跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
细胞生物学杂志。2002年5月13日；157(4): 657–663.
数字对象标识：10.1083/jcb.200201049
预防性维修识别码：项目经理2173846
PMID：11994316

NH2-α-平滑肌肌动蛋白末端肽在体内外抑制肌成纤维细胞产生力

鲍里斯·欣兹,朱利奥·加比亚尼、和克里斯汀·查波尼耶
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

肌成纤维细胞是专门的成纤维细胞，在纤维收缩性疾病中负责肉芽组织收缩和软组织收缩。成纤维细胞-肌成纤维细胞调节的标志物是α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的新表达，α-SMA是血管平滑肌细胞典型的肌动蛋白亚型，被认为在肌成纤维力量生成中起重要作用。肌动蛋白亚型在NH中略有不同2-末端序列；这些保守的差异表明了不同的功能。当NH2-α-SMA Ac-EEED的末端序列以具有细胞穿透序列的融合肽（FP）的形式传递给培养的肌成纤维细胞，抑制其收缩活性；此外，在体内局部给药可抑制大鼠伤口肉芽组织的收缩。NH2-α-骨骼肌动蛋白末端肽对肌成纤维细胞无影响，而NH2-β-细胞质肌动蛋白末端肽在不影响α-SMA分布和细胞收缩的情况下，消除了该亚型的免疫荧光染色。FPs代表了一种新的工具，可以更好地理解肌动蛋白亚型的特定功能。我们的研究结果支持α-SMA在伤口收缩中的关键作用。α-SMA–FP将有助于理解结缔组织重塑的机制；此外，它还为纤维收缩性疾病的细胞骨架依赖性预防和/或治疗策略提供了基础。

关键词：肌动蛋白亚型；伤口愈合；肉芽组织；转化生长因子β；纤维化

介绍

肌成纤维细胞(Gabbiani等人，1971年;Majno等人，1971年)专门的成纤维细胞被认为是肉芽组织收缩的原因吗(马丁，1997)和典型的纤维收缩性疾病的软组织收缩(格林奈尔，1994;塞里尼和加布亚尼，1999年). 它们的主要活动是合成和重塑细胞外基质并产生张力(塞里尼和加布亚尼，1999年). 肌成纤维细胞获得收缩特性反映在α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的新表达中，*血管平滑肌（SM）细胞典型的肌动蛋白亚型(Skalli等人，1986年;Darby等人，1990年)以及其他SM细胞特异性蛋白质（例如SM肌球蛋白重链、结蛋白和钙粒单体），尽管频率较低(塞里尼和加布亚尼，1999年). 肌成纤维细胞产生力量的机制目前尚不清楚，但与在经典横纹肌和SM收缩中起作用的机制明显不同(格林奈尔，2000;Parizi等人，2000年). 公认的是，它们取决于应力纤维的形成和收缩(伯里奇，1981年;Tomasek等人，1992年;Katoh等人，1998年)、培养成纤维细胞和体内肌成纤维细胞的典型细胞器(塞里尼和加布亚尼，1999年). 应力纤维中α-SMA的表达增加体外成纤维细胞的收缩活性(Arora和McCulloch，1994年;Hinz等人，2001a)与体内伤口收缩效率相关(Darby等人，1990年;Hinz等人，2001b). 肌动蛋白是所有真核细胞中的一种主要蛋白，在哺乳动物中以六种细胞类型特异性亚型表达。这些亚型显示出非常小但保守的序列差异(范德克霍夫和韦伯，1978年); 它们的具体功能目前尚未确定。肌动蛋白亚型在NH中基本不同2终点(范德克霍夫和韦伯，1978年); 因此，这个域代表了通过特定绑定中介的特殊函数的可能候选。NH2-末端序列Ac-EEED（针对α-SMA的单克隆抗体的表位）(Skalli等人，1986年;Chaponnier等人，1995年)似乎对α-SMA聚合和应力纤维中的掺入很重要(Chaponnier等人，1995年). 当微注射到培养的成纤维细胞中时，Ac-EEED产生α-SMA特异性免疫检测消失(Chaponnier等人，1995年)这表明它干扰了这种亚型的功能。为了验证肽递送的影响是否包括肌成纤维细胞活性的功能变化，我们构建了一个包含Ac-EEED和触角第三螺旋序列（pAntp-Pro50）的融合肽（FP；SMA-FP）(Derossi等人，1994年)允许细胞穿透。我们在此表明，SMA-FP在交付后迅速定位在应力纤维中；然后在体外抑制肌成纤维细胞的收缩性，在体内抑制肉芽组织的收缩，从而支持α-SMA在伤口收缩中发挥重要作用的假设。

