细胞死亡不同。作者手稿；PMC 2007年11月21日发布。
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NIHMSID公司：NIHMS21907
基因表达谱鉴定FKBP39是果蝇幼虫脂肪体自噬抑制剂
，1,2,* ，三 ，4 ，1 ，4 ，2和1
Gábor Juhász
1匈牙利布达佩斯Eötvös Loránd大学普通动物学系
2美国明尼阿波利斯明尼苏达大学遗传学、细胞生物学与发展系
拉斯洛·G·普斯卡斯
三匈牙利塞格德生物研究中心功能基因组实验室
奥尔班·科蒙伊
4匈牙利塞格德塞格德大学遗传学和分子生物学系
巴拉兹埃尔迪
1匈牙利布达佩斯Eötvös Loránd大学普通动物学系
佩特马洛伊
4匈牙利塞格德塞格德大学遗传学和分子生物学系
托马斯·诺伊费尔德
2美国明尼阿波利斯明尼苏达大学遗传学、细胞生物学与发展系
米克洛斯·萨斯
1匈牙利布达佩斯Eötvös Loránd大学普通动物学系
1匈牙利布达佩斯Eötvös Loránd大学普通动物学系
2美国明尼阿波利斯明尼苏达大学遗传学、细胞生物学与发展系
三匈牙利塞格德生物研究中心功能基因组实验室
4匈牙利塞格德塞格德大学遗传学和分子生物学系
*通信地址：美国明尼苏达州明尼阿波利斯S.E.Church St.S.E.Minneapolis，MN 55455，6-160 Jackson Hall 321号，明尼苏打大学GCD系G.J.电话：（612）626-5217传真：（611）626-5652电子邮箱：100sahuj处的ude.nmu - 补充资料
补充信息。
GUID:929C49E8-9F0C-4BAA-9282-D540668906A2
补充表1。
GUID:7FEBD0F2-E6F8-4FD3-882E-27D274DA55F2
补充图1。
GUID:AB5C4FD3-0774-430A-A118-0BF6CC81D65F
补充图2。
GUID:A03D5E04-3CCD-474F-BB41-AEDEB62FB71A
摘要
在果蝇中，脂肪体在幼虫发育结束时经历大规模的自噬，为蛹转变做准备。为了确定参与这一过程的基因，我们进行了微阵列分析。我们发现Atg8同源物、早期自噬结构的外壳蛋白和溶酶体水解酶的mRNA水平上调，与之前的结果一致。编码线粒体蛋白和许多伴侣的基因下调，包括eIF2α激酶抑制剂和肽基-脯氨酸顺反异构酶（PPiase）FKBP39。FKBP39表达的基因操纵可能通过调节转录因子Foxo对自噬产生显著影响。因此，我们发现Foxo突变体不能正确地进行自噬以应对饥饿，并且Foxo的过度表达会诱导自噬。
关键词：自噬，果蝇，FKBP39，Foxo，微阵列
自噬是溶酶体对自身物质的降解。作为一种主要的细胞防御反应，它被酵母对哺乳动物的氮或氨基酸饥饿激活，并通过回收不必要的细胞成分以在合成过程中重复使用来促进细胞或生物体的生存。几十年来，通过电子显微镜研究，主要通路的形态，即宏观自噬（以下简称“自噬”）是众所周知的(1). 作为对饥饿或其他刺激的反应，一个被称为吞噬细胞或隔离膜的膜囊形成并吞噬部分胞浆。在边缘封闭后，出现的双层细胞器被称为自噬体或初始自噬液泡（AVi）。随后与溶酶体融合，形成自溶体或降解的自噬液泡（AVd），在这里发生隔离细胞物质的降解。自噬的过程在所有真核生物中都非常相似，这表明涉及进化保守的一组基因。实际上，大多数Atg公司酵母自噬所需的（自噬相关）基因也存在于多种物种中，包括植物、蠕虫、苍蝇和哺乳动物(2). 尽管核心机制保持不变，但不同门之间的自噬调节必须发生变化，因为它参与多细胞动物的各种细胞过程。自噬除了在饥饿生存中发挥基本作用外，还被认为在细胞死亡、神经变性疾病、衰老、免疫、生长和癌症中发挥作用（有关详细信息，请参阅最近的综述(1，三，4)).
在经历完全变态的果蝇和其他昆虫中，一种称为脂肪体的组织起着储存蛋白质和其他物质的作用，这些蛋白质和物质通过自噬释放出来，在变态和成年早期提供能量和营养(5-8). 脂肪体是人体肝脏的类似物，是一种多基因组织，在三个幼虫期喂养果蝇幼虫时，其质量增长了约200倍。在达到最佳数量后，成熟的幼虫停止进食，并离开食物，寻找合适的地方化蛹。此时，脂肪体经历了大规模的自噬诱导，以下称为发育性自噬。这些变化是由昆虫蜕皮激素蜕皮激素在低浓度保幼激素下引起的(9). 最近的研究表明，蜕皮激素通过下调磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）信号诱导自噬(10).
Tor（雷帕霉素靶点）激酶是细胞生长和自噬的中心调节器。Tor活性的抑制迅速导致生长停滞和自噬的诱导，这可能涉及多重磷酸化和去磷酸化事件(11-13). 在酵母中，许多Atg蛋白的磷酸化状态对雷帕霉素敏感，激酶Atg1的活性受Tor信号调节(14). 另一种潜在的调控机制是诱导自噬所必需的基因，或抑制通常抑制自噬过程的基因。众所周知，编码Atg8（一种早期自噬结构的泛素样外壳蛋白）的基因在饥饿的酵母细胞中上调(15). 其果蝇同源物之一CG32672/Atg8a（以前称为CG1534）的mRNA水平Atg公司基因同源物也显示出对饥饿的反应增加(16).
