4细胞制备总RNA。在1%甲醛凝胶中分离10μg，并用Hybond-N印迹+膜。用与小鼠p21和cyclin G全长编码序列相对应的随机引物放射性标记探针探测斑点。使用Fuji FLA-200磷化/荧光成像仪定量放射性信号，并通过定量RNA凝胶中溴化乙锭染色核糖体RNA带的荧光将其归一化为加载RNA，或在膜上吸干后。
荧光素酶分析。
将TGP53-4细胞与PG13（携带萤火虫荧光素酶的质粒，受p53应答一致序列的三个串联拷贝控制）和pCDNA3-β-gal（携带β-半乳糖苷酶的质粒）共转染，后者受CMV启动子控制。转染后1天，将细胞分裂、合并，并以约500000个细胞/板的速度重新接种。将150 ng/ml rMIF添加到一半的平板中。第二天，向培养基中添加1μg/ml多西环素以诱导GFP-p53。在诱导后0和10 h，制备提取物，并使用Promega试剂盒检测荧光素酶和β-半乳糖苷酶活性。荧光素酶报告活性归一化为β-半乳糖苷酶表达水平。
结果
p53活性负调控因子筛选中分离的MIF。
为了确定p53活性的新调节器，我们进行了一项筛选，以确定在高水平表达时能够绕过p53介导的生长停滞的基因。p53基因−/−在四环素（多西环素）诱导启动子的控制下，MEF细胞系被工程化以表达GFP-p53融合蛋白(22; TGP53-4细胞株）。GFP-p53融合蛋白定位正常，能与靶基因相互作用(24; 和数据未显示）。在培养基中加入强力霉素后，p53融合蛋白被诱导，细胞生长受阻，无法形成集落。
我们在基于表型的筛查中使用TGP53-4细胞系来识别p53活性的负调控因子。这些细胞感染了Moloney鼠白血病病毒（MMLV）逆转录病毒载体pHygroMarx I中的A431表皮样癌衍生cDNA文库25.pHygroMarx I包含一个细菌复制来源、LTR之间的zeocin抗性标记和3′LTR中的loxP位点，在整合后进行复制，以便于整合到基因组后通过Cre介导的切除来恢复前病毒。LinX公司25将该文库瞬时转染嗜生性逆转录病毒产生细胞，3d后用上清液感染TGP53-4细胞。约4×106细胞被感染。为文库载体选择药物后，以不同稀释度分裂细胞，并向培养基中添加1μg/ml多西环素以诱导GFP-p53融合蛋白的表达。必要时，再次分裂细胞以提高菌落辨别能力。p53诱导不再抑制的细胞在强力霉素存在下产生菌落。这些克隆感染了pBabe-puro-Cre，这是一种以Moloney鼠白血病病毒为基础的病毒，它强烈表达Cre重组酶以清除前病毒。用Hirt提取法从阳性克隆中回收含有cDNA的前病毒。
从总共50个阳性菌落中回收了前病毒。核苷酸测序和数据库分析表明，从五个不同菌落中回收的cDNA编码相同的蛋白质，即人类MIF，这是一种细胞因子，先前已证明其具有局部和全身促炎活性26所有编码MIF的cDNA都是全长的，并且具有方向性。从三个恢复的cDNA中对完整的上游区域进行测序。两个基因在精确的5′末端存在差异，表明它们来自独立克隆。
在类似的基于表型的筛选中，也独立分离出cDNA编码的MIF，以确定大鼠成纤维细胞中myc依赖性凋亡的负调控因子。表达c-myc–雌激素受体融合蛋白（Rat-1/mycER）的Rat-1成纤维细胞被pHygroMarx II中致力于凋亡的Rat-1/mycER细胞制备的cDNA文库池感染。药物选择后，通过转移到低血清培养基（DMEM+0.1%FBS）加0.1μM雌二醇（以诱导c-myc活性）3天，然后在不含雌二醇的情况下进行2天的血清饥饿，诱导细胞凋亡。在含有10%FBS的培养基中恢复不受凋亡保护的细胞。恢复的细胞接受三个额外的凋亡诱导周期。通过Cre介导的基因组DNA系切除从抗凋亡细胞中回收前病毒27由于该筛查是在表达野生型p53的细胞系中进行的，myc驱动的凋亡在很大程度上依赖于p5328p53功能抑制剂有望从该筛查中恢复。