结果

SMA-FP和类似构造的控制α-骨骼肌动蛋白（α-SKA）FP（SKA-FP），由NH组成2-α-SKA Ac-DEDE末端肽与载体pAntp-Pro50(Derossi等人，1994年)，在无罗丹明（Rh）B标记或有罗丹明B标记的情况下合成（SMA-Rh-FP和SKA-Rh-PP）；测试时，标签并没有改变FP活性（未公布的数据）。合成了β-细胞质肌动蛋白FP（β-CA-FP），无Rh B标记。我们选择这些对照是因为（a）NH2-α-SKA的末端序列与α-SMA的末端序列最接近，（b）β-CA在肌成纤维细胞中高度表达。当添加到表达高水平α-SMA的培养大鼠肺成纤维细胞（LFs）中时(Hinz等人，2001a)，对照SKA-Rh-FP在几分钟内显示出弥散的细胞质分布(图1A） 对α-SMA的免疫染色无影响(图1B） 和β-CA(图1C） ●●●●。SMA-Rh-FP进入LF与SKA-Rh-FP类似，但具体定位于应力纤维(图1D） ；α-SMA特异性抗体对应力纤维的染色在30分钟内逐渐减少(图1E） β-CA染色保持不变(图1F） ●●●●。清洗后，SMA-Rh-FP从应力纤维中消失，α-SMA染色在30–60分钟内恢复（未公布数据）。这些结果表明，Ac-EEED可逆地与位于应力纤维中的特定伙伴结合。当将β-CA-FP添加到培养的LF中时，在30分钟内，β-CA从应力纤维中逐渐消失(图2E） α-SMA分布没有任何变化(图2D） ；此外，这些细胞的外围定期出现无丝状β-CA和α-SMA的大细胞质突起(图2F） 表明β-CA-FP通过影响皮层网络来改变细胞形状(图2).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为0201049f1.jpg

FP在培养的LFs中的分布及其对α-SMA免疫染色。SKA-Rh-FP（A，红色）在应用于培养基30分钟后显示出弥散的细胞质分布。同时，它不影响应力纤维中α-SMA（B，绿色）和β-CA（C，蓝色）的染色。在相同条件下，SMA-Rh-FP沿着应力纤维（D）定位，并在不改变β-CA（F）染色的情况下取消α-SMA染色（E）。棒材，50μm。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为0201049f2.jpg

的影响β-CA–培养LF的FP。对照LFs在应力纤维（C，黄色）中共存α-SMA（A，绿色）和β-CA（B，红色）。当添加到培养的LFs中30分钟时，β-CA-FP不影响α-SMA（D）的染色，但取消了β-CA（E）的染色。此外，β-CA–FP诱导无应力纤维的板层突起从头形成（F，白线表示治疗前假定的细胞边缘）。棒材，50μm。

为了研究SMA-FP对单个肌成纤维细胞的影响，将LFs生长在可变形的硅衬底上(Harris等人，1980年)其硬度可以限制高度收缩的α-SMA阳性成纤维细胞形成皱纹(Hinz等人，2001年a) (图3A；视频可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200201049/DC1). 当浓度为5–10μg/ml时，SMA-FP导致细胞张力释放，如皱纹数量减少所示。这一动作在15分钟内可见(图3B） 30分钟时达到最大值(图3C） ●●●●。去除SMA-FP可逆转此效果：洗涤10分钟后，LF首先缩回，其面积缩小(图3D） ●●●●。然后在30–60分钟后进行皱纹修复(图3、E和F). 皱纹消失和再现的循环重复了三次。SKA-FP和β-CA-FP在所有测试浓度下均无影响（未公布数据）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为0201049f3.jpg

SMA-FP抑制LF对硅衬底施加的张力。（A） 在60分钟的记录过程中，未经处理的LF会在可变形硅衬底上产生褶皱。（B） SMA-FP治疗15分钟后皱纹数量减少，30分钟后完全消失（C）。（D） 通过反复洗涤去除SMA-FP后10分钟，LFs再次收缩，然后在30（E）和60分钟（F）后逐渐恢复皱纹。棒材，50μm。另请参阅上的视频http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200201049/DC1.