为了寻找发育自噬过程中调控的基因，我们通过比较取食和游荡三龄幼虫脂肪体的转录谱，进行了微阵列分析。这项分析既证明了进化保守性，又确定了在自噬中具有未知作用的其他基因。对转基因动物中选定基因子集的进一步表征表明，FKBP39是一种自噬抑制剂，其作用可能通过调节转录因子Foxo介导。
结果
1.发育自噬期间转录变化的微阵列分析
为了评估果蝇幼虫脂肪体发育自噬过程中的基因表达变化，我们在喂食自噬的发育诱导前后（从卵中孵化约60小时后，)和游荡（孵化后84小时，，e（电子）)三龄幼虫(6，7). 对样品进行处理，并将cDNA与包含3200个带注释果蝇cDNA的微阵列杂交(17). 在研究的3200个基因中，有1941个基因在脂肪体中表达。显示了在自噬过程中由1.65倍或更高（估计p值<0.025）诱导的57个基因。眼色素生物合成基因的mRNA水平Hn公司增加，这与已知的脂肪体在徘徊阶段合成眼睛色素的作用一致(18). 还诱导了编码储存蛋白Fbp2的基因；这些结果共同为样本采集的正确开发时间提供了控制。编码假定溶酶体水解酶的基因（alpha-EST2、cathD、CG5932、CG1827、CG10992、CG1774）上调，与Lysotracker染色观察到的自噬期间溶酶体室的扩张一致。16只果蝇中的10只Atg公司我们的芯片上有基因同源物，只有CG32672/附件8a根据酵母和以前的果蝇数据，被显著诱导(1，16). 编码另一种功能未知的泛素样蛋白（CG7224）的基因也上调。
FKBP39的过度表达抑制发育和饥饿诱导的自噬，而FKBP39型功能导致比野生型更高的自噬诱导。
a-c公司：脂肪体的Lysotracker染色。喂食早期三龄幼虫时未发现Lysotracker染色(一)，而Lysotracker阳性颗粒（以红色显示）积聚在三龄晚期游荡的脂肪体细胞中(b条). 脂肪体中FKBP39的过度表达抑制Lysotracker阳性颗粒的形成(c（c）)并导致细胞生长受到抑制。通过脂肪体皮质肌动蛋白染色（红色）克隆性过度表达FKBP39，以核GFP（绿色）的共同过度表达为标志，可以更好地观察到这种效果(d日，顶部面板）。下部面板显示DNA染色。请注意，FKBP39过度表达细胞的细胞核（绿色箭头）大小相同，但包含的DNA少于周围的野生型细胞（蓝色箭头）。电子-传真：电镜图像显示三龄幼虫的脂肪体细胞。发育自噬导致野生型幼虫中大的自溶体积累（箭头所示e（电子）)而在同一年龄段过度表达FKBP39的脂肪体细胞中只发现小的自溶体（如箭头所示如果). 注意f（星号）中的核仁大大增大，这也是由FKBP39过度表达引起的。克显示Lysotracker发育自噬数据的定量。h-j型：脂肪体的Lysotracker染色。饥饿4小时诱导三龄早期幼虫脂肪体细胞自噬(小时，与a）相比。FKBP39的脂肪体特异性过表达也阻止了这种饥饿反应(我). PTEN的共表达可恢复FKBP39抑制的自噬(j个).k个显示Lysotracker数据的量化。l编号：脂肪体的Lysotracker染色。短时间（80分钟）饥饿诱导FKBP39突变幼虫脂肪体的自噬水平高于野生型对照(m、 n个，与相比我).o个显示了结果的量化。
面板a-d、h-j和l-n的放大倍数相同（200x）。面板e-f的放大倍数相同，条形等于1 um。在电子显微镜图像中，N表示原子核。误差条表示面板g、k和o中的标准偏差。基因型：UASFKBP39型/+（a、b、e、h），cgGal4/UASFKBP39（c、f、i），hsFLP；UASFKBP39/+；行动>CD2>Gal4，UASGFPnls/+（d） ，cgGal4/UASFKBP39、UASPTEN（j） ，w个1118（l） ，w个1118; 5-HA-2590/Df（3R）执行6194（m） ，w个1118; 5-HA-2440/Df（3R）执行6194（n） ●●●●。
表1
果蝇幼虫脂肪体发育自噬期间基因上调。
表中显示，在发育自噬期间，基因上调了至少1.65倍，估计p值<0.025。在第一列中，基因名称如Flybase中所列(21); 第二列显示了相对于第三龄早期（自噬开始之前）的褶皱诱导；第三列显示所列基因的功能、家族或已知域。
| 基因名称 | 折叠更改 | 功能/系列/域 | p值 |
|---|
| Cyp9f2 | 3.95 | 氧化还原酶（细胞色素P450） | <0.0001 |
| 肉片 | 3.54 | 丝氨酸型内肽酶 | <0.0001 |
| Fbp2公司 | 3.08 | 营养库；氧化还原酶 | <0.0001 |
| α-Est2 | 2.77 | 羧酸酯酶 | <0.0001 |
| CG7224号 | 2.73 | 泛素样 | <0.0001 |
| Gs1级 | 2.53 | 谷氨酸合成酶 | 0.0002 |
