转化生长因子β（TGF-β）家族的细胞因子，包括转化生长因子-β、激活素/抑制素和骨形态发生蛋白（BMPs），在调节细胞增殖、分化、凋亡、迁移和细胞外基质（ECM）重塑等广泛的生物过程中发挥着重要作用(Siegel和Massague，2003年). TGF-β信号的干扰通常与癌症等疾病有关，在肿瘤发展的不同阶段，TGF-(Bierie和Moses 2006).
典型的TGF-β信号通路始于TGF-配体与I型和II型TGF-受体（TβRI和TβRII）的结合，这两种受体都是丝氨酸/苏氨酸激酶。激活的受体复合物磷酸化下游转录因子，称为受体调节的Smad蛋白（R-Smads）、Smad2和Smad3，导致R-Smad和共同伙伴Smad4之间形成复合物。Smad复合物随后集中在细胞核中，以调节大量靶基因的表达(Shi和Massague 2003).
Smad2和Smad3作为TGF-β信号传导的主要介质，其氨基酸序列同源性>90%。这两个Smad都由两个高度保守的结构域（MH1和MH2）组成，这两个结构域由一个更分散的连接子区域连接，外加一个作为受体介导磷酸化靶点的C末端SSXS基序(马萨古埃2000). 在TGF-β存在下，Smad2和Smad3经历了一个动态循环过程，包括Smad激活、核移位、靶基因的转录控制以及Smad去磷酸化或降解导致的信号终止(Inman等人，2002年;Schmierer和Hill 2005;Lin等人，2006年; 有关查看信息，请参阅Heldin等人，1997年;赫尔丁和十个迪克1999;马萨古埃2000;Schilling等人，2006年). 所有这些步骤都受到严格控制，以确保Smad2/3以忠实反映配体刺激强度和持续时间的方式将信号从质膜传输到细胞核。然而，对于Smad2和Smad3在受体介导的激活前如何在其稳定状态下进行调节，以及这些调节如何以细胞类型和组织特异性的方式预先确定细胞对TGF-β的敏感性，目前仍缺乏全面的了解。
尽管存在广泛的序列相似性和功能重叠，但Smad2和Smad3在某些基因的调节中发挥着不同的作用，并且可能受到差异调节。与Smad2相比，Smad3控制着更广泛的基因序列Smad2公司和Smad3公司在小鼠中产生显著不同的表型(Piek等人，2001年;Kretschmer等人，2003年;Dunn等人，2005年; 有关查看信息，请参阅Weinstein等人，2000年;Roberts等人，2006年). 对这些区别的一个解释是Smad2的MH1结构域的独特结构，其中包含Smad3中没有的30氨基酸插入物（由Exon 3编码）(Dennler等人，1999年;Yagi等人，1999年). 该序列阻止Smad2与DNA和许多其他蛋白质直接结合(Shi等人，1998年;Jayaraman和Massague 2000年).
作为一种支架蛋白，Axin在功能上被定义为Wnt/β-catenin途径的负调控因子。在缺乏Wnt配体的情况下，Axin与腺瘤性息肉病大肠杆菌（APC）、糖原合成酶激酶3（GSK3-α/β）和酪蛋白激酶Iα（CKIα）相互作用，形成β-连环蛋白破坏复合物(van Es等人，2003年). 在这个复合物中，GSK3在CKIα介导的启动磷酸化后磷酸化β-catenin上的多个Ser/Thr残基，从而触发β-catentin的泛素化和蛋白酶体降解。有趣的是，发现Axin和GSK3-β与Smad3复合(Furuhashi等人，2001年;Jian等人，2006年;Liu等人，2006年)尽管这种相互作用的生理意义仍有待充分阐明。
这里，我们显示非激活的Smad3，而不是Smad2，经历泛素依赖的蛋白酶体降解。Axin和GSK3-β以一种类似于β-catenin破坏复合物的方式协同调节Smad3蛋白周转，从而确定细胞对TGF-β信号的敏感性。
结果
非活化Smad3的多泛素化和蛋白酶体降解
以往的研究表明，Smad3蛋白的基础水平在不同的细胞类型中有所不同，Smad2蛋白的稳定性在稳定状态下受到调节(Inoue等人，2004年;Waddell等人，2004年;Kim等人，2005年; 我们未发布的数据）。为了进一步研究这个问题，我们首先通过阻断蛋白质合成和/或蛋白酶体降解来检测Smad3蛋白质的周转。两种常用的TGF-β反应细胞系，人类角质形成细胞HaCaT和肝细胞癌（HCC）HepG2细胞，用一种特异性TβRI激酶抑制剂SB-431542进行预处理，以阻断任何TGF-？自分泌活性。在此条件下，添加蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺（CHX）导致两种细胞类型中Smad3显著减少，而26S蛋白酶体抑制剂MG-132处理导致Smad3积累(; 数据未显示）。相比之下，Smad2水平几乎不受这些药物的影响(; 数据未显示）。类似的结果也出现在35脉冲相分析中S标记的Smad2和Smad3（补充图S1A）。我们一致发现，MG-132处理的HaCaT细胞中内源性Smad3是多泛素化的(). 结果表明，在没有TGF-β的情况下，Smad3被蛋白酶体主动降解，尽管Smad2和Smad3同源性很高，但在稳定状态下受到差异调节。
稳态Smad3的组成型蛋白酶体降解受Axin的调节。(一)用10μM SB-431542预处理HaCaT细胞6 h，然后按指示添加50μg/mL CHX或25μM MG-132。对总细胞裂解物进行内源性Smad3和Smad2的探测。γ-管蛋白被用作负荷控制。(B类)内源性Smad3的泛素化分析。在添加30μM MG-132之前，用载体（乙醇）或10μM SB-431542预处理HaCaT细胞1 h。再过3 h，在SDS裂解缓冲液中裂解细胞，进行免疫沉淀（IP），无抗体（−）或抗Smad3（Zymed）。(C类)用10μM SB-431542预处理表达载体控制或野生型hAxin的逆转录病毒感染稳定SNU475细胞群，然后用50μg/mL CHX处理指定的时间长度。检测内源性蛋白质。(D类)内源性Smad3水平的量化C类以及在SB-431542存在的类似实验中测试的Alexander和DLD-1细胞中。时间“0”时每个细胞系中Smad3的水平设置为1.0。(E类)两种被指定为R1和R2的shRNAs对293T细胞内源性Axin的有效敲除。pSuper-GFP被用作非靶向shRNA对照。(F类,G公司)SNU475稳定系Smad3泛素化分析(F类)在293T细胞中(G公司). pSuper-GFP被用作Axin RNAi（R1+R2）的对照。细胞用10μM SB-431542预处理1h，然后用MG-132处理（25μM）4h，然后在RIPA缓冲液中溶解。中的注释G公司内源性hAxin的迁移速度比myc-mAxin快，因为它的尺寸较小。