当从培养皿中释放时，附着的胶原蛋白格可以定量评估细胞群的收缩活性(格林奈尔，1994). LF填充晶格迅速收缩，30分钟后其直径最大减小至初始直径的58%(图4，ct）。SKA-FP对晶格收缩没有影响(图4，SK，250μg/ml）。SMA-FP依赖性降低晶格收缩浓度(图4SM，从5μg/ml时的56%到250μg/ml下初始直径的27%）。在晶格释放之前冲洗SMA-FP，导致控制收缩水平(图4，W). SMA-FP对LFs产生张力的特异性抑制作用表明Ac-EEED在α-SMA介导的肌成纤维细胞收缩中的作用。其可逆性表明α-SMA-FP对细胞完整性没有显著影响。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为0201049f4.jpg

SMA-FP抑制LF介导的胶原晶格收缩。用FPs处理附着的胶原晶格30分钟并释放；再测量30分钟后，将其直径归一化为释放前的直径（等于收缩%）。与未处理的对照晶格相比，（ct）SKA-FP（SK）对晶格收缩无影响，而SMA-FP（SM）则依赖于剂量降低收缩；释放前冲洗SMA-FP（W）会逆转这种效果*第页≤0.01和**第页与对照组相比≤0.001。

细胞外基质蛋白合成增加是肌成纤维细胞活性的标志(塞里尼和加布亚尼，1999年). 为了确定SMA-FP是否影响胶原蛋白的生成，我们将培养的LFs在含有FPs的培养基中培养5天，浓度为3-5μg/ml。在这一时期结束时，LFs保持与未处理对照组相似的形状(图5). 当用α-SMA抗体和卵磷脂对细胞进行双重染色时，α-SMA染色实际上被废除了(图5C） ，而阴茎肽的分布与对照LF的分布相似(图5、B和D). 在所有FP浓度下，通过Northern blot评估的I型胶原mRNA表达在第三天开始下降，并且在第五天明显低于对照组(图6). 胶原mRNA的变化与α-SMA mRNA的减少平行(图6). 这些结果表明，SMA-FP对胶原和α-SMA mRNA表达的作用是间接发挥的，例如通过降低成纤维细胞产生的张力。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为0201049f5.jpg

SMA-FP对LF形态和性能的长期影响α-SMA免疫染色。在富含无血清培养基中生长5天的LFs显示出高度组织化的应力纤维装置，可染色α-SMA（a，绿色）和F-actin（B，指骨苷红）。每天两次连续服用SMA-FP 5天，几乎完全消除了α-SMA（C）的染色，但不会改变细胞形态和F-actin分布（d）。棒材，50μm。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为0201049f6.jpg

SMA-FP降低培养的肌成纤维细胞中I型胶原和肌动蛋白的mRNA表达。用SMA-FP（3μg/ml）处理培养的LFs 1–5天后，Northern blot分析显示I型胶原mRNA在4.7和5.8 kb的两条带中检测到随时间变化的减少，α-SMA在1.7 kb检测到随着时间变化的降低。在这两种情况下，在第三天可以看到下降。对照组LFs（ct）在相似的孵育时间后未显示I型胶原和α-SMA mRNA的变化。

在大鼠开放性伤口愈合过程中，肌成纤维细胞从头表达的α-SMA水平在9–10天大的肉芽组织中达到最大值(Darby等人，1990年;Hinz等人，2001b). 当用内皮素（ET）-1等SM激动剂刺激时，从该组织切下的条带产生显著的等长张力（130±23μN）(Majno等人，1971年;阿普尔顿等人，1992年;Hinz等人，2001b). 与未经处理的对照条或相同浓度SKA-FP处理的条相比，SMA-FP（0.5 mg/ml）可逆地将肉芽组织条的收缩活性降低至36%(图7). 因此，SMA-FP具有抑制药物刺激肉芽组织肌成纤维细胞收缩的能力；与体外实验相比，有效剂量大约高出两个数量级，这可能是由于FP被细胞外基质吸收所致。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为0201049f7.jpg

SMA-FP抑制肉芽组织条收缩。用ET-1刺激9天大的肉芽组织条带，通过洗涤120分钟恢复静止张力，然后用FPs处理60分钟或不处理，然后用ET-1再次刺激。通过洗涤120分钟并用ET-1刺激第三次来测试可逆性。与未经处理的板条（ct）相比，SKA-FP（SK）处理不会改变收缩。SMA-FP（SM）显著降低铝带收缩；冲洗SMA-FP可恢复控制收缩水平**第页与对照组相比≤0.001。