MIF治疗绕过p53介导的生长抑制。
为了证实MIF能够绕过p53介导的生长停滞，将含有MIF或对照前病毒的前病毒转导至TGP53-4细胞。添加多西环素诱导p53表达。在含有MIF表达细胞的平板上形成大量菌落，但在含有对照细胞的平板中形成的菌落很少或没有(A） ●●●●。
MIF治疗可克服p53诱导的生长停滞。（A） MIF的表达绕过p53诱导的生长停滞，并允许四环素诱导的GFP-p53细胞系中的集落形成。pH Mpv，基于HygroMarx I的原病毒；HMpv公司-MIF，HygroMarx I-based表达人类MIF的前病毒；DOX，1μg/ml强力霉素。（B） 在解理前（车道1）和解理后（车道2）重组产生MBP-MIF。考马斯蓝或赛普橙染色凝胶中未观察到污染带。（C） 添加150 ng/ml可溶性rMIF可绕过p53诱导的四环素诱导的GFP-p53细胞系生长停滞。
由于MIF最初被鉴定为一种细胞外细胞因子，我们测试了MIF蛋白作为重组蛋白添加到培养基中后是否可以克服p53介导的生长停滞。MIF蛋白作为MBP融合蛋白被产生，并被切割以从MBP中分离MIF(B） ●●●●。TGP53-4细胞在存在或不存在重组产生的MIF（rMIF）和强力霉素的情况下生长。在没有强力霉素或强力霉素和rMIF的情况下观察到菌落形成，但在强力霉素单独存在的情况下没有观察到。因此，当作为可溶性因子添加时，MIF能够绕过p53介导的生长停滞(C） ●●●●。
MIF治疗抑制p53依赖性转录激活。
p53可能通过改变其亚细胞定位、降低蛋白水平或抑制其作为转录激活物的功能而失活。由于GFP-p53可以在细胞中直接显示并显示正常的亚细胞定位，我们分析了p53在MIF存在下是否显示亚细胞定位改变。GFP-p53的亚细胞定位无明显差异；无论MIF治疗如何，p53均显示核定位(A） ●●●●。p53也可以通过改变蛋白质丰度来调节；然而，MIF治疗后p53蛋白水平没有降低(B） ●●●●。
MIF抑制p53的转录活性。（A） 存在或不存在MIF时GFP-p53的亚细胞定位。GFP-p53在每个病例中都显示正常的核定位。（B和C）在存在或不存在MIF的情况下，诱导GFP-p53后，GFP-p5蛋白、p21和cyclin G mRNA的水平。C中显示的数据是三个独立实验的平均值。（D） 在存在或不存在MIF的情况下，GFP-p53诱导前或诱导后10小时的GFP-p5和MDM2蛋白水平。（E） p53诱导后MIF存在或不存在时p53反应荧光素酶报告基因的表达。MIF治疗抑制报告基因表达。所示数据是四个独立实验的平均值。
p53主要通过其处理私有基因表达的能力发挥作用。因此，我们测试了MIF治疗是否会干扰这种活动。在p53诱导后，从存在或不存在MIF的TGP53-4细胞中制备RNA。两个p53转录靶点p21的丰度29
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31和细胞周期蛋白G32，通过Northern blot进行评估(B） ●●●●。MIF处理的细胞中p21和cyclin G的水平下降至对照水平的～50和40%(C） ●●●●。此外，p53依赖性MDM2的诱导，MDM2是另一个p53靶点，在反馈回路中起作用，负调节p53水平33
34MIF处理的细胞减少(D） ●●●●。