Axin通过促进其泛素化负调控Smad3的基础稳定性
为了确定稳定状态下Smad3蛋白稳定性的调节机制，我们研究了Smad3降解的候选调控因子。众所周知，支架蛋白Axin在β-catenin降解中起着重要作用，并且证明只有在缺乏TGF-β的情况下才能结合Smad3(Furuhashi等人，2001年;Liu等人，2006年). 同样，我们报道了某些Axin-相关激酶，如CKIs和GSK3-β，也优先以非活化形式结合Smad3(Waddell等人，2004年;Jian等人，2006年). 这些观察结果表明Smad3的基础稳定性可能受Axin调控。
为了研究Axin在Smad3基础转换中的作用，我们首先检测了三种已知的人类癌症细胞系，这些细胞系在AXIN1型基因。SNU475是一种人肝癌细胞系，其外显子1和2纯合子缺失AXIN1型因此没有Axin表达式。Alexander（也称为PLC/PRF/5）是另一个肝癌细胞系，其第4外显子AXIN1型（编码GSK3-β-结合序列）丢失(Satoh等人，2000年). 结肠癌细胞系DLD-1失去了一个等位基因AXIN1型，而剩余的等位基因包含一个点突变L396M。由此产生的突变体Axin无法结合GSK3-β，并且对β-catenin降解具有显著的负面影响(Webster等人，2000年). 在所有三种细胞系中，内源性Smad3蛋白的半衰期显著长于在没有AXIN1型突变，如HaCaT和HepG2(，参见A）。当外源性野生型（WT）Axin在这些细胞中在生理水平上重新表达时，Smad3的有效周转被有效恢复(). 在体外表达的Smad3中也观察到了蛋白质稳定性的这种变化（数据未显示）。然而，Smad2的基本稳定性不受Axin的影响(; 数据未显示），与在HaCaT和HepG2细胞中观察到的高稳定性一致。此外，在Axin重组的SNU475细胞中检测到Smad3的强泛素化，但在SNU475-Vec细胞中未检测到(). 为了确定Axin急性缺失对Smad3的影响，我们设计了两个针对人类Axin的独立shRNA(). 敲除SNU475-Axin细胞中外源表达的Axin几乎完全抑制Smad3泛素化(). 相反，在表达这些相同shRNAs的293T细胞中，通过同时表达小鼠Axin，减少的Smad3泛素化完全恢复到其原始水平，该Axin在功能上与人类Axin可互换，但对shRNA具有抗性(). 这些数据强烈表明，Smad3的基础泛素化和降解在几个不同的细胞系中受到Axin的紧密和特异性控制。
Axin调节细胞对TGF-β的敏感性
接下来，我们评估了改变Axin表达对Smad3转录活性的影响。shRNAs对HepG2和293T细胞Axin的下调增加了SBE-Luc（Smad3-specific）的基础和TGF-β诱导的荧光素酶报告活性(Lin等人，2003年)和纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）-Luc（Smad3-反应性）(Wrana等人，1992年)，但不是MBE-Luc（SBE-Luc的突变对照）或ARE-Luc（与FoxH1/Fast-1一起使用时Smad2特异性）(Piek等人，2001年;; 补充图S2D；数据未显示）。这些数据与Axin加速Smad3基础转换的能力相一致，并表明Axin在TGF-β信号传导中具有负面作用，特别是通过Smad3的调节。事实上，Axin缺失促进了TGF-β激活Smad3，而不影响TβRI或Smad2的水平和活性（补充图S2A、B、E）。此外，Axin RNAi进一步增强了TGF-β诱导的一系列内源性Smad3靶基因（纤维连接蛋白、NET1、PAI-1、JunB、ATF3和p15）在HaCaT细胞中的表达(). 在人类乳腺癌MDA-MB-231细胞中也观察到类似结果（数据未显示）。在这些基因中，纤维连接蛋白（FN）和NET1已被证明参与细胞迁移(Shen等人，2001年;Guo和Giancotti 2004). 相应地，在创伤愈合/划痕试验中，Axin敲除的HaCaT细胞对TGF-β的反应比对照细胞表现出更大的细胞运动性增加，尤其是用低剂量配体处理时(). 其他Smad3靶基因如p15和ATF3已被证明可介导TGF-β/Smad3诱导的生长抑制(Hannon and Beach 1994年;Kang等人2003a). 与此一致的是，Axin RNAi使HaCaT细胞对TGF-β的细胞抑制作用更敏感(). 一个潜在的警告是，降低Axin的表达可以同时稳定Smad3和β-catenin，后者可以协同调节某些基因(Labbe等人，2000年,2007;Jian等人，2006年). 为了分离Smad3和β-catenin对这些TGF-β诱导的生物反应的影响，我们在稳定表达shRNAs对抗APC或用Wnt-3A预处理的HaCaT细胞中进行了平行实验（数据未显示）。尽管在这两种情况下β-catenin水平都升高，但Smad3介导的反应性在B和C受到影响。因此，Axin RNAi使HaCaT细胞对TGF-β的总体敏感性主要来自Smad3活性的增强。