为了研究SMA-FP在体内对肉芽组织收缩的影响，并尽可能避免对上皮化的干扰，我们选择了用塑料框架夹板固定伤口的模型(Abercrombie等人，1960年;Hinz等人，2001b). 与正常愈合伤口相比，夹板技术增加了伤口成纤维细胞α-SMA的表达(Hinz等人，2001b). 机械防止伤口收缩会累积张力，从而在拆除支架时迅速缩小伤口面积。在我们的实验中，框架在受伤10天后被移除，24小时后减少到初始表面的30%(图8，A和B). 在第八天和第九天以及第十天取出支架后，分别用载体凝胶和含有SKA-FP或SMA-FP的载体凝胶治疗夹板伤口。框架移除6小时后，对照伤口和SKA-FP治疗的伤口面积与初始伤口面积相比减少至～37%；SMA-FP的应用显著减少了这种快速收缩（初始伤口面积的50%）(图8、C和D). 24小时后，对照伤口面积进一步减少至初始伤口面积的31%，而经SMA-FP治疗的伤口面积显著增大（42%）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为0201049f8.jpg

SMA-FP减少体内伤口收缩。（A） 用夹板对大鼠背部典型的全层伤口施加机械张力；将支架放置10天。创伤后8天去除痂，用FPs载体凝胶或仅用载体凝胶处理伤口组织。在受伤后第九天和第十天重复治疗。（B） 在取出夹板24小时后，经SKA-FP治疗的伤口显示出与未经治疗的对照组相比的重要表面缩小。（C） 经SMA-FP治疗的伤口明显减少。（D） 取下夹板后6小时和24小时测量创伤面积，并将其归一化为初始创伤面积。每个实验条件下使用20只动物计算平均值。ct，仅载体凝胶；SK、SKA-FP；SM、SMA-FP**第页与对照组相比≤0.001。

讨论

我们的结果表明，α-SMA NH的细胞内传递2-哺乳动物中保守的末端肽Ac-EEED序列(范德克霍夫和韦伯，1978年)特异性地降低体外肌成纤维细胞施加的张力，并减少体内肉芽组织的收缩。他们支持这样的假设，即α-SMA通过该序列在肌纤维母细胞产生张力中发挥作用。它们也支持肌动蛋白亚型发挥特定活性的可能性(Chaponnier等人，1995年;Khaitlina，2001年). β-CA-FP给药后，应激纤维中β-CA染色的选择性消失和这些细胞中突起的形成进一步加强了这一假设，并表明NH2-肌动蛋白亚型的末端序列在决定其功能方面起着重要作用。我们的结果显示，服用SMA-FP后α-SMA选择性消失，服用β-CA-FP之后β-CA选择性消失，支持先前报道的细胞质内肌动蛋白亚型分离的研究结果(DeNofrio等人，1989年;Gimona等人，1994年)以及，尽管是间接的，应激纤维可能含有由单一同种型组成的肌动蛋白丝的建议（综述见Gunning等人，1998年). 我们以前曾报道过在肌成纤维细胞中微量注射α-SMA抗体会导致应激纤维消失(Skalli等人，1990年); 然而，形态结果和变化动力学与这里描述的结果明显不同。

SMA-FP处理细胞胶原mRNA表达下降的机制目前尚不清楚。可以想象，使用SMA-FP后张力的降低反过来导致胶原蛋白和α-SMA mRNA表达的减少，这种减少发生在使用SMA-FP后的第3天。最近研究表明，随着培养中（a）胶原底物张力的降低，肌成纤维细胞中α-SMA的表达降低(Arora等人，1999年)和（b）大鼠肉芽组织(Hinz等人，2001b). 基于这些发现，我们认为SMA-FP可以对目前尚无有效药物治疗的过度伤口收缩和纤维收缩性疾病发挥有益作用。

肌成纤维细胞产生张力的机制尚未建立。人们普遍认为这取决于应力纤维的发展和组织(伯里奇，1981年;Tomasek等人，1992年;Katoh等人，1998年). 越来越多的证据表明，α-SMA在肌成纤维细胞应力纤维中的掺入对控制这些细胞的力产生水平至关重要(Arora和McCulloch，1994年;Hinz等人，2001a). 值得注意的是，SMA-FP在体内外对肌成纤维细胞收缩的抑制始终是部分的。这与只含有细胞质肌动蛋白的应力纤维具有收缩活性的可能性相一致，而α-SMA在应力纤维中的掺入显著增加了其收缩力(Hinz等人，2001a).