还分析了MIF处理对p53依赖性报告基因活性的影响。用PG13-luc转染TGP53-4细胞，这是一种携带萤火虫荧光素酶的质粒，受p53应答一致序列串联拷贝的控制35，在存在和不存在MIF的情况下，并且在诱导GFP-p53后测定荧光素酶活性。rMIF抑制p53依赖性荧光素酶表达(E） ●●●●。综合考虑，这些数据表明MIF治疗通过抑制p53依赖性转录激活绕过p53介导的生长停滞。
MIF治疗抑制p53依赖性细胞凋亡。
除了能够诱导生长停滞外，p53还能够在易感细胞的细胞应激反应中诱导凋亡5
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8如上所述，我们在设计用于识别myc依赖性凋亡抑制剂的筛选中分离出一个cDNA编码的MIF，该过程主要依赖于p53。为了正式证实MIF表达可以抑制这种表型，Rat-1/mycER细胞被一种表达MIF的病毒和对照病毒感染，并通过血清饥饿和雌二醇处理诱导细胞凋亡。在这些条件下，表达MIF的细胞可以部分避免凋亡，尽管不如表达Bcl2的细胞有效(A） ●●●●。
MIF治疗克服了成纤维细胞和巨噬细胞中p53依赖性的凋亡。（A） Rat-1/mycER细胞的凋亡。将表达LacZ、MIF或Bcl2 cDNA的Rat-1/mycER细胞转移到含有0.1%FBS和0.1μM雌二醇的培养基中以诱导凋亡。24小时后，细胞用Hoechst 33342染色并评分。含有浓缩或破碎DNA细胞的细胞被评为凋亡细胞。（B） RAW264.7巨噬细胞用不同浓度的MIF预处理24小时，然后用250μM或1mM SNP处理。2天后对凋亡细胞核进行评分。（C）RAW264.7巨噬细胞用MIF预处理16 h，用SNP或GSNO处理8 h，并对凋亡细胞进行评分。1，0.5 mM SNP；2，1.0 mM SNP；3，0.5 mM GSNO；4，1.0 mM GSNO；5，不治疗。
由于MIF在体外和体内调节巨噬细胞的多种功能，我们还测试了MIF治疗是否能够抑制巨噬细胞的凋亡。激活后，巨噬细胞释放一氧化氮（NO），作为其抗菌储备的一部分。然而，高水平的NO反过来会导致巨噬细胞凋亡。例如，用诱导内源性NO生成的细胞因子或NO的化学释放剂处理RAW264.7巨噬细胞可诱导凋亡。凋亡与p53的诱导有关，并被反义p53结构的表达所抑制，表明NO诱导的巨噬细胞凋亡是p53依赖性的36
37为了测试MIF治疗是否能够抑制NO诱导的凋亡，我们在不同浓度的rMIF存在下用NO-释放剂、SNP或GSNO处理RAW264.7巨噬细胞。MIF治疗以剂量依赖的方式抑制NO诱导的细胞凋亡(和).
MIF治疗可延长原发性小鼠成纤维细胞的寿命。
p53也在控制细胞衰老的发生中起作用12
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14正常的原代小鼠成纤维细胞在培养中能够进行有限数量的分裂，并最终以衰老的形态停止生长11p53缺失使小鼠原代细胞延长其分裂潜能。因此，在集落形成试验中，缺乏p53的细胞能够在野生型细胞没有的传代中形成集落。因此，我们测试了MIF是否能够延长主要MEF的潜在寿命。在衰老开始前的一个传代（第4-5代），在有或无rMIF的情况下对初级MEF进行电镀。15天后，在经过MIF处理的平板上形成了许多菌落，而在没有MIF的情况下没有观察到任何菌落。这表明MIF治疗，就像p53的缺失一样，能够延长寿命(A） ●●●●。菌落形成频率为～10−4菌落/细胞（在相同条件下，表达反义或显性阴性p53的细胞观察到的菌落形成频率为2–3×10−4和1-3×10−3由p53制备的成纤维细胞−/−小鼠；Carnero，A.和D.Beach，未出版）。为了确定最适合克隆形成活性的MIF浓度，我们在0–600 ng/ml rMIF存在下重复了实验。寿命延长具有剂量依赖性，其中150 ng/ml的影响最为显著(B） ●●●●。