Axin对Smad3介导的TGF-β活性产生负面影响。(一)HepG2细胞中荧光素酶报告子分析。将显示的荧光素酶结构体和pCMV-β-半乳糖苷酶（各0.5μg）与总计3μg的pSuper质粒共同转染到六孔板的每个孔中，但在面板中一使用3和6μg pSuper-Ax-R1或pSuper-Ax-R2。在面板中b条和c（c），使用两种相应的pSuper-R1和pSuper-R2结构体的混合物，各1.5μg。转染后20小时，小组中的细胞b条和c（c）用或不用100 pM TGF-β培养16–24小时(B类)HaCaT细胞被pSuperRetro病毒感染两次。pSR-GL2靶向荧光素酶，用作阴性对照。用50 pM TGF-β处理细胞4 h。每个Smad3靶基因的蛋白水平在正确的. (C类)HaCaT细胞按B类在伤口愈合试验中进行了测试。细胞迁移在正确的. (*)P（P）< 0.01. (D类)对用0、2.5、10、25或50 pM TGF-β处理12 h的指定HaCaT细胞进行细胞增殖试验P（P）-显示了在每种TGF-β浓度下两种类型的细胞之间的值。(E类)HCT116+Chr.3和TGF-β治疗中的Axin敲除与B类. (F类)HCT116+Chr.3细胞的创伤愈合试验。在80%的汇合处刮除细胞，用200 pM TGF-β处理，并允许细胞迁移24 h。
为了进一步分析Axin在限制TGF-β/Smad3活性中的作用，我们将功能分析扩展到其他细胞系。人类结肠癌细胞系HCT116+Chr.3和HepG2细胞均表达组成性活性形式的突变β-catenin，其超出Axin的调节(Morin等人，1997年;Satoh等人，2000年). 对于HCT116细胞，3号染色体的重建可恢复TβRII的表达和TGF-β的反应性(伊利亚斯等人，1999年; 数据未显示）。在这两种细胞类型中，Axin下调再次促进Smad3靶基因（包括PAI-1、JunB、CTGF[结缔组织生长因子]和ATF3）的诱导、Smad3的C末端磷酸化（P-Ser423/425）和/或TGF-β的细胞运动(; 补充图S2B，C）。这些结果表明Axin可以独立于β-catenin调节TGF-β信号。作为一种补充方法，我们评估了在有或没有Axin重新表达的Alexander和DLD-1细胞中TGF-β/Smad3的活性。在亚历山大细胞中，野生型Axin（人类或爪蟾)抑制Smad3的活化，因此TGF-β诱导生长停滞（补充图S3A-C；数据未显示）。有趣的是，在两个XAxin突变体L473A/D474A和H476A中也观察到这种抑制作用(Xing等人，2003年)β-catenin结合缺陷，但可与Smad3相互作用并促进Smad3泛素化（补充图S3B，C；数据未显示）。将野生型Axin重新导入DLD-1细胞完全阻断TGF-β刺激但非自发的细胞迁移（补充图S3D）。综上所述，这些功能分析的结果提供了强有力的证据，证明Axin通过促进Smad3基础转换（与β-catenin调节无关的事件），对TGF-β的细胞敏感性施加了广泛的负面控制。
GSK3-β与非活化Smad3相关
由于Axin是一种无已知催化活性的支架蛋白，我们假设Axin通过与其他蛋白（如激酶GSK3）形成降解复合物来调节Smad3的稳定性。为了验证这一假设，我们检测了人类Axin突变体L392P。这种单一氨基酸突变与DLD-1细胞（L396M）中发现的突变相似，特别破坏Axin和GSK3之间的相互作用(Dajani等人，2003年). 结果表明，hAxin（L392P）虽然仍然结合Smad3，但未能促进Smad3泛素化（补充图S4A，B）。这表明Axin依赖GSK3调节Smad3的周转。
为了确定GSK3和Smad3之间的关系，我们测试了这些蛋白质是否可以形成复合物。发现HaCaT细胞内源性Smad3与GSK3-β和Axin共免疫沉淀，由于Smad3和Axin3的水平相对较低，仅在用MG-132预处理细胞时才能检测到这种共免疫沉淀(，车道5,8）。与以前的报告一致(Furuhashi等人，2001年;Jian等人，2006年)，TGF-β导致Axin和GSK3-β释放Smad3(，车道6,9），而不影响β-catenin/Axin/GSK3-β复合物的完整性。相反，在相同条件下，无论TGF-β处理与Axin或GSK3-β的复合物中均未发现内源性Smad2()，这可能是Smad2蛋白高稳定性的原因（见讨论）。此外，所检测的细胞系的内源性Smad3优先与GSK3-β相互作用，而不是与GSK3-α相互作用(; 数据未显示），表明GSK3-β在Smad3调节中更为相关。
GSK3-β与非活化Smad3相互作用。(一)用50μM MG-132预处理HaCaT细胞4 h，并用或不用100 pM TGF-β预处理最后2 h。然后在ULB中溶解细胞+使用免疫前山羊IgG或指示的多克隆抗体进行内源性共免疫沉淀分析。Smad2和Smad3与抗Smad123（H-2）一起被探测。在车道内4和7、ULB+单独使用（无裂解物）作为阴性对照。(B类)使用抗Smad3抗体（Zymed）从野生型（WT）和GSK3-βKO MEF中沉淀内源性Smad3。探索了共沉淀GSK3亚型。(C类)首先将SNU475 Vec或SNU475 Axin细胞裂解物（每次反应1 mg）与3μg单独的GST或1、3或10μg GST-Mad3在4°C下混合2小时，然后进行抗GSK3-β免疫沉淀。GSK3-β没有结合GST部分。
为了探索Smad3、GSK3-β和Axin之间的关系，我们将纯化的GST-Smad3与SNU475 Vec或SNU475 Axin细胞的全细胞裂解物混合。重要的是，当Axin存在时，重组Smad3与内源性GSK3-β之间的相互作用更强(). 通过对Alexander-Vec和Alexander-Axin细胞的全细胞提取物进行凝胶色谱分析，进一步证实了Axin的支架作用。在缺乏Axin的情况下，GSK3-β主要作为单体存在。随着Axin重组，大量GSK3-β转移到分子量较高的组分，其中也检测到Smad3和/或β-catenin（数据未显示）。这些结果表明，在没有TGF-β的情况下，Axin通过与这两种蛋白的直接结合加强了GSK3-β和Smad3之间的相互作用，这可能对促进Smad3泛素化很重要。
Smad3基础转换需要GSK3-β激酶活性
