Polycomb公司组基因雷28维持造血干细胞活性所必需的

外周血和脾细胞的血液学分析。

心脏穿刺取胚胎外周血，用血细胞仪进行计数。使用金属网制备脾细胞悬浮液。用May-Grünwald-Giemsa染色的涂片或细胞离心制剂对血细胞进行手动分类计数。

甲基纤维素含量测定。

为了检测髓系集落形成细胞（集落形成单位培养[CFU-Cs]），包括红系CFU（CFU-E、10 ng/ml小鼠干细胞因子（Genzyme）、10 ng/ml小鼠GM-CSF和10 ng/ml小鼠IL-3（BD-PharMinen），然后在35 mm培养皿中培养。在含有5%CO的加湿培养箱中37°C培养14天后，对菌落进行评分₂在空气中(32,33).

长期培养诱导细胞（LTC-IC）检测。

将胎肝细胞悬浮在含有10⁻⁶M新鲜溶解的氢化可的松半琥珀酸钠（Sigma-Aldrich），置于60 mm培养皿中的S17饲养层上。培养物在含5%CO的湿化培养箱中在33°C下培养₂每周通过半媒体交流进行广播和馈送。通过在EDTA中暴露0.25%胰蛋白酶溶液5分钟来恢复培养物。细胞清洗一次，并检测是否存在髓系CFU-Cs(33,34).

第12天CFU-脾脏（CFU-S₁₂)含量测定。

第12天CFU-脾脏（CFU-S₁₂)细胞悬浮液的含量按照最初的描述进行测定。将适当稀释的细胞注射到接受过9.0Gy单剂量照射的同种受体中¹³⁷Csγ射线源。12天后切除脾脏，固定在Telleyesniczky的溶液中，并对宏观表面菌落进行计数(32,35).

长期重组试验。

C57BL/6小鼠作为受体。胎肝细胞（4×10⁵)将其注射到受致命辐射的受体小鼠中，并监测其存活率。为了定量测量竞争性再生单位（CRU）试验细胞，从性交后14.5天（dpc）胎肝中制备，胎肝经EGFP基因标记。致死性辐射受体与试验细胞和10个⁵来自正常同源小鼠骨髓的竞争细胞。通过外周血分析，在移植后3个月评估每个受体HSC的重建情况。眶后窦穿刺取外周血。显示>1%EGFP的动物⁺-通过双色FACS测定移植后3个月的多谱系细胞^®用单克隆抗体对Gr-1、Mac-1、B220和CD3（BD-PharMinen）进行分析，被认为是试验HSC重新填充的阳性结果。通过限制稀释分析确定试验细胞中CRU的频率。最大似然法生成了一条最佳拟合线，使用标准统计方法通过插值获得37%负响应所需的测试细胞数量来确定CRU的频率(36,37).

对于连续骨髓移植，将含有预定数量CRU的EGFP标记胎肝细胞注射到受致命照射的第一受体小鼠体内。在初次移植后1个月进行二次移植，以估计初次受体中CRU的扩张。来自主要受者的越来越多的骨髓细胞与竞争骨髓细胞同时注射。显示两种EGFP的动物⁺-如上文所述，主要受者中出现的CRU被认为以>1%的频率重新填充淋巴和髓细胞。主要受试者CRU的扩张是通过受试者的CRU频率计算的，这是通过上述限制稀释分析估算的。

FACS公司^®分析。

胎肝和骨髓的单细胞悬浮液与针对小鼠细胞表面抗原的特异性单克隆抗体孵育：Mac-1、Gr-1、Ter-119、CD3、CD4、CD8、B220、Sca-1和c-kit（BD-PharMinen）。抗体直接与FITC或生物素偶联，后者与R-藻红蛋白-抗坏血酸结合。在FACSCalibur™（Becton Dickinson）上进行分析，通过PI（1μg/ml）染色和门控前向角和侧面散射光排除死亡细胞(25).

造血细胞亚群的制备。

解剖10–14周龄C57BL/6小鼠和14.5 dpc胚胎，获取骨髓和胎肝细胞。将这些细胞汇集在一起，用PBS洗涤两次，通过反复移液管制成单细胞悬浮液，并通过40μm尼龙网过滤。使用免疫磁珠去除对Gr-1、B220、CD4、CD8和Ter-119抗体反应的细胞。由此产生的林⁻用FITC-结合的抗Sca-1抗体对细胞进行染色。在FACSVantage™（Becton Dickinson）上进行细胞分选，以纯化Lin⁻Sca-1型⁺和林⁻Sca-1型⁻分数。