| CG12262号 | 2.52 | 酰基辅酶A脱氢酶 | 0.0002 |
| 组织蛋白酶d | 2.29 | 组织蛋白酶D | 0.0007 |
| 注册号-2 | 2.28 | 卤酸脱氢酶类水解酶 | 0.0007 |
| CG9431号 | 2.16 | 免疫球蛋白样 | 0.0014 |
| CG6440型 | 2.16 | 神经肽激素 | 0.0014 |
| syt公司 | 2.16 | 钙依赖性磷脂结合 | 0.0015 |
| CG18418号 | 2.14 | 膜载体 | 0.0016 |
| CG6957号 | 2.14 | 葡萄糖胺-6-磷酸脱氨酶 | 0.0017 |
| Cyp4d2型 | 2.12 | 氧化还原酶（细胞色素P450） | 0.0018 |
| CG7523号 | 2.12 | 未知的 | 0.0018 |
| l（2）k09913 | 2.11 | 未知的 | 0.0019 |
| Hn公司 | 2.06 | 眼睛色素生物合成 | 0.0026 |
| CG15309号 | 2.06 | 叶状蛋白 | 0.0026 |
| CG12428号 | 2.02 | 乙酰转移酶 | 0.0034 |
| CG5932型 | 1.99 | 三酰甘油脂肪酶 | 0.0039 |
| 哭泣 | 1.97 | G蛋白偶联光感受器活性 | 0.0045 |
| CG1827号 | 1.97 | 氨基水解酶 | 0.0046 |
| CG13603号 | 1.94 | 未知的 | 0.0053 |
| CG30053型 | 1.91 | 未知的 | 0.0061 |
| CG12323号 | 1.91 | 内肽酶（蛋白酶体b5亚单位） | 0.0061 |
| CG9813型 | 1.90 | 未知的 | 0.0065 |
| CG7221号 | 1.90 | 氧化还原酶 | 0.0066 |
| CG18787号 | 1.89 | 未知的 | 0.0069 |
| CG4600型 | 1.89 | 乙酰辅酶A酰基转移酶 | 0.0071 |
| 配对2 | 1.88 | 翻译阻遏 | 0.0073 |
| CG8252号 | 1.88 | 未知的 | 0.0075 |
| 附件8a | 1.86 | 自噬体的外壳蛋白 | 0.0083 |
| CG2767型 | 1.86 | 乙醇脱氢酶 | 0.0084 |
| 克伦 | 1.84 | 表皮生长因子 | 0.0094 |
| CG12292号 | 1.84 | 未知的 | 0.0095 |
| CG5738号 | 1.84 | RNA聚合酶II转录因子 | 0.0097 |
| 普华永道 | 1.83 | 光感受器脱氢酶 | 0.0101 |
| 计算17597 | 1.82 | 酰基辅酶A C-酰基转移酶 | 0.0108 |
| CG4669号 | 1.77 | 未知的 | 0.014 |
| CG10007号 | 1.77 | 未知的 | 0.0144 |
| CG1236号 | 1.76 | 磷酸甘油脱氢酶 | 0.0149 |
| CG9286型 | 1.76 | 未知的 | 0.015 |
| Trn-SR公司 | 1.74 | 核进口 | 0.0163 |
| 功能T6 | 1.73 | 岩藻糖基转移酶 | 0.0178 |
| CG10992号 | 1.73 | 组织蛋白酶B | 0.0179 |
| CG7789号 | 1.72 | 磷脂酰肌醇磷酸酶 | 0.0182 |
| CG10433号 | 1.72 | 防御反应 | 0.0187 |
| CG32698号 | 1.71 | 碳酸盐脱水酶 | 0.0191 |
| CG12428号 | 1.71 | 乙酰转移酶 | 0.0194 |
| CG8449号 | 1.71 | 未知的 | 0.0196 |
| 奥特 | 1.71 | 层粘连多肽2 | 0.02 |
| CG14629号 | 1.70 | 未知的 | 0.0202 |
| fng公司 | 1.70 | 糖基转移酶 | 0.0202 |
| CG1774号 | 1.70 | 脂质水解酶 | 0.0206 |
| CG12063号 | 1.69 | 内皮素/CD105抗原，PAN结构域 | 0.0215 |
| CG5721号 | 1.68 | 未知的 | 0.023 |
39个基因的表达显著下调。其中，可鉴定出两个主要亚群：编码线粒体蛋白的基因（CG17896、CG9140、ND42、CG6459、TRAP1、CG10664、Hsc70-5、CG2249、mRpL24、Marf）和细胞伴侣基因（CG8286/dIPK、CG4164、RAP1、Hsc70-5、FKBP39）。的表达式级别鲍德斯波特，编码跨膜蛋白，也显著降低().