上述结果促使我们确定GSK3-β在Smad3基础代谢中的作用。为此，我们比较了来源于野生型和野生型的成对小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中Smad3的稳定性葛兰素史克3-β基因敲除（KO）同胞(Hoeflich等人，2000年). 由于小鼠Smad3的氨基酸序列与人类Smad3完全相同，因此在野生型MEF中，其基础代谢率也类似(). 有趣的是，在GSK3-β-空MEF中，GSK3-α丰富且完全活性（数据未显示），内源性Smad3蛋白的稳态水平不仅高于野生型MEF，而且在CHX治疗过程中基本保持不变(,). 当野生型GSK3-β被引入空细胞时，内源性Smad3的丰度降低，其周转率增加，均达到野生型MEF中的水平(). 在配对MEF中观察到同样的现象，即外显表达的Smad3（数据未显示）。这些数据以及，清楚地表明GSK3-β，而不是GSK3-α，通过调节其周转，在维持非活化Smad3蛋白在特定水平上发挥关键作用。值得注意的是，小鼠Smad2（>99%与人类Smad2相同）在两个MEF系中同样丰富且稳定()，再次支持我们的假设，即两种Smad蛋白在其非激活状态下受到差异调节。
Smad3基础降解需要GSK3-β激酶活性。(一)用50μg/mL CHX处理野生型（WT）和无GSK3-β的MEF，持续指定的时间。显示转染的Flag-GSK3-β（WT）（箭头）。通过Western blot分析内源性Smad3的蛋白质水平，并在正确的时间“0”时KO细胞中的Smad3水平定义为1.0。(B类)两种被指定为R1和R2的shRNAs对293T细胞中GSK3-β的特异性敲除。(C类)用两种抗GSK3-β的shRNAs混合物预转染293T细胞两次。用10μM SB-431542和25μM MG-132处理3 h后，在RIPA缓冲液中对细胞进行裂解，以进行Smad3泛素化分析。(D类)用二甲基亚砜、SB-216763（10μM）或U0126（10μM）处理HaCaT细胞共12小时，并用20μg/mL CHX处理所示时间进程。Western blot检测内源性Smad3的周转(左边，代表三个独立实验）并对每个治疗组进行量化(正确的). 还检测了磷酸-β-连环蛋白和磷酸-标记，以显示激酶抑制剂的功效。(E类)在CHX治疗前，用myc-GID5/6或突变对照（myc-GID 5/6 LP）转染293T细胞两次。检测内源性Smad3和磷酸化-β-连环蛋白。(F类)HA-Smad3在具有载体或GSK3-β突变体（S9A或Y216F）的293T细胞中过表达。MG-132处理（30μM，3 h）后，在RIPA缓冲液中收集细胞用于Smad3泛素化分析。
接下来，我们采取了三种不同的方法来干扰人类细胞中内源性GSK3-β的功能，并评估了随后对Smad3转换的影响。首先，shRNA-介导的两个独立靶序列对GSK3-β的敲除显著降低了Smad3泛素化并几乎完全阻断了其在293T细胞中的基础转换(; 数据未显示），重述MEF的结果。其次，用一种有效且选择性的GSK3-β抑制剂SB-216763预处理HaCaT细胞，防止Smad3降解(). 相反，即使Smad3可以被Erk1/2和CDKs磷酸化(Matsuura等人，2004年,2005)MEK抑制剂U0126和CDK抑制剂Riscovitine均未对Smad3的稳定性产生任何影响(; 数据未显示），证实GSK3-β抑制剂在阻断Smad3转换中的特异性。作为第三种方法，GID-5/6是一种来源于Axin的GSK3-β结合域的小多肽，在293T细胞中过度表达，以取代GSK3-(Hedgepeth等人，1999年). Smad3由该肽抑制剂稳定，但不由控制肽GID-5/6 LP稳定，该控制肽包含上述L392P突变，无法与GSK3-β竞争结合(). 如前所述，Smad2的稳定性不受任何这些处理的影响（数据未显示）。鉴于Axin在上述所有细胞系中都是野生型和功能性的，我们得出结论，该支架蛋白并不足够，但需要GSK3-β的协同作用来调节Smad3的周转。作为功能丧失策略的补充方法，我们还检测了GSK3-β突变体通过过度表达对Smad3的影响。如所示组成活性形式GSK3-β（S9A）增强Smad3泛素化(Cross等人，1995年)，但不是激酶缺陷突变体GSK3-β（Y216F）(Hughes等人，1993年). 综上所述，这些数据表明，具有催化活性的GSK3-β与Axin共同负责非活化Smad3的持续周转。
Smad3活性的选择性增强葛兰素史克3-β−/−MEF公司
为了衡量Smad3和GSK3-β之间联系的功能后果，我们接下来确定葛兰素史克3-β−/−与野生型MEFs相比，具有更高水平Smad3蛋白的MEFs对TGF-β的反应性更强。事实上，在TGF-β治疗后，GSK3-β阴性细胞中Smad3的C末端磷酸化和核移位比野生型细胞中更为显著，而Smad2没有观察到这种差异（补充图S5）。因此，在没有GSK3-β的情况下，TGF-β诱导的SBE-Luc荧光素酶活性显著升高，但Smad2依赖的ARE-Luc活性在两个MEF系中诱导的模式相似(). 在用GSK3-βshRNAs或LiCl（GSK3-(,，面板c）。鉴于Smad2信号的未受干扰状态，GSK3-β似乎不会干扰TGF-β受体或Smad2/Smad4复合物的功能，但选择性地控制Smad3的活性。
Smad3活性的选择性增强葛兰素史克3-β−/−MEF公司。(一)将MEF转染给指定的报告菌（每孔六孔板0.3μg SBE/MBE或0.5μg ARE+FoxH1）24 h，然后进行100 pM TGF-β处理12 h(B类)HepG2细胞被转染为面板中使用了3微克和6微克的pSuper-GSK3-β-R1或pSuper-GSK3-β-R2一，并在面板中使用两种shRNA的混合物（各1.5μg）b条LiCl（20 mM）和TGF-β（100 pM）处理均持续24小时(C类)野生型（WT）和KO MEF用不同浓度的TGF-β处理2 h，并在ULB中收获+.蛋白质表达通过Western blot分析(左边)并量化(正确的). (D类)MEF的细胞粘附试验。附着细胞的数量被量化，并表示为平均值±SD。
随后，我们评估了两个内源性Smad3靶基因JunB和整合素α5的表达(Kang等人2003a)，在野生型和葛兰素史克3-β−/−MEF公司。我们发现，这两个基因对TGF-β刺激在葛兰素史克3-β−/−单元格(). 作为一种功能性结果，与整合素α5在介导细胞与ECM相互作用中的重要作用一致(Guo和Giancotti 2004)，的葛兰素史克3-β−/−在细胞粘附试验中，与TGF-β处理后的野生型细胞相比，MEF显示出更有效的与基质的再附着().