细胞周期分析。

用10μg/ml溴脱氧尿苷（BrdU）（Sigma-Aldrich）在37°C下脉冲标记细胞15分钟，收获细胞，用PBS洗涤，并固定在70%的冷乙醇中。用1 mg/ml核糖核酸酶在37°C下处理细胞20分钟。将细胞置于冰镇0.1 M盐酸中10分钟。将清洗后的细胞加热至95°C。试管悬浮在含有0.5%吐温20（PBST）的冰镇PBS中。用室温下含0.5%BSA的PBST中1:100稀释的抗BrdU抗体（BD PharMinen）对细胞进行染色30分钟。用PBST洗涤两次后，用含0.5%BSA的PBST中将0.4 ml FITC-结合山羊抗鼠IgG抗体（BD-PharMinen）稀释为1:100的染色。20分钟后，将细胞清洗并重新悬浮在含有10μg/ml PI的PBS中，以对DNA进行染色。在FACSCalibur™上分析细胞（参考38; Becton Dickinson）。

外周血细胞和脾脏的血液学检查。

外周血的血液学检查结果显示雷28 ^−/−新生儿，尽管淋巴细胞趋于减少(图2A） ●●●●。在细胞学水平上，10.5-dpc原始红细胞、外周血和胎肝细胞也没有观察到显著差异（数据未显示）。脾脏雷28 ^−/−新生儿发育不良，尽管严重程度因个体而异(图2B） ●●●●。突变新生儿脾脏中有核细胞的数量减少到野生型的12.5%（数据未显示），但胎儿肝脏中的细胞数量没有减少。FACS公司^®脾细胞分析显示B细胞减少，但具有其他谱系标记的细胞是保守的（数据未显示）。

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图2。

外周血细胞和脾脏。（A） 外周血细胞计数。这些数据表示来自至少三个独立个体的平均值和SD。（B） 脾脏+/+、野生型和−/−的图片，雷28 ^{− / −}老鼠。

CFU-C和CFU-S的扩建₁₂胚胎发育期间。

上述脾脏发育不全和脾细胞数量减少表明雷28 ^−/−胚胎，因为脾脏是新生儿期的主要造血器官之一。我们首先检测了胎儿发育过程中CFU-C的增加。尽管克隆前体细胞包括CFU-Mix、CFU-GM、CFU-E和BFU-E在雷28 ^−/−胚胎，所有这些造血祖细胞的扩增在胎儿发育后期受到损害(图3A） ●●●●。接下来，我们检测了更多早期造血祖细胞雷28 ^−/−胚胎，并发现CFU-S₁₂早在12.5 dpc和CFU-S扩张时，数量就显著减少至正常水平的十分之一₁₂在胚胎发育期间受到影响(图3B） ●●●●。CFU-S的尺寸₁₂年，菌落数量也显著减少雷28 ^−/−(图3C） ●●●●。

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图3。

（A） CFU-C在胚胎发育期间的扩张。用甲基纤维素法检测12.5~18.5dpc胚胎胎肝中CFU-C的数量。这些数据代表了至少五个人的CFU-Cs平均数，并带有SD。BFU-E和CFU-E均显示为红细胞集落。注意，CFU-C（包括CFU-mix、CFU-GM和BFU-E/CFU-E）的扩张在雷28 ^{− / −}14.5dpc后胚胎。黑色方形，野生型；黑色圆圈，雷28 ^{− / −}（B）CFU-S扩建₁₂在胚胎发育期间。数据表示CFU-S的平均值₁₂从至少五个受试者中确定带有SD的菌落数。放大面板显示CFU-S的数量₁₂12.5dpc胎肝细胞。CFU-S数量₁₂已经降低到12.5 dpc，并且在胎儿发育期间其扩张在雷28 ^{− / −}.黑色方形，野生型；黑色圆圈，雷28 ^{− / −}.（C）CFU-S图片₁₂聚居地。胎儿肝细胞（4×10⁵)给亚致死剂量照射的小鼠注射CFU-S₁₂用Telleyesniczky溶液固定后计数。CFU-S的大小和数量₁₂年菌落减少雷28 ^{− / −}.+/+，野生型；−/−，雷28 ^{− / −}（D）14.5 dpc胎肝中LTC-IC的数量。在S17饲养层细胞上培养胎肝细胞2周和3周，并对培养的细胞进行甲基纤维素测定。该数据表示CFU-C菌落数的平均值，SD由至少五个人测定。该数字被认为反映了培养期间LTC-IC的频率和扩展。注意，与2周培养相比，3周培养中LTC-IC的降低更为严重。白色方形，野生型；黑色方块，雷28 ^{− / −}.

LTC-IC分析。

在体内和体外检测了14.5 dpc时突变体中HSC的活性。首先，我们进行了LTC-IC分析。在该试验中，我们测定了在S17饲养层上培养2-3周的胎儿肝细胞中克隆祖细胞的数量。虽然没有进行限制稀释试验来确定LTC-IC的频率，但可以假设CFU-C菌落的数量反映了饲养层LTC-IC频率和增殖能力。菌落数量的减少在雷28 ^−/−(图3D） ●●●●。3-k培养的胎肝细胞的数量比2-k培养的胎肝细胞的数量减少得更显著，这表明LTC-IC的减少在雷28 ^−/−.