表2
果蝇幼虫脂肪体发育自噬期间基因下调。
在发育自噬期间，基因列表下调了至少1.65倍，估计p值<0.025（参见图例详细信息）。
| 基因名称 | 折叠更改 | 功能/系列/域 | p值 |
|---|
| 秃子 | −4.69 | 跨膜蛋白 | <0.0001 |
| CG17896号 | −2.73 | 甲基丙二酸半醛脱氢酶 | <0.0001 |
| CG3835型 | −2.71 | 氧化还原酶 | <0.0001 |
| CG14683号 | −2.56 | 甲基转移酶 | 0.0001 |
| CG5171型 | −2.37 | 海藻糖磷酸酶 | 0.0003 |
| CG9140型 | −2.37 | NADH脱氢酶（泛醌） | 0.0003 |
| 56号 | −2.15 | 小核核糖核蛋白复合物亚基 | 0.0011 |
| CG8286号 | −2.15 | 果蝇蛋白激酶抑制剂（dIPK） | 0.0011 |
| CG4164号 | −2.10 | 热休克蛋白40 | 0.0015 |
| CG10340型 | −2.08 | 可能参与蛋白质复合物组装 | 0.0017 |
| 42荷兰盾 | −2.08 | NADH脱氢酶（泛醌） | 0.0017 |
| CG6459号 | −2.00 | 线粒体糖蛋白 | 0.0027 |
| CG3136号 | −1.97 | 碱性亮氨酸拉链转录因子 | 0.0033 |
| TRAP1型 | −1.95 | 线粒体Hsp90 | 0.0038 |
| CG6164型 | −1.92 | 未知的 | 0.0044 |
| CG9249型 | −1.92 | 甲基转移酶 | 0.0045 |
| CG18316号 | −1.89 | 未知的 | 0.0055 |
| CG10664号 | −1.89 | 细胞色素c氧化酶 | 0.0055 |
| 吃1 | −1.87 | 精氨酰转移酶 | 0.0062 |
| yip7年 | −1.86 | 丝氨酸型内肽酶 | 0.0065 |
| CG8732号 | −1.85 | 醋酸酯-CoA连接酶 | 0.0069 |
| Hsc70-5型 | −1.82 | 线粒体Hsp70 | 0.0083 |
| CG15771号 | −1.81 | 未知的 | 0.0087 |
| CG11597号 | −1.80 | 蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶（PP2A-like） | 0.0092 |
| CG3358型 | −1.78 | 核酸酶 | 0.0104 |
| CG2249号 | −1.77 | 细胞色素c氧化酶 | 0.0107 |
| 时间m1 | −1.76 | 原肌球蛋白 | 0.0114 |
| Sc2类 | −1.75 | 未知的 | 0.0123 |
| CG17278号 | −1.74 | 蛋白酶抑制剂 | 0.0126 |
| CG8664型 | −1.73 | 未知的 | 0.0137 |
| 乔恩·65Aiii | −1.71 | 丝氨酸型内肽酶 | 0.0151 |
| 百万卢比24 | −1.69 | 线粒体大核糖体亚基 | 0.017 |
| 马尔夫 | −1.69 | GTPase和dynamin域 | 0.0172 |
| CG3902型 | −1.69 | 酰基辅酶A脱氢酶 | 0.0175 |
| Cyp310a1细胞 | −1.68 | 氧化还原酶（细胞色素p450） | 0.0186 |
| His2Av公司 | −1.68 | DNA结合（组蛋白） | 0.0187 |
| eIF-4G | −1.67 | 翻译起始因子 | 0.0198 |
| FKBP39型 | −1.66 | 肽基丙基顺反异构酶（PPiase） | 0.0208 |
2.量化选定基因子集的表达变化
通过定量实时PCR（QRT-PCR）选择可能参与自噬的基因子集进行进一步分析，以确认并更准确地定量mRNA表达水平的变化。此外，我们还分析了芯片上没有表达的几个基因的表达，包括托尔，CG12334/Atg8b，和CG15283，它编码一种与CG7224高度相似的泛素样蛋白。
如所示，这些数据与微阵列分析结果密切相关，并进一步证实了两个Atg8同源物的强上调(CG32672/附件8a：6,96x和CG12334/Atg8b：3,53x）和组织蛋白酶D(计算1548：2,14x），一种著名的溶酶体水解酶。我们测试的两个泛素相关基因也被诱导(CG7224号：3,73x和CG15283号：4.62倍）。Tor激酶mRNA水平没有改变，而编码细胞伴侣FKBP39的基因（39kDa的FK506结合蛋白(19))和CG8286/dIPK（果蝇蛋白激酶抑制剂(20))和跨膜蛋白Baldspot(21)受到强烈压制(FKBP39型：6.73倍，CG8286/dIPK公司：4,92x，和秃子：9,91x压制）。
表3
发育自噬过程中一组选定基因表达的实时定量PCR分析。
QRT-PCR分析用于确认和进一步量化微阵列实验中的表达变化，也用于分析芯片上没有物理表示的基因。基因名称列在第一列；第二列显示了基于微阵列实验的折叠变化；第三列显示了基于QRT-PCR的折叠变化。有关详细信息，请参阅文本。
| 基因 | 微阵列 | QRT-PCR |
|---|
| 附件8a | 1.86 | 6.96 |
| CG15283号 | 非芯片 | 4.62 |
| CG7224型 | 2.73 | 3.73 |
| 附件8b | 非芯片 | 3.53 |
| 组织蛋白酶d | 2.29 | 2.14 |
| 托尔 | 非芯片 | 无变化 |
| CG8286/dIPK公司 | −2.15 | −4.92 |
| FKBP39型 | −1.66 | −6.73 |
| 秃子 | −4.69 | −9.91 |
3.转基因动物中候选自噬相关基因的分析确定FKBP39为自噬抑制剂
为了确定所选基因在自噬中的调节作用，我们使用Gal4-UAS系统进行了过度表达研究。我们测试的大多数基因的过度表达产生了不同Gal4驱动因子的不同表型，但对自噬没有影响(补充表1). 例如，当在脂肪体或整个动物中表达cathD、Atg8a、Baldspot和dIPK时，它们的表达既不会诱导也不会抑制发育自噬。
与上述结果相反，FKBP39（一种肽基丙基顺反异构酶（PPiase）的脂肪体特异性过表达对发育自噬有显著影响。在过度表达FKBP39的游荡幼虫的脂肪体细胞中观察到极少的自溶体，并且这些自溶体也小于野生型动物(，如果，与相比，e（电子）; 另请参见用于结果的量化）。有趣的是，FKBP39的过度表达也抑制了细胞生长。过度表达FKBP39的脂肪体细胞的平均大小为野生型邻近细胞的43±21%(). 过度表达的细胞DNA含量也较低，表明内复制延迟。细胞核与野生型细胞的细胞核大小大致相同，这可能是由于细胞核大大增大所致(，另请参见).