所有这些数据都强烈支持这样的观点，即Smad3蛋白的稳定可以增加TGF-β受体激活其的概率，从而为GSK3-β缺陷细胞对TGF-α信号的超敏反应提供了分子基础。
GSK3-β磷酸化Thr66处的Smad3
由于GSK3-β已被证明通过直接磷酸化触发几种蛋白质的泛素化，因此，在非活化Smad3的周转中对GSK3-？激酶活性的要求以及这两种蛋白质之间的物理相互作用导致我们检查Smad3是否是该激酶的直接底物(Jope and Johnson 2004年). 在初始试验中，体外激酶分析表明Smad3是GSK3-β的合理底物（补充图S6）。随后的质谱（MS）和免疫印迹分析确定Thr66是体内外GSK3-β磷酸化位点(; 数据未显示）。Thr66位于Smad3的富含赖氨酸的MH1结构域及其周围序列（TKCIT型IPRS）符合GSK3-β共识基序，秒/吨xxxS/T公司(Cohen和Frame 2001). 在MG-132存在的情况下，发现内源性Smad3在葛兰素史克3-β+/+MEFs、HaCaT细胞和HepG2细胞，而这种磷酸化被GSK3-β抑制剂SB-216763强烈抑制(，1-3车道；数据未显示）。相反，在GSK3-β-缺失的MEF中几乎检测不到Thr66磷酸化，但可以通过引入外源野生型GSK3-([车道4,5]，B）。此外，当该位点突变为缬氨酸（T66V）时，Thr66的磷酸化被完全消除().
GSK3-β介导的Thr66磷酸化导致Smad3基础降解。(一)内源性Smad3在Thr66处磷酸化。GSK3-β野生型（WT）和KO-MEFs用20μM MG-132处理3小时，并用抗pT66抗血清探测细胞裂解物。（车道三)在MG-132治疗前10 h添加SB-216763（10μM）。（车道5)pQCXIP-GSK3-β（WT）在细胞裂解前24小时转染。(B类)用3xFlag-Smad3（WT或T66V）转染GSK3-β野生型（WT）和KO MEF，并用MG-132处理，如一在RIPA缓冲液中收集细胞，然后进行反标记IP。(C类)在指示的CHX治疗（50μg/mL）之前，在293T细胞中分别表达等量的HA标记Smad3结构体（WT、T66V或T66D）20 h。Western blot是三个独立实验的代表，这些实验的结果在D类显示周转率(左边)和蛋白质水平(正确的)Smad3变体。(E类)用30μM MG-132处理转染有所示构建物的293T细胞3 h，并在SDS裂解缓冲液中裂解以进行泛素化分析。
Thr66的磷酸化状态与Smad3的稳定性直接相关
为了确定Thr66磷酸化的生理意义，我们首先比较了野生型Smad3、缺磷突变Smad3（T66V）和磷酸化突变Smad2（T66D）的蛋白质稳定性。当相同数量的每个DNA构建物在293T细胞中表达时，Smad3（T66V）蛋白要稳定得多，因此基础水平高于野生型Smad3。另一方面，Smad3（T66D）突变体的表达较差（比野生型低约70%），半衰期显著缩短(). 一贯地，T66D突变体在稳定状态下强烈泛素化，这与T66V突变体非常微弱的泛素化形成对比(). 这些观察结果有力地支持了我们的假设，即通过磷酸化Thr66，GSK3-β直接控制Smad3蛋白的稳定性，而Thr66磷酸化对于Smad3的有效基础降解是必要的，可能也足够了。进一步研究表明，与野生型Smad3相比，Smad3（T66V）表现出适当的亚细胞定位，并与Axin、GSK3-β、Smad4和包含SBE序列的DNA探针具有相同的亲和力（数据未显示）。因此，Smad3（T66V）似乎与野生型Smad3没有区别，只是其蛋白质稳定性增加了。
Smad3（T66V）在介导TGF-β效应中异常活跃
接下来，我们确定这些具有不同蛋白质稳定性的Smad3变体（WT、T66V和T66D）是否会相应地表现出不同的活性水平。在HepG2细胞中，Smad3（WT）的异位表达以剂量依赖的方式导致生长停滞。尽管细胞转染了少量DNA，但Smad3（T66V）表达的这种效果更为明显(). 在293T细胞中进行SBE-Luc报告分析也获得了类似的结果（数据未显示）。因此，Smad3蛋白稳定性的增加确实增强了其整体转录活性。然后，我们对HaCaT细胞进行了创伤愈合试验，并对野生型MEF进行了细胞粘附试验。在这两种情况下，Smad3（T66V）转导的细胞对TGF-β的反应均大于那些转导等量Smad3的细胞。正如预期的那样，Smad3（T66D）的表达在这些实验中总是很低，并且未能引起TGF-β反应性的变化（数据未显示）。
Smad3（T66V）过度活跃。(一)将接种在12孔板中的HepG2细胞转染指定数量的3xFlag-Smad3（WT或T66V）。使用或不使用TGF-β（200 pM）处理细胞12 h，并评估其增殖情况。数据显示为与转染载体的未处理细胞相比的生长抑制百分比。(B类)将等量的载体HA-Smad3（WT）或HA-Smad 3（T66V）转染到GSK3-β野生型（WT）和KO-MEFs中。20小时后，用25 pM TGF-β处理细胞4小时(赖特)定量整合素α5和JunB的蛋白质水平。(C类)SMAD3型−/−用1μg载体对照或3xFlag-Smad3（WT、T66V或T66D）转染MEF。转染后12小时，加入10μM SB-216763或DMSO。在ULB中收集细胞+再过12小时(D类)SBE-Luc报告试验座椅模块组件3−/−MEF公司。转染荧光素酶构建物后，用或不用20 mM LiCl培养细胞24小时(E类)Smad3/Axin/GSK3-β复合物的示意图(正确的)与β-catenin破坏复合物关键成分的比较(左边). 与Wnt不同，TGF-β不分解Axin/GSK3-β复合物。Smad3的快速核移位是由C末端磷酸化而非蛋白质积累引起的。