长期重组试验。

对造血干细胞功能最严格的测试是对内源性造血被阻断的受者重建造血系统的能力。由于甲基纤维素克隆形成，CFU-S₁₂LTC-IC分析显示雷28 ^{− / −}如前所述，我们评估了胎肝细胞在致命辐射小鼠中重建造血系统的能力。胎肝细胞（4×10⁵)从14.5 dpc野生型和雷28 ^{− / −}将胚胎注射到受致命辐射的同种受体小鼠中，并监测其存活率。所有收件人都注射了雷28 ^−/−胎肝细胞在3周内死亡，而野生型细胞的70%存活超过12周，表明造血系统的重建能力在雷28 ^−/−胎儿肝细胞(图4).

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图4。

致死性照射的同种小鼠移植胎肝细胞后的Kaplan-Meier生存曲线。胎儿肝细胞（4×10⁵)将由14.5-dpc胚胎制备的胚胎注射到同种受体小鼠中，并在常规设施中研究小鼠的存活率。黑色方形，野生型；黑色圆圈，雷28 ^{− / −}.

然后通过限制稀释分析对CRU进行定量测量，以便直接比较HSC的频率和活性。首先，我们交叉了雷28 ^{+ / −}具有普遍表达EGFP转基因系的杂合小鼠(40)并做好准备雷28 ^{− / −}表达EGFP的纯合子和野生型胚胎，以区分测试细胞和竞争对手。从EGFP标记的14.5 dpc中增加胎肝细胞的剂量雷28 ^{− / −}将野生型胚胎与10⁵野生型骨髓细胞作为竞争对手，并移植到经致命照射的先天性受体中。限制性稀释分析显示雷28 ^{− / −}与野生型相比（每4×10 1个⁵相对于每2×10⁴分别为，P（P）< 0.01;图5A） ●●●●。因此雷28 ^{− / −}估计野生型胎肝分别为50和1000，因为胎肝细胞数量为2×10⁷在其中之一雷28 ^{− / −}和野生型。

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图5。

竞争性再种群分析。（A） 胎肝CRU的频率。检测注射了14.5-dpc胎肝细胞的同种受体小鼠的外周血细胞，以评估HSC的长期重建能力。移植后3个月，EGFP>1%的小鼠比例⁺细胞用于计算CRU的频率。黑色方形，野生型；黑色圆圈，雷28 ^{− / −}（B和C）系列移植实验。用包括20个CRU在内的胎肝细胞注射致死性辐照受体小鼠，并在注射后1个月通过CRU分析测定主要受体小鼠的CRU频率。从野生型和雷28 ^{− / −}细胞分别根据图B和图C计算。注意，图上一栏中所示的注入细胞数量在图B和图C之间相差10倍。

系列移植实验。

为了进一步评估雷28 ^−/−HSC，我们进行了系列移植实验。将含有20个CRU的胎肝细胞移植到致死性照射的主要受体小鼠中，根据上述CRU的频率进行计算。移植后1个月，通过二级受体的限制稀释分析，对一级受体小鼠股骨和胫骨的骨髓细胞进行CRU数测定。CRU的频率为1/2×10⁵用野生型CRU重组的主要受体细胞(图5B） 与1/3×10相比⁶在那些有雷28 ^−/−(图5C） ，表明CRU的再生能力在没有雷28(表一). 骨髓细胞总数为2.4×10⁷在用野生型或雷28 ^−/−CRU。因为股骨和胫骨中的骨髓细胞估计占骨髓细胞总数的18.7%(41)重建后1个月，用野生型和雷28 ^−/−CRU分别为～640和43。据估计，野生型CRU在1个月内增加了32倍，但雷28 ^−/−令人惊讶的是，限制在不超过2.2倍(表一). 这些体内结果清楚地表明，CRU的自我更新能力在雷28 ^−/−.

胎儿肝细胞的细胞周期分析。

为了检查雷28 ^−/−胎肝反映了胎肝细胞增殖受损，我们检测了14.5个dpc胎肝细胞的细胞周期状态。用PI染色评估胎肝细胞的相对DNA含量，而在体外BrdU脉冲标记分离细胞1h后测量细胞的BrdU掺入量。如所示图6，循环参数没有明显差异。

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图6。

胎儿肝细胞的细胞周期状态。细胞在收获后用10μg/ml BrdU脉冲标记，用PI染色，并接受FACS^®分析。野生型和雷28 ^{− / −}胎儿肝细胞如图所示。+/+，野生型；−/−，雷28 ^{− / −}.

我们感谢H.W.Brock博士、A.Hakura博士、T.Nakano博士、Y.Niho博士和K.Yamauchi-Takihara博士的鼓励，感谢M.Nishikawa博士和T.W.Mak博士的讨论，感谢R.Hasegawa博士的秘书帮助。我们还感谢D.Duboule博士、P.Gruss博士、R.Krumlauf博士、O.Chisaka博士、H.Kondoh博士、H.Koseki博士、T.Nakano博士、R.Fukunaga博士、I.Matsumura博士和M.Yamamoto博士提供探针来检测霍克斯文中描述了调节造血的基因、各种受体和转录因子。我们非常感谢大阪大学基因组信息研究中心的广泛使用。

这项工作得到了日本教育、科学、体育和文化部科学研究拨款的支持。