我们接下来测试FKBP39的过度表达是否对饥饿诱导的自噬有影响。早期三龄幼虫在蔗糖溶液中饥饿4小时，导致幼虫脂肪体细胞中溶菌酶阳性自溶体的强烈积聚(13)(，与相比). FKBP39在脂肪体细胞中的过度表达极大地抑制了饥饿动物自噬的诱导(; 另请参见用于结果的定量），类似于发育性自噬的情况。
最后，我们测试了FKBP39型利用突变株系影响自噬功能5-羟色胺2590和5-HA-2440型这些低形态突变体在5’非翻译区的P元件插入FKBP39型虽然我们无法观察到这些突变体中的异位自噬诱导（未显示），但我们发现这些幼虫在短暂的80分钟饥饿后表现出比野生型对照组更高的自噬水平(，请参阅用于量化结果；p=0.0015-HA-2590/Df（3R）执行6174，p=0.0065-HA-2440/Df（3R）执行6174).
4.PTEN的共表达可恢复FKBP39抑制的自噬
为了确定FKBP39可能通过的信号转导途径，我们测试了几个先前报道受FKBPs影响的信号级联(22，23). Ras（通过过度表达野生型、高活性或显性阴性Ras或野生型Raf）、蛋白激酶A（通过过度表现野生型PKAc或其抑制剂PKI或突变PKAr）或S6激酶（通过过度表示高活性S6K）信号对发育自噬没有影响，Lysotracker染色分析显示，FKBP39过度表达的脂肪体中没有恢复自噬（未显示）。Ras信号被认为参与其他系统自噬的诱导，FKBP39抑制Ras介导的MAPK激活(补充图1a)，我们通过产生功能丧失的a的体细胞克隆来分析自噬Ras公司脂肪体无突变。尽管这些细胞比周围的野生型细胞稍小，但显示出正常的发育自噬诱导(补充图1b)证明Ras本身在苍蝇脂肪体中不需要自噬。
与上述结果相反，PTEN（一种对抗I类PI3K信号传导的磷酸酶）的过度表达恢复了FKBP39表达的脂肪体细胞中饥饿诱导的自噬(，另请参见用于结果的量化）。不幸的是，在这种情况下，我们无法测试发育自噬，因为这两种基因在脂肪体中的同时表达会导致三龄期延长，并最终致死，这可能是由于这两种蛋白质的累积生长抑制作用。
5.FKBP39的自噬抑制作用可能是通过抑制Foxo介导的，Foxo是一种新的自噬调节因子
上述结果表明，FKBP39可能通过激活PI3K来抑制自噬，PI3K是饥饿诱导和发育自噬的有效抑制剂(10，13). 为了验证这一点，我们分析了FKBP39过表达克隆中PI3K信号的水平。GFP-pleckstrin同源（PH）结构域融合蛋白是PI3K活性的公认标记(24). 在PI3K活性高的细胞中，膜脂磷脂酰肌醇-3,4,5-磷酸的积累导致GFP-PH标记物定位于细胞膜。我们发现，与周围的野生型细胞相比，FKBP39过度表达导致信号的膜与细胞质比率降低(). 这一结果表明，FKBP39过度表达细胞中的PI3K活性降低，因此不考虑FKBP38通过上调PI3K信号抑制自噬的可能性。
FKBP39过度表达的自噬抑制作用可能由Foxo的抑制介导。
一：与克隆性过度表达FKBP39的摄食幼虫脂肪体细胞中的细胞质信号相比，用作PI3K活性指示物的探针（GFP-PH，绿色）的膜定位大大降低（以点状myrRFP表达标记，红色）。a’单独显示绿色通道。b条野生型中三龄幼虫脂肪体的Foxo染色（红色）显示细胞核和细胞质标记。在过度表达FKBP39（和GFP，绿色）的细胞中，Foxo的核池被完全消除，只看到细胞质信号。b'分别显示红色通道。c（c）：的null突变福克斯公司(福克斯公司21/福克斯公司25)Lysotracker染色（红色）显示，强烈减少幼虫脂肪体中饥饿诱导的自噬（与).d日：FKBP39在福克斯公司空突变背景导致的减少类似于福克斯公司突变或FKBP39单独过度表达，也通过面板中Lysotracker数据的定量显示e.f公司：激活型Foxo的过度表达™强烈诱导摄食幼虫脂肪体细胞的自噬。插图显示了过度表达细胞中的红色通道（Lysotracker染色）（用黄线表示）。面板a的放大倍数为300倍，面板b-d和f的放大倍数是200倍。误差条表示面板e的标准偏差。基因型：hsFLP；UASFKBP39/UASmyrRFP；动作>CD2>Gal4，tGPH/+（a） ，hsFLP；UASFKBP39/+；行动>CD2>Gal4，UASGFPnls/+（b） ，福克斯公司21/福克斯公司25（c） ，cgGal4/UASFKBP39；福克斯公司21/福克斯公司25（d） ，hsFLP；无人机氧™/+; 行动>CD2>Gal4，UASGFPnls/+（f） ●●●●。