我们随后询问野生型和突变型Smad3之间的活性差异是否主要由GSK3-β的状态决定，以及GSK3-？是否仅通过T66磷酸化调节Smad3的稳定性/活性。为了回答第一个问题，我们转染了葛兰素史克3-β+/+和葛兰素史克3-β−/−具有相同数量Smad3（WT）或Smad3的MEF，并比较其诱导JunB和整合素α5表达的活性。在葛兰素史克3-β+/+MEF，Smad3（T66V）比Smad3，WT更丰富（因此更活跃），如在其他细胞类型中所见。然而，在GSK3-β-缺失的MEF中，这两种形式的Smad3表达水平相似，活性几乎相同，与Smad3（T66V）介导的活性相当葛兰素史克3-β+/+MEF公司(). 这一结果表明，在缺乏GSK3-β的情况下，Smad3（WT）和Smad3（T66V）之间的区别消失了。为了解决第二个问题，我们将不同形式的Smad3引入座椅模块组件3−/−MEF，以便在不受内源性Smad3干扰的情况下评估其活性。正如预期的那样，当GSK3-β抑制这些细胞时，Smad3（WT）的活性增加，而Smad3和Smad3诱导的反应均未受到影响(). 因此，GSK3-β介导的Smad3稳定性及其靶基因如JunB和整合素α5的调节依赖于Thr66磷酸化。
综上所述，这些数据清楚地表明，GSK3-β对Smad3-Thr66的磷酸化控制着Smad3蛋白在稳定状态下的稳定性，这反过来又预先决定了Smad3的活性。
讨论
Smad2和Smad3在稳定状态下的不同蛋白质稳定性
在这项研究中，我们意外地发现Smad3，而不是Smad2，在稳定状态下被蛋白酶体主动降解。非活化Smad3的快速转换可能反映了细胞需要更严格地控制该蛋白的水平和活性，因为Smad3具有结合Smad2所缺乏的DNA的内在能力，并且Smad3在转化TGF-β信号方面通常比Smad2更具多功能性。事实上，最近有报道称，在大多数哺乳动物细胞中，稳态Smad3的蛋白质水平比Smad2低四到五倍(Clarke等人，2006年). 在机械水平上，Smad3和Axin/GSK3-β之间的选择性相互作用使Smad2和Smad3的这种差异控制成为可能。使用嵌合Smad突变体，我们确认Smad2-MH1结构域干扰Smad-GSK3-β结合，而Smad3-MH1结构区负责稳定状态下的快速蛋白质降解（补充图S8C；数据未显示）。特别是Smad2的剪接亚型Smad2（ΔExon3），其MH1结构域中缺乏独特的30氨基酸插入，因此与Smad3非常相似(Jayaraman和Massague 2000年;Dunn等人，2005年)显示出与Smad3类似的基础降解速率（补充图S8B）。这些结果强烈表明，Smad2-MH1结构域的独特结构是Smad2在稳定状态下高蛋白稳定性的主要原因。
Axin和GSK3-β在Smad3基础代谢中的新作用
通过调控Axin和GSK3-β的功能，我们可以改变Smad3的基础转换率，并证明其在预先确定细胞对TGF-β的敏感性方面的重要性。Axin和GSK3-β不干扰Smad2介导的反应。因此，它们不应影响TGF-β受体、Smad2/4以及Smad2和Smad3共有的其他因子的功能。换句话说，Smad3稳定性的协同调节是Axin和GSK3-β调节TGF-β信号传导活性的一个主要（如果不是唯一的）机制。
据报道，Axin在AXIN1型野生型细胞可以通过向激活的受体提供Smad3在TGF-β途径中发挥积极作用(Furuhashi等人，2001年)或通过招募E3泛素连接酶（Arkadia）增加Smad7（抑制Smad）的降解(Liu等人，2006年). 然而，Axin蛋白的生理水平通常极低，并且Axin生产过剩或AXIN1型基因扩增在正常细胞或癌细胞中尚未见报道。Axin的大量增加可能会产生非生理性、不稳定的影响(Lee等人，2003年). 在本研究中，我们主要依赖于功能丧失分析，令人信服的是，受体激活Smad3并不需要Axin。相反，Axin对TGF-β/Smad3反应的广泛方面产生负面影响。另一方面，Axin介导的Smad7降解在TGF-β信号传导中的生物学相关性(Liu等人，2006年)仍有争议。例如，TβRI和Smad2均被Smad7抑制(马萨古埃2000)但它们不受Axin的影响。此外，肿瘤蛋白SnoN最近被证明是Arkadia在TGF-β途径中的主要靶点(Levy等人，2007年). 然而有趣的是，Liu等人（2006）表明Wnt-1处理降低了Smad7的泛素化，而我们的数据表明Smad3的稳定性和活性不受Wnt-3A的影响（补充图S9A、B、E）。研究得出的不同结论可能是Liu等人（2006）我们的研究可能代表Axin功能的不同模式，涉及不同的分子机制。无论如何，之前报道的Axin在TGF-β信号转导中的积极作用可能仅次于Axin的抑制功能，正如我们广泛的生化和生物学分析所证明的那样，这在生理上更具相关性。
GSK3-β对Thr66的磷酸化
GSK3-β调节大量蛋白质的降解或蛋白水解（有关综述，请参阅Cohen和Frame 2001;Jope and Johnson 2004年). 我们对GSK3-β也调节Smad3降解的证明进一步支持了该激酶作为信号网络集成商的重要性。
GSK3-β在体外和体内磷酸化Thr66处的Smad3，这对于在稳定状态下触发Smad3的泛素化和降解是必要的，也可能是足够的。Thr66与MH1结构域中的几个赖氨酸残基接近，这些赖氨酸被假定参与Smad3的基础水平泛素化(Inoue等人，2004年). 值得注意的是，Thr66在不同物种的Smad3和其他R-Smad中进化上保守，例如Smad1和Smad2。然而，与Smad2一样，未发现Smad1在非刺激细胞中与Axin或GSK3-β发生物理相互作用，其稳态稳定性不受SB-216763的影响(Furuhashi等人，2001年; 数据未显示）。因此，Axin/GSK3-β介导的蛋白酶体降解似乎是Smad3-特异性的。另一方面，序列比对显示Smad2的Thr76对应于Smad3的Thr66。有趣的是，如Smad3（T66D）所示，Thr76（T76D）的类磷酸突变显著破坏了Smad2的稳定性（补充图S8B，D）。然而，由于该残基旁边存在30氨基酸插入物，Thr76的磷酸化可能不会在细胞中发生，因为T76V突变对Smad2的转换没有影响。综上所述，这些结果进一步强调了GSK3-β结合和磷酸化在控制Smad3基础稳定性方面的关键重要性。