（A） 在200 ng/ml rMIF的存在下，主要MEF的使用寿命延长。衰老前一代细胞在MIF存在和不存在的情况下进行培养，15天后进行染色。（B） MIF治疗诱导延长寿命的剂量依赖性。原代细胞，如A中的细胞，在不同浓度的MIF存在下生长。17天后，细胞被结晶紫染色并清洗。对溶解的结晶紫进行测定，作为细胞密度的测量。
MIF的生物活性与其在延长原发性MEF寿命中抑制p53应答基因表达的能力相关。
由于MIF治疗并不能完全否定p53介导的基因表达，我们试图测试MIF诱导p53相关生物活性的能力是否与p53介控基因表达的相对抑制相关。原代MEF感染了表达MIF的病毒，MIF是一种针对p53或第2代对照病毒的反义结构。在第5代中，对感染细胞进行耐药性筛选、培养，并将其置于重复的平板上。同时，在有无rMIF的情况下，对通道5中的MEF进行电镀。电镀后15天，每个重复板中的一个固定并用结晶紫染色(A） ●●●●。从另一个复制板中制备蛋白质提取物，以及p53和两个p53靶点p21和Bax的水平38，通过Western blot检测(B） ●●●●。在每种情况下，观察到的菌落数量与p53靶基因表达的相对抑制大致相关，这与抑制p53活性是MIF诱导的生物活性的主要原因的假设一致。
MIF生物活性与p53介导的靶基因表达抑制相关。表达MIF（vMIF）、一种针对p53（p53αs）的反义、控制载体（载体）或用rMIF处理的初级MEF在第5代中被镀上。电镀后15天，（A）固定细胞并用结晶紫染色，或（B）裂解细胞，并通过蛋白质印迹检测提取物中p53、Bax或p21的表达。
讨论
我们已经证明，MIF治疗能够在三种不同的生物检测中克服p53活性。分泌因子克服与细胞死亡和细胞对基因毒性应激反应相关的生长抑制途径的能力可能具有重要的生理作用。在炎症部位，MIF由T细胞和巨噬细胞释放26局部高浓度的MIF有助于T细胞活化并增强巨噬细胞的抗菌活性39
40激活后，巨噬细胞释放NO和其他氧自由基41然而，NO也能诱导巨噬细胞凋亡。由于MIF可以部分抵消p53反应并保护巨噬细胞免受NO诱导的凋亡，因此该因子通常可以保护巨噬细胞免受其用来杀死入侵生物体的破坏性机制的伤害。
炎症基因座的特征是相邻细胞的高细胞死亡率和代偿性增殖42同时，经常观察到p53的上调43
44通过MIF作用克服p53活性可能有助于限制损伤反应，从而限制宿主细胞的丢失，并允许组织修复的局部细胞增殖。炎症状态停止后，局部MIF水平降低，允许恢复正常损伤反应。
然而，MIF对p53功能的慢性旁路可能有助于肿瘤的发展。p53功能丧失是人类癌症中最常见的事件之一。缺乏p53功能的细胞具有更强的增殖潜能，并显示出更长的寿命。此外，缺乏功能性p53的细胞缺乏对染色体损伤的反应9
10在炎症过程中，活化吞噬细胞释放的高活性氧化剂与诱导邻近细胞DNA损伤有关20
21在MIF的慢性存在下，p53功能减弱的细胞可能在DNA损伤的情况下继续增殖，并最终积累多种致癌突变。
几种慢性炎症状态与最终的肿瘤形成密切相关18
19例如，溃疡性结肠炎或克罗恩病与肠癌的最终发展有关，而反流性食管炎或巴雷特综合征与食管癌的发展有关。血吸虫病感染易导致膀胱癌的发展，且长期幽门螺杆菌感染与胃癌的发展有关。在某些情况下幽门螺杆菌感染，感染剂的消融与炎症状态的逆转和相关肿瘤的消退相关。这表明，在该模型中，至少有一种致瘤事件需要持续存在炎症状态，并且是可逆的45MIF可以干扰p53功能的观察可能为深入了解某些慢性炎症条件导致个体肿瘤形成的机制提供了线索。