TGF-β协同刺激α-SMA和胶原以及其他细胞外基质成分的表达，如ED-A纤维连接蛋白，这是肉芽组织进化和纤维收缩性疾病发展的关键因素(斯波恩和罗伯茨，1992年;Desmoulière等人，1993年;罗诺夫·杰森和彼得森，1993年;Gauldie等人，1999年); 研究SMA-FP对该生长因子表达和/或激活的影响将非常重要。还需要进一步的工作来（a）确定SMA-FP是否通过其对α-SMA聚合的影响而起作用(Chaponnier等人，1995年)和/或通过更直接地影响肌动蛋白依赖的力的产生，以及（b）在肌成纤维细胞收缩器水平确定一个假想的SMA-FP伙伴。

除了对细胞收缩机制提供新的见解外，我们的结果还提出了一种策略，用于（a）探索肌动蛋白亚型在细胞和组织活动中的作用，（b）更好地理解应激纤维功能和肉芽组织收缩的机制，以及（c）开发一种迄今为止尚未探索的方法来控制正常和病理伤口愈合和纤维收缩性疾病期间的组织重塑。

材料和方法

融合肽

NH处分别含有Ac-EEED、Ac-DEDE和Ac-DDDIA的SMA-FP、SKA-FP和β-CA-FP2细胞穿透载体pAntp-Pro50的末端(Derossi等人，1994年)，被合成到95%的纯度（UCB生物产品）；选择这种载体是因为其细胞质传递效率高(Derossi等人，1994年). 前两个FP也被标记为Rh B，通过四甘氨酸臂与位置5的赖氨酸共价连接（UCB生物制品）。这并没有改变他们的活动。初步实验后，如果没有其他说明，则按以下浓度添加SMA-、SKA-、SMA-Rh-和SKA-Rh-FP：3–10μg/ml添加到塑料和硅衬底上的培养细胞中，5–250μg/ml加入到胶原晶格中的细胞中，500μg/ml加到切除的肉芽组织条中，以及500μg/ml载体凝胶（Lutrol®F-127；巴斯夫股份公司（BASF AG）用于体内伤口治疗（实验详情见下文）。β-CA–FP的使用浓度为3–500μg/ml。

体外实验

如前所述分离和培养LF(Desmoulière等人，1992年)在MEM加10%FCS的60-mm培养皿（Nunc and Life Technologies）上培养4d。实验在无血清MEM中进行，以避免FP沉淀。LFs与Rh-tagged FPs孵育，用甲醇固定，并对α-SMA（抗αSM-1，IgG2a单克隆抗体）进行染色(Skalli等人，1986年)和β-CA（β74，rbAb）(Yao等人，1995年)其次是二级抗体山羊抗小鼠FITC-偶联和山羊抗兔氨基甲基香豆素醋酸盐或Rh-偶联（Jackson ImmunoResearch Laboratories）。用3%多聚甲醛/PBS固定并用0.2%Triton X-100/PBS渗透后，进行Rh-球蛋白（Molecular Probes）染色。用40×油浸物镜在Axiopot显微镜（ZEISS）上观察安装样品。使用数字彩色相机和相应的软件（Axiocam；蔡司）采集图像。使用Adobe Photoshop对所有图像进行打印处理®.

为了观察单个细胞的收缩活性，将LFs在FCS存在下在可变形的硅衬底上培养4天(Harris等人，1980年)，其是为了获得最佳电阻而生产的，如前所述(Hinz等人，2001a). 图像序列是通过配备63×物镜B/W相机（BC-2；AVT Horn）、帧抓取器（Meteor PCI；Matrox Electronic Systems Ltd.）和KS400软件（蔡司）的倒置显微镜（Axiover 135；蔡司）获得的。在无血清MEM（见上文）中进行60分钟的对照记录后添加FP，然后通过反复清洗去除FP，以测试可逆性。

附着的胶原晶格(格林奈尔，1994)生产并与LFs（2.5×10）混合5/ml）如前所述(Hinz等人，2001a)在MEM和10%FCS中培养5天。然后用FPs处理晶格，释放，30分钟后测量的直径归一化为释放前的直径（等于收缩%）。通过在释放前清洗处理过的晶格来测试可逆性。