作为PI3K信号的另一种潜在测量方法，我们还检测了转录因子Foxo在FKBP39过度表达克隆中的定位。PI3K信号升高导致Foxo被丝氨酸/苏氨酸激酶Akt磷酸化(25). 为了应对这种磷酸化事件，Foxo改变了其细胞内定位：核池移位到细胞质(25). 野生型中三龄脂肪体细胞显示中等水平的核Foxo。FKBP39的过度表达导致Foxo几乎完全被排除在细胞核之外()尽管这些细胞中PI3K信号水平降低。这一结果表明FKBP39的自噬抑制作用可能通过抑制Foxo介导。
为了验证这个假设，我们在一个福克斯公司无效突变背景。的空突变福克斯公司单独一种药物强烈干扰了饥饿诱导的自噬，这首次表明了Foxo在这一过程中的作用(，与相比). FKBP39在福克斯公司与突变相比，空白突变背景未能进一步抑制自噬福克斯公司或FKBP39单独过度表达(，与图相比和分别为；另请参见这表明FKBP39的自噬抑制作用至少部分由Foxo的抑制介导。
最后，我们还表达了激活版本的Foxo（Foxo™) (25)在摄食幼虫的脂肪体细胞中。我们发现福克斯™表达足以强烈诱导自噬，进一步证实了Foxo在调节自噬中的重要作用(). 总之，我们的结果表明，Foxo对于正确诱导自噬是必要和充分的，并且他们确定Foxo是FKBP39作用的相关靶点。
讨论
我们使用含有3200个带注释果蝇cDNA的微阵列来确定在幼虫脂肪体发育自噬时受调控的基因。蛋白产物可能在发育自噬中起作用的上调基因包括各种溶酶体水解酶，如组织蛋白酶D和组织蛋白酶B，以及初始自噬空泡的泛素样外壳蛋白Atg8a和Atg8b。溶酶体系统的扩张通常在自噬过程中观察到，水解酶基因的上调与大量诱导自噬过程中对降解能力增加的需求一致。在果蝇酵母自噬基因的同源物中，附件8a和附件8b表现出诱导作用，类似于饥饿的酵母细胞或果蝇幼虫(1，16). 另外两种小泛素样蛋白的基因，CG7224号和CG15283号，也受到了严格的监管。尽管这些基因在自噬中的潜在作用需要进一步研究，但有趣的是，它们共享一个高度保守的人类同源物，LOC135154号.
编码各种线粒体蛋白的基因被下调，这与大量线粒体在发育自噬过程中降解的观察结果一致(5-7). 如前所述，许多细胞伴侣的mRNA水平也下降了（见下文）。
在观察到自噬诱导的各种实验条件或发育转变下的基因表达谱分析先前已有报道(16，26，27). 虽然不可能将自噬与细胞对环境或发育条件作出反应并诱导自噬的众多其他细胞过程隔离开来，仔细比较我们的结果和这些研究的结果，使我们能够确定最有希望的候选基因，这些基因可能在自噬过程中发挥共同作用。在我们确定的在幼虫脂肪体发育自噬期间诱导的基因中，之前发现有几个基因在蔗糖或无糖饥饿时也被上调，这种情况会在大多数多倍体幼虫组织中引发强烈的自噬反应。这些包括CG7224号，CG15309号，CG13603号，PAIP2号机组，附件8a和CG10992/组织蛋白酶B(16). 此外，除一个基因外，所有这些基因在唾液腺细胞死亡期间也被鉴定为上调，可能涉及自噬(26，27). 自噬体外壳蛋白Atg8的表达被确定为酵母自噬主要途径的速率限制因子(15)，在这些研究中仅显示出轻微的诱导作用。这可能表明，除了自噬的主要途径外，其他形式的溶酶体降解也可能参与唾液腺细胞的死亡。事实上，对果蝇空突变体的研究黑暗的，凋亡基因的苍蝇同源物Apaf-1型表明未能进行组织溶解的突变唾液腺中的自噬不受影响(28)，类似于变形隐藏caspase抑制剂p35的突变体或苍蝇(29).
基因的表达56号，CG8286/dIPK公司，CG4164/Hsp40，CG6459型，Hsc70-5型，CG3902型，His2Av公司和FKBP39型在发育自噬和蔗糖或无糖饥饿时也会减少(16). 其中三个，CG8286/dIPK公司，CG4164/Hsp40和Hsc70-5型在垂死的唾液腺中也被下调(26，27).
