CCAAT/增强子结合蛋白α（C/EBPα）在脂肪生成过程中作为脂肪细胞基因的多效性转录激活物发挥作用(1–三). 事实上，令人信服的证据表明，C/EBPα的表达不仅是(4,5)，但足以触发(6,7)脂肪细胞的分化不需要激素刺激。鉴于C/EBPα在脂肪细胞分化程序中的重要性，本研究对C/EBPβ基因中的调控元件进行了研究(8)和其他实验室(9). 最近的证据(10)表明该基因至少部分受到抑制/去抑制机制的调节。小鼠C/EBPα基因近端启动子的DNaseI足迹分析确定了脂肪生成过程中差异调节的核因子的几个结合位点。其中一个位点是潜在的阻遏物结合位点(8). 该位