图2

线粒体BAX在死亡刺激后改变其碱性和蛋白酶敏感性。(一个)BAX在死亡刺激后变得耐碱。从IL-3（lanes）培养的FL5.12细胞中制备富含线粒体的厚膜1–4)或剥夺IL-3 12小时（车道5–8)，在等渗缓冲区（通道1和2和车道5和6)，或0.1 M Na₂一氧化碳_三，pH 11.5（车道三和4和车道7和8)，并在200000下离心克45分钟以产生上清液(S公司)和颗粒(P（P）). 通过免疫印迹分析这些组分的BAX、BCL-2、细胞色素c氧化酶亚基iv和细胞色素c(B类)NH₂-BAX末端在死亡刺激后进一步暴露。从IL-3（通道）中FL5.12细胞制备的线粒体部分1和2和车道6和7)或剥夺IL-3 12小时（车道3–5、和车道8–10)在等渗缓冲液中培养，并用胰蛋白酶（30μg/ml；lanes）处理2, 4,和5)或蛋白酶K（100μg/ml；保护.K，条车道7、9中，和10)，在4°C下保持20分钟。通过添加30倍重量的大豆胰蛋白酶抑制剂使胰蛋白酶失活，用苯甲基磺酰氟（1mM）使蛋白酶K失活。用抗BAX 651抗体（氨基酸43–61；lanes）进行免疫印迹分析1–4和车道6–9)或抗BAX N20抗体（氨基酸11–30；圣克鲁斯生物技术; 车道5和10). (C类)zVAD-fmk减少IL-3退出后BAX的线粒体膜整合。由IL-3（通道）中保存的FL5.12细胞制备的线粒体部分1, 2, 5,和6)或剥夺IL-3 12小时（车道3, 4, 7,和8)不在（车道1, 3, 5,和7)或存在（车道2, 4, 6,和8)对50μM zVAD-fmk进行12小时的直接分析（车道1–4)或用0.1 M Na萃取后₂一氧化碳_三，pH 11.5（车道5–8)，如中所述一个.