在这项工作中，我们选择了三个下调基因进行详细分析。在我们的试验中，其中两种蛋白dIPK（细胞伴侣蛋白）和Baldspot（跨膜蛋白）的过度表达并没有抑制自噬。然而，值得注意的是，尽管Atg8a或cathD在自噬过程中的作用已经得到了很好的证实，但它们的过表达对自噬也没有影响。的确，低形态秃子突变l（3）02281号结果身体颜色比平时深(21). 由于色素颗粒是溶酶体相关的细胞器，这可能意味着白斑病通常抑制这些色素颗粒的生物发生，其突变导致产生更多的颗粒。
CG8286/dIPK是一种细胞伴侣蛋白，包含一个热休克蛋白DnaJ结构域、一个介导蛋白质-蛋白质相互作用的四肽重复序列和一个蛋白质-丙氨酸转移酶结构域。dIPK的人类同源基因是蛋白激酶p58IPK的58kD抑制剂，它强烈抑制eIF2α蛋白激酶PKR和PERK(30，31). eIF2α的磷酸化导致整体翻译抑制。eIF2α蛋白激酶在介导各种应激信号中发挥作用，如双链RNA病毒、γ干扰素、内质网应激或饥饿(32，33). 因此，p58IPK可以促进正常的翻译活性，并且也可以通过eIF2α激酶依赖性和独立机制抑制病毒或TNFα诱导的细胞死亡(34). 酵母eIF2α激酶GCN2是饥饿诱导自噬所必需的，并且PKR公司无效或非磷酸化eIF2α突变的小鼠胚胎成纤维细胞在病毒诱导的自噬中有缺陷(35). 在我们的系统中，dIPK的过度表达没有干扰发育自噬，这表明eIF2α激酶信号不是果蝇这一过程中的主要通路。dIPK的共表达部分挽救了由促凋亡蛋白reaper或caspase droc表达引起的表型（我们未发表的数据），证明了dIPK在进化上的保守抗凋亡功能。
FKBP39是一种小型FKBP，属于果蝇PPiases家族，有21个家族成员(21). PPia酶催化脯氨酸和庞大残基（包括磷丝氨酸或磷苏氨酸）之间肽键的异构化。这个基序是通过脯氨酸导向激酶的作用产生的，其中最具特征的例子是Ras下游的激酶。FKBP也是免疫抑制剂雷帕霉素和FK506的细胞内受体。FKBP12-雷帕霉素复合物与Tor激酶结合，抑制细胞生长并诱导自噬。然而，在没有药物的情况下，这些蛋白质之间没有观察到相互作用。FKBP的生理作用多种多样，尚未完全确定，但已知FKBP12与激酶结合，如转化生长因子-β受体或表皮生长因子受体和磷酸酶-钙调神经磷酸酶，并抑制其活性。FKBP12还与ER受体钙通道结合，通过蛋白激酶A和钙调神经磷酸酶调节钙释放(22).
我们确定FKBP39型作为果蝇发育自噬过程中下调的基因，表明FKBP39可能是自噬的抑制剂。事实上，FKBP39在转基因动物中的过度表达导致了对幼虫脂肪体中发育和饥饿诱导的自噬和细胞生长的强烈抑制，而FKBP39型这种功能导致在短时间饥饿时，自噬的诱导率高于野生型。
PI3K信号是细胞生长和自噬的主要调节器，最近的研究表明，在变态前脂肪体的发育重编程过程中，蜕皮激素通过下调PI3K的信号部分诱导自噬(10). 在该研究中，显性负性蜕皮激素受体的表达抑制了发育自噬，而PTEN（一种拮抗PI3K活性的磷酸酶）的共过度表达逆转了这种作用。我们确定FKBP39是一种潜在的自噬生理抑制剂，其过度表达导致类似于抑制蜕皮激素信号的作用。PTEN的共表达也逆转了FKBP39过度表达对自噬的抑制作用。然而，在更直接的PI3K活性测试中，我们发现FKBP39的过度表达降低了反映PI3K活动的探针的膜定位。这些结果表明，尽管PI3K信号减少，但FKBP39过度表达细胞中的自噬被抑制。此外，他们认为这些细胞体积小可能部分是由于PI3K活性降低。
有趣的是，FKBP39的过度表达导致Foxo的核排斥，这表明FKBP38可能通过抑制Foxo抑制自噬。Foxo是一种由PI3K减少或应激信号增加激活的Forkhead家族转录因子，已被证明分别是生长抑制、增强应激抵抗力和调节这些信号通路引起的寿命延长所必需的(36，37). 的突变Foxo公司与FKBP39的过度表达导致饥饿诱导的自噬减少相似，而激活的Foxo的过度表达足以诱导摄食幼虫脂肪体的自吞噬，这表明Foxo确实参与了自噬的调节。FKBP39在福克斯公司与具有突变背景的细胞相比，该突变背景并没有显著降低自噬福克斯公司突变或FKBP39单独过度表达（p值>0.2）。这一结果表明，FKBP39过度表达对自噬的影响至少部分是由其对Foxo的抑制介导的，正如人们预期的那样，在独立信号通路的情况下，自噬抑制的附加效应。FKBP39过度表达引起的其他效应（增大的核仁和幼虫-幼体前期致死率）不受福克斯公司突变背景（参见，未显示）。
鉴于PPiases的已知靶点（见上文），FKBP39对Foxo定位的影响可能是间接的。在果蝇中，Foxo的定位和活性已被证明通过PI3K/Akt和Jun N末端激酶（JNK）信号的磷酸化来调节(25，37). 根据我们的研究结果，虽然FKBP39可能独立于PI3K影响Akt，但PI3K信号不太可能介导FKBP39-过表达对Foxo定位的影响。因此，JNK信号传导是介导FKBP39过表达的至少一些作用的有希望的候选者(23)特别是考虑到FKBP39过度表达对Ras下游激酶的强烈影响（参见补充图1a），这些激酶与JNK家族激酶密切相关。这个问题显然值得进一步研究。
总之，我们已经确定了果蝇幼虫脂肪体发育自噬期间调控的许多基因，并且我们已经证明FKBP39型，一个在此过程中下调的基因，编码一个可能的自噬生理抑制剂。我们还确定Foxo是一种新的自噬调节因子，可能介导FKBP39对自噬的抑制作用。
材料和方法
果蝇品系和方法