RNA提取和Northern印迹

LFs在MEM和10%FCS的10-cm细胞培养皿中生长到80%的融合；然后将细胞在富含无血清的培养基中培养5天(斯托弗和欧文斯，1992年)含有浓度为3–5μg/ml的FPs；含有FPs的培养基每天更换两次。根据制造商的方案，使用Trizol试剂（Invitrogen）分离总RNA。如前所述，将总RNA（每车道2.5–5.0μg）变性，通过电泳分离，并转移到Electran尼龙膜（BDH实验室用品）上(Serini等人，1998年). 用两个探针进行杂交：一个1600 bp的大鼠α1（I）胶原cDNA，识别5.8和4.7 kb的两条带(Genovese等人，1984年)和总肌动蛋白cRNA 320-bp(Kocher和Gabbiani，1986年)如前所述，识别1.7 kb的α-SMA mRNA和2.1 kb的细胞质肌动蛋白mRNA(Kocher和Gabbiani，1986年;Serini等人，1998年). 信号的量化标准化为使用GAPDH探针获得的结果(Neuville等人，1997年). 杂交后，分别在65°C（胶原蛋白）和58°C（肌动蛋白）下，在5×SSC和0.1%SDS中清洗过滤器2×20 min。然后将Northern印迹暴露在伊士曼柯达公司X-Omat SO-282胶片上，温度为−70°C。

动物实验

为了测量切除的肉芽组织条的等长张力，共有40只雌性Wistar大鼠（200-250只）克)使用了。所有动物程序均按照《联邦兽医指南》进行，并经日内瓦医学院伦理委员会批准。在背部中部形成25×25mm的全厚伤口(Hinz等人，2001b). 一氧化碳致大鼠死亡2伤后9天麻醉，解剖组织并切割成5×10mm的条状。条状物在器官浴中用等距力-位移传感器（FT03；Grass Instrument Co.）的杠杆施加预应力(Hinz等人，2001年b)，用ET-1刺激（Bachem AG）10−7M、 通过洗涤120分钟恢复静息张力，然后用FPs处理60分钟，或者不处理，用ET-1刺激第二次。通过洗涤120分钟并用ET-1刺激第三次来测试可逆性。每次刺激后约30分钟测量峰值张力，根据每只动物的三条组织条和每种实验条件的10只动物计算平均值，如前所述(Hinz等人，2001b).

为了测试体内伤口收缩，共有80只雌性Wistar大鼠（200–250只克)使用了。全厚25×25-mm伤口（见上文）通过夹板承受机械张力，即通过手术线将其边缘固定在塑料框架上；框架放置10天(Hinz等人，2001b). 伤后第8天去除夹板伤口的结痂，并用1 ml载体凝胶（Lutrol）中的FPs处理伤口组织®F-127；BASF AG）或仅使用载体凝胶，并用透明膜覆盖（OpSite™；施乐辉医疗有限公司）。在取出夹板后立即在受伤后的第九天和第十天重复治疗。在移除塑料框架之前以及在6小时和24小时之后立即测量伤口面积。伤口收缩被计算为归一化到初始伤口尺寸的面积减少。每个实验条件下使用20只动物计算平均值。

统计分析

定量结果以平均值±SD表示。平均值之间的差异通过双尾异方差Student’s检验t吨测试，并被认为在以下值上具有统计显著性*第页≤0.01和**第页≤ 0.001.

在线补充材料

视频（请访问http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200201049/DC1)证明了SMA-FP对硅衬底上LFs起皱能力的影响。该序列从已经观察了60分钟的未经处理的LF开始，在可变形的硅树脂基底上产生褶皱，而没有可见的变化。经过SMA-FP处理后，皱纹在30分钟内逐渐消失。经过两次洗涤步骤后，LF再次收缩，60分钟后皱纹完全恢复。

补充材料

【补充材料索引】

致谢

我们感谢G.Celetta、A.Geinoz、G.Martinello、A.Maurer-Hiltbrunner、J.C.Rumbeli和Chi-Yu Jia博士在不同技术方面的专家帮助，感谢Robert Low博士批判性阅读本文，感谢E.Homberg博士的秘书工作。

这项工作得到了瑞士国家科学基金会（31-61.336.00和31-54048.98）和UCB生物制品公司的支持。

笔记

本文的在线版本包含补充材料。

脚注

*本文中使用的缩写：α-SMA，α-平滑肌肌动蛋白；β-CA、β-细胞质肌动蛋白；内皮素；FP，融合肽；LF，肺成纤维细胞；Rh，罗丹明；SKA，骨骼肌动蛋白；SM，平滑肌。