值得注意的是，除Thr66外，我们发现Smad3连接区的Ser204在体内外也被GSK3-β磷酸化（补充图S7A，B；数据未显示）。其他Smad中没有对应的Ser204的GSK3位点。该位点和/或其假定启动位点Ser208的突变并未阻止Smad3的基础降解（补充图S8A；数据未显示），与之前使用Smad3-EPSM突变的报告一致(Sapkota等人，2007年). Ser204已被多种激酶磷酸化，但尚未报道其调节Smad3稳定性(Matsuura等人，2004年,2005;Kamaraju和Roberts 2005). 重要的是，在GSK3-β野生型和KO MEF中，Smad3（WT）和Smad3（T66V）均在Ser204被磷酸化（补充图S7C）。因此，Smad3的稳定性和活性在葛兰素史克3-β−/−细胞并不是由于Ser204磷酸化缺失所致。
很少有例外（例如。，Zeng等人，2005年)，GSK3-β几乎只作用于原磷酸化底物(Cohen和Frame 2001). 由于GSK3-β在Thr66（P）磷酸化Smad3，推测P+4位置的启动位点为Ser70。我们的初步结果表明，体内Thr66磷酸化可能需要Ser70的磷酸化（我们未发表的数据）。有趣的是，CKIα为β-catenin和Gli磷酸化启动GSK3-β，也调节Smad3基础转换和TGF-β信号传导（我们的未发表数据）。如果我们确定CKIα原磷酸化Smad3的Ser70，结果将进一步支持这样的观点，即CKIα和GSK3-β的功能偶联在支架蛋白（例如Axin）的辅助下，通过调节Wnt、Shh、，和TGF-β(Liu等人，2002年;普莱斯和卡尔德龙2002;Zeng等人，2005年).
E3泛素连接酶和Thr66磷酸酶
已发现多种E3泛素连接酶以各种方式调节Smad蛋白(Izzi和Attisano 2006). 我们检查了几个E3连接酶，发现非激活的Smad3不会因SCF的过度表达而进一步泛素化β-TrCP、Smurf1/2或Arkadia（数据未显示）。Levy等人（2007年）最近报道了他们通过筛选289种人E3泛素连接酶的siRNA文库，成功鉴定出Arkadia是TGF-β信号传导的阳性调节因子。类似的方法有望阐明E3连接酶在稳定状态下泛素化Smad3的身份。此外，越来越多的证据表明，蛋白磷酸酶在调节R-Smad功能方面与激酶同样重要。最近发现了几种磷酸酶在尾部和/或连接区对R-Smad进行去磷酸化(Chen等人，2006年;Duan等人，2006年;Knockaert等人，2006年;Lin等人，2006年;Sapkota等人，2006年). 由于经GSK3-β抑制或TGF-β治疗后，Thr66磷酸化逐渐减少(; 补充图S9D），可能存在一种或多种磷酸酶，以抵消激酶并保护Smad3免受降解。鉴定这种磷酸酶肯定有助于扩大我们对TGF-β/Smad3途径调控的认识。
Wnt和APC不影响Smad3在稳态下的稳定性
Axin和GSK3-β下调非激活Smad3的能力让人想起它们在Wnt/β-catenin途径中的负面作用。然而，Smad3在稳定状态下的周转量不受Wnt-3A的影响。此外，与Axin shRNAs不同，Wnt-3A不会使细胞对TGF-β敏感（补充图9A、B、E；数据未显示）。因此，Wnt和TGF-β级联之间的功能性串扰似乎在静息细胞Smad3转换的步骤中没有发生，并且这两条通路的信号特异性得到了很好的维持。与这一概念一致，TGF-β治疗使Smad3与Axin和GSK3-β分离，而不影响β-catenin/Axin/GSK3-β相互作用或β-catening稳定性和转录活性(; 数据未显示）。综上所述，这些观察结果和凝胶过滤分析结果（数据未显示）表明Smad3和β-catenin可能由不同的Axin/GSK3-β蛋白复合物池控制，这些蛋白复合物可能由其分子组成区分(). 事实上，我们注意到与β-catenin降解密切相关的APC并没有调节HaCaT和293T细胞中Smad3的稳定性或活性（我们的未发表数据）。结果表明，β-catenin并不直接参与TGF-β/Smad3诱导的这些细胞系的生物学事件；APC的不同需求表明Smad3和β-catenin的泛素化之间存在机制上的差异。
材料和方法
细胞培养、转染和逆转录病毒感染
先前已经描述了293T、HaCaT和HepG2细胞的培养(Waddell等人，2004年). 不朽的GSK3-β+/+和葛兰素史克3-β−/−MEF（由加拿大安大略省癌症研究所James Woodgett慷慨提供），座椅模块组件3−/−MEF（由旧金山加州大学Rik Derynk善意提供）和Alexander细胞（来自美国型培养物收集[ATCC]）在含有10%FBS（Invitrogen）的DMEM中培养。SNU475细胞（由杜克大学医学中心的Patrick Casey提供）和DLD-1细胞（来自ATCC）在含有10%热失活FBS的RPMI1640（Invitrogen）中生长。HCT116+Chr.3细胞（由国家环境健康科学研究所的Thomas Kunkel提供）在含有10%FBS的McCoy的5A培养基中生长。使用Ca对HepG2和293T细胞进行瞬时转染三（PO4）2沉淀法，同时根据制造商的协议，将Superfect（Qiagen）和SNU475细胞与Fugene 6（Roche）一起转染所有MEF和Alexander细胞。通过转染所需的逆转录病毒构建物和pCL10A-1辅助基因，逆转录病毒（pBabe-puro、pQCXIP和pSuperRetro）被包装在293T细胞中。转染24 h后更换培养基，24 h和48 h后收集上清液，过滤，并与4μg/mL聚溴乙烯（Sigma）混合，然后加入目标细胞。在嘌呤霉素选择（2μg/mL）下保持稳定的细胞群。