我们的研究中使用了以下果蝇品系：EP362型（Atg8a），EP2151型（cathD）（塞格德库存中心），UASmyrRFP公司，hs镀锌4，cgGal4公司，GMRGal4公司，实际Gal4，管Gal4，eyGal4，英国国防部（3R）Exel6174（布卢明顿库存中心），5-HA-2590型和5-HA-2440型（由Gunther Reuter提供），FRT82B Ras公司c40b级（由Celeste Berg提供），hsFLP、Act>CD2>Gal4、UASGFPnls和动作>CD2>Gal4，tGPH（由Bruce A.Edgar善意提供），福克斯公司25和福克斯公司21（由Heinrich Jasper和Ernst Hafen善意提供），以及UASFoxo公司™（由Marc Tatar提供）。果蝇保持在室温（23-25℃）。通过将小瓶浸入37°C水浴中1小时来进行热冲击。脂肪体中功能克隆的获得是由FLP重组酶的泄漏表达自发产生的hsFLP； 动作>CD2>Gal4，UASGFPnls/UASFKBP39动物(24). 我们生成了Ras公司热激0～8小时龄基因型胚胎脂肪体中的零突变克隆hsFLP；cgGal4/+；FRT82B、UASGFP/FRT82B、Rasc40b级如预期，没有Ras公司在eyFLP；FRT82B、M（3）95A/FRT82B、Rasc40b型动物。
转基因株系的分子克隆与建立
使用EcoRI和XhoI限制性位点将编码Baldspot、dIPK和FKBP39的全长cDNA（EST#GH11554、LD25575和LD30817，由Miklós Erdélyi善意提供）克隆到pUAST苍蝇转化载体中。结果质粒测序，并使用标准微注射技术注入果蝇胚胎。建立了多个转基因株系，并对每个构建物进行了分析，结果相似。
微阵列、探针制备、杂交、扫描、数据分析。
按照描述进行微阵列的构建和使用(38). 简单地说，用MultiScreen-PCR板（Millipore）纯化果蝇3200个扩增的cDNA插入物，再悬浮在50%二甲基亚砜/水中，并使用MicroGrid总阵列系统（BioRobotics）的16针4×4格式探针在氨基硅烷化玻片（Sigma-Aldrich）上排列。所有克隆都被发现是重复的。杂交前，将载玻片在1×SSC、0.2%SDS、1%BSA中于42°C下封闭30分钟，用水冲洗并用高压空气干燥。对150-200只精心饲养和流浪动物的脂肪体进行人工解剖。在液氮中冷冻脂肪体之前，所有组织（除了嵌入的性腺盘）都被切除。用线性反义RNA扩增法扩增每个样品中15 ug的总RNA，并在逆转录过程中用Cy3或Cy5荧光染料标记，如前所述(39). 将探针混合，在12μl杂交缓冲液（50%甲酰胺，5×SSC，0.1%十二烷基硫酸钠，100 mg/ml鲑鱼精子DNA）中重组，并在90°C下加热1分钟变性后应用于阵列上。盖住玻片，并在42°C下在潮湿的杂交室中培养20小时。杂交后，将阵列在1×SSC（含0.1%SDS）中浸泡并搅拌10分钟，在0.1%×SSC中浸泡10分钟，并在室温下在0.1×SSC内搅拌10分钟。然后在去离子水中短暂漂洗并干燥。使用ScanArray Lite（GSI Lumonics）扫描共焦荧光扫描仪，在绿色激光（532 nm）（用于Cy3标记）和红色激光（660 nm）（对于Cy5标记）下扫描每个阵列，分辨率为10 um。使用GenePix Pro 3.0软件（Axon Instruments Inc.）分析扫描的输出文件。每个点都是通过在图像上自动定位圆圈网格来定义的。确定了从两个通道和每个光斑的局部背景计算的平均和中值像素强度比。确定每个点的平均表达率（MeaR，表示局部背景校正像素强度比的平均值）。数据分析采用微阵列显著性分析（SAM）方法，散射图像可视化采用Microsoft EXCEL软件。
实时定量PCR
在RotorGene 2000仪器（Corbett Research）上使用基因特异性引物和SybrGreen协议进行相对定量逆转录PCR（QRT-PCR），以确认使用微阵列观察到的基因表达变化。在总体积为20 ul的poly（dT）序列存在下，反向转录每个池中20 ug的总RNA。用80 ul水稀释混合物后，将2 ul该混合物用作QRT-PCR中的模板。相对表达率归一化为肌动蛋白。本研究中使用的PCR引物可根据要求提供。所有PCR均分三次进行。
组织学
如前所述，对解剖的幼虫脂肪体进行Lysotracker Red染色、皮质肌动蛋白-球蛋白染色和电子显微镜检查(8，10，13). 抗-Foxo抗体(25)以1:300的稀释度使用。
蛋白质斑点
按照(8)使用稀释度为1:1000的二磷酸化MAPK（Sigma）特异性抗体。
致谢
我们要感谢ZsoltnéPálfia、Mariann Saródy和Emese Léder提供了出色的技术援助，感谢我们在方法部分列出的提供试剂的同事，感谢我们的匿名评审员提出了有益的意见。这项工作得到了向T.P.N.提供的NIH拨款RO1 GM62509和向M.S.提供的匈牙利教育部拨款MEDICHEM 1/047 NKFP的支持。
缩写
| 迪普克 | 果蝇蛋白激酶抑制剂 |
| FKBP39型 | 39kDa的FK506结合蛋白 |
| JNK公司 | Jun N-末端激酶 |
| QRT-PCR | 定量实时聚合酶链反应 |
| PI3K系列 | 磷脂酰肌醇3-激酶 |
| P斜视 | 肽基丙基顺反异构酶 |
| 托尔 | 雷帕霉素靶点 |
工具书类
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