工具书类

  • Abercrombie，M.、D.W.James和J.F.Newcombe。1960年，通过夹板固定伤口边缘研究兔子皮肤的伤口收缩。J.阿纳特。 94:170–182.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • I.阿普尔顿、A.汤姆林森、C.L.钱德和D.A.威洛比。1992年。内皮素-1对巴豆油诱导的大鼠肉芽组织的影响。药理学和免疫组织化学研究。实验室投资。 67:703–710.[公共医学][谷歌学者]
  • Arora，P.D.和C.A.McCulloch。成纤维细胞对α-平滑肌肌动蛋白表达的胶原重塑依赖性。J.细胞。生理学。 159:161–175.[公共医学][谷歌学者]
  • Arora，P.D.、N.Narani和C.A.McCulloch。胶原凝胶的顺应性调节成纤维细胞中α-平滑肌肌动蛋白的转化生长因子-β诱导。美国病理学杂志。 154:871–882.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 伯里奇，K.1981。压力纤维收缩吗？自然。 294:691–692.[公共医学][谷歌学者]
  • Chaponnier，C.、M.Goethals、P.A.Janmey、F.Gabbiani、G.Gabbani和J.Vandekerckhove。1995年。α-平滑肌肌动蛋白的特定NH2末端序列Ac-EEED在体内外聚合中发挥作用。细胞生物学杂志。 130:887–895.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Darby，I.、O.Skalli和G.Gabbiani。在实验性伤口愈合过程中，肌成纤维细胞瞬时表达α-平滑肌肌动蛋白。实验室投资。 63:21–29.[公共医学][谷歌学者]
  • DeNofrio，D.、T.C.Hoock和I.M.Herman。微血管周细胞肌动蛋白亚型的功能分类。细胞生物学杂志。 109:191–202.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Derossi，D.、A.H.Joliot、G.Chassaing和A.Prochiantz。1994.触角足同源结构域的第三螺旋通过生物膜易位。生物学杂志。化学。 269:10444–10450.[公共医学][谷歌学者]
  • Desmoulière，A.、L.Rubbia-Brandt、A.Abdiu、T.Walz、A.Macieira-Coelho和G.Gabbiani。α-平滑肌肌动蛋白在培养和克隆的成纤维细胞亚群中表达，并受γ-干扰素调节。实验细胞研究。 201:64–73.[公共医学][谷歌学者]
  • Desmoulière，A.、A.Geinoz、F.Gabbiani和G.Gabbani。转化生长因子-beta 1诱导肉芽组织肌成纤维细胞以及静止和生长的培养成纤维细胞中α-平滑肌肌动蛋白的表达。细胞生物学杂志。 122:103–111.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Gabbiani、G.、G.Ryan和G.Majno。肉芽组织中改性成纤维细胞的存在及其在伤口收缩中的可能作用。体验。 27:549–550.[公共医学][谷歌学者]
  • Gauldie，J.、P.J.Sime、Z.Xing、B.Marr和G.M.Tremblay。向肺转移转化生长因子-beta基因会导致肌成纤维细胞的存在和肺纤维化。货币。顶部。病态。 93:35–45.[公共医学][谷歌学者]
  • Genovese，C.、D.Rowe和B.Kream。1984年，构建补充大鼠α1和α2胶原mRNA的DNA序列，并将其用于研究1,25-二羟维生素D对I型胶原合成的调节。生物化学。 23:6210–6216.[公共医学][谷歌学者]
  • Gimona，M.、J.Vandekerckhove、M.Goethals、M.Herzog、Z.Lando和J.V.Small。β-肌动蛋白特异性单克隆抗体。细胞运动。细胞骨架。 27:108–116.[公共医学][谷歌学者]
  • Grinnell，F.1994年。成纤维细胞、肌成纤维细胞和伤口收缩。细胞生物学杂志。 124:401–404.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Grinnell，F.2000年。成纤维细胞-癌基质收缩：生长因子信号和机械负荷。趋势细胞生物学。 10:362–365.[公共医学][谷歌学者]
  • Gunning，P.、E.Hardeman、P.Jeffrey和R.Weinberger。创建细胞内结构域：神经元中肌动蛋白和原肌球蛋白亚型的空间分离。生物论文。 20:892–900.[公共医学][谷歌学者]
  • 哈里斯、A.K.、P.怀尔德和D.斯托帕克。1980年。硅橡胶基底：细胞运动研究中的一个新问题。科学。 208:177–179.[公共医学][谷歌学者]