质粒、诱变和shRNA
GST-Smad3的全长和片段在别处描述(Waddell等人，2004年). N末端标记的HA-Smad3是通过将Smad3编码序列亚克隆到pcDNA3-HA载体（我们实验室制造）中而产生的。使用QuikChange定点突变方案（Stratagene）引入所有构建物的点突变。诱变引物在补充材料中进行了描述。3xFlag-Ub（WT）是Michael Ehlers（杜克大学医学中心）的一份礼物，最初由Adriano Marcheze和Jeffery Benovic（托马斯杰斐逊大学）赠送。pCAN-hAxin（野生型，myc-tagged）是Patrick Casey的礼物，hAxin-cDNA随后被转移到pBabe-puro和pQCXIP（Clontech）载体中，以产生逆转录病毒。人类GSK3-β的全长mAxin和cDNA由哈佛大学（Xi He）慷慨提供。然后将GSK3-β克隆到pFlag-CMV-2载体（Sigma）中。Axin GID5-6和LP控件是Peter Klein（宾夕法尼亚大学）的礼物。利用Dharmacon和GenScript的网络工具辅助shRNA序列设计，将退火引物连接到pSuper或pSuperRetro载体（Oligoengine）。RNAi靶向序列（意义）在补充材料中进行了描述。
抗体和试剂
根据标准程序，使用合成肽VNTKCI（pT）IPRSLDGR生成兔抗磷酸-Thr66抗血清。整合素α5多克隆抗体由Jun Lin Guan（密歇根大学）提供。以下商用抗体用于免疫印迹：Smad3、Smad2和Axin（Zymed）；Flag（M2）和γ-微管蛋白（Sigma）；P-Smad2、P-Smad3（S423/425）和P-β-catenin（S33/37/T41）（细胞信号）；以及HA（F-7）、GST（B-14）、c-myc（9E10）、β-catenin（E-5）、JunB（c-11）、PAI-1（c-9）、Smad1/2/3（H-2）、CTGF（L-20）、NET1（N-17）、ATF3（c-19）、泛素（P4D1）、GSK3-α/β（0011-A）、纤维结合蛋白（EP5）、p15（c-20）和P-Erk（E-4）（圣克鲁斯生物技术）。用于免疫沉淀的抗体为Smad3（I-20）、Axin（S-20）、HA（Y-11）、GSK3-β（L-17）（圣克鲁斯生物技术）和Smad3。TGF-β1从R&D Systems获得。从指定公司购买了以下抑制剂：SB-431542和SB-216763（Tocris）；U0126（细胞信号）；利斯科维汀（钙生物化学）；CHX和LiCl（西格玛）；和MG-132（生物分子）。
免疫印迹和免疫沉淀
使用通用分析缓冲区（ULB）的协议+)已被描述(Waddell等人，2004年)，并在必要时进行了以下修改。为了检测Smad3泛素化，在含有10 mM NEM（Sigma）的RIPA缓冲液（50 mM Tris，150 mM NaCl，1%Triton X-100，0.1%SDS，1%脱氧胆酸钠，含蛋白酶和磷酸酶抑制剂）或SDS裂解缓冲液（Lo和Massague）中采集细胞。为了检测Smad3 Thr66磷酸化，25 nM微囊藻毒素（Sigma）也包含在细胞裂解缓冲液中。λ-磷酸酶（新英格兰生物实验室）按照制造商的方案对只含有蛋白酶抑制剂而不含有磷酸酶抑制剂的细胞裂解液进行处理。通过ImageJ软件对结果进行量化(网址：http://rsb.info.nih.gov/ij).
转录报告分析
SBE-Luc和MBE-Luc是新华丰（贝勒医学院）赠送的礼物。ARE-Luc和FoxH1由Anita Roberts（美国国家癌症研究所）提供。已报告PAI-1-Luc（p800LUC）(Frederick等人，2004年). 所有实验基本上按照前面所述一式三份进行(Waddell等人，2004年)，数据表示为平均值±SD。
细胞增殖试验
细胞增殖由[三H] -胸腺嘧啶掺入（如所述）(Frederick等人，2004年). 具体来说，将细胞接种在12孔板中，一式三份，并在正常条件下生长，汇合度不超过40%。然后用TGF-β或载体处理细胞12–24小时，并用5μCi/mL标记[三H] -治疗最后4-5小时的胸苷。
细胞迁移/伤口愈合测定
细胞以高密度电镀成12孔板并生长到汇合处。划痕是用无菌的P-200微量移液管在每个孔的中间进行的。然后用PBS清洗细胞三次，并在含有或不含TGF-β的常规培养基中培养。在PBS清洗后的实验开始和结束时拍摄相同区域的照片。每次至少为每个条件拍摄四个区域的照片，并使用ImageJ计算伤口面积。细胞迁移被定义为治疗过程中每个拍摄区域的伤口面积减少。结果显示为平均值±标准偏差。
细胞粘附分析
用100 pM TGF-β处理GSK3-β野生型和KO MEF 12–24小时，然后用EDTA（Versine，1:5000；Invitrogen）洗涤并在37°C下培养20分钟。将分离的细胞收集在DMEM（−）中，离心，然后再悬浮在DMAM（−）中。1毫升细胞悬液（2×105细胞）添加到12孔板的每个孔中，并在37°C下培养15分钟。去除培养基后，用PBS轻轻清洗附着的细胞两次，并在室温下用4%多聚甲醛中的甲苯胺蓝O（Sigma）固定24小时。然后用PBS清洗细胞三次，每种情况下至少拍摄四个区域。通过ImageJ计算细胞数。