  • Hinz，B.、G.Celetta、J.J.Tomasek、G.Gabbiani和C.Chaponnier。2001.a.α-平滑肌肌动蛋白表达上调成纤维细胞收缩活性。分子生物学。单元格。 12:2730–2741.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Hinz，B.、D.Mastrangelo、C.E.Iselin、C.Chaponnier和G.Gabbiani。2001.b.机械张力控制肉芽组织收缩活动和肌成纤维细胞分化。美国病理学杂志。 159:1009–1020.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Katoh，K.、Y.Kano、M.Masuda、H.Onishi和K.Fujiwara。1998年。应力纤维的隔离和收缩。分子生物学。单元格。 9:1919–1938.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Khaitlina，S.Y.2001年。肌动蛋白亚型的功能特异性。细胞国际评论。 202:35–98.[公共医学][谷歌学者]
  • Kocher，O.和G.Gabbiani。大鼠主动脉平滑肌细胞在发育、实验性内膜增厚和培养过程中肌动蛋白mRNA的表达。区别。 32:245–251.[公共医学][谷歌学者]
  • Majno，G.、G.Gabbiani、B.J.Hirschel、G.B.Ryan和P.R.Statkov。1971.体外肉芽组织收缩：与平滑肌相似。科学。 173:548–550.[公共医学][谷歌学者]
  • Martin，P.1997年。伤口愈合-完美皮肤再生。科学。 276:75–81.[公共医学][谷歌学者]
  • Neuville，P.、A.Geinoz、G.Benzonana、M.Redard、F.Gabbiani、P.Ropraz和G.Gabbani。细胞视黄醇结合蛋白-1在体内外由大鼠动脉平滑肌细胞的不同亚群表达。美国病理学杂志。 150:509–521.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Parizi，M.、E.W.Howard和J.J.Tomasek。LPA促进肌成纤维细胞收缩的调节：Rho、肌球蛋白轻链激酶和肌球蛋白轻链磷酸酶的作用。实验细胞研究。 254:210–220.[公共医学][谷歌学者]
  • 罗诺夫·杰森和O.W.彼得森。1993年。通过转化生长因子-beta 1在静止的人乳腺成纤维细胞中诱导α-平滑肌肌动蛋白。乳腺肿瘤中肌成纤维细胞生成的意义。实验室投资。 68:696–707.[公共医学][谷歌学者]
  • 塞里尼、G.和G.加比亚尼。肌成纤维细胞活性和表型调节的机制。实验细胞研究。 250:273–283.[公共医学][谷歌学者]
  • 塞里尼、G.、M.L.博查顿·皮亚拉特、P.罗普拉兹、A.盖诺兹、L.博尔西、L.扎尔迪和G.加比亚尼。纤维连接蛋白结构域ED-A对转化生长因子-β1诱导肌纤维母细胞表型至关重要。细胞生物学杂志。 142:873–881.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 斯科利、O.、P.罗普拉斯、A.特泽西亚克、G.本佐纳纳、D.吉勒森和G.加比亚尼。1986.一种抗α-平滑肌肌动蛋白的单克隆抗体：一种用于平滑肌分化的新探针。细胞生物学杂志。 103:2787–2796.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • O.斯科利、F.加比亚尼和G.加比安尼。1990年。普通和α-平滑肌特异性肌动蛋白抗体微注射对培养平滑肌细胞应激纤维的作用。实验细胞研究。 187:119–125.[公共医学][谷歌学者]
  • 斯波恩、M.B.和A.罗伯茨。1992年，转化生长因子β：最新进展和新挑战。细胞生物学杂志。 119:1017–1021.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Stouffer，G.A.和G.K.Owens。1992年。血管紧张素II诱导自发性高血压大鼠源培养平滑肌细胞的有丝分裂依赖于转化生长因子-β的自分泌。循环。物件。 70:820–828.[公共医学][谷歌学者]
  • 托马塞克、J.J.、C.J.哈克斯马、R.J.埃迪和M.B.沃恩。成纤维细胞收缩发生在附着的胶原晶格张力释放时：依赖于有组织的肌动蛋白细胞骨架和血清。阿纳特。记录。 232:359–368.[公共医学][谷歌学者]
  • Vandekerckhove，J.和K.Weber。1978.根据氨基末端胰蛋白酶肽的氨基酸序列分析，高等哺乳动物中至少表达六种不同的肌动蛋白。分子生物学杂志。 126:783–802.[公共医学][谷歌学者]
  • Yao，X.、C.Chaponnier、G.Gabbiani和J.G.Forte。胃壁细胞肌动蛋白亚型的极化分布。分子生物学。单元格。 6:541–557.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
来自的文章细胞生物学杂志由以下人员提供洛克菲勒大学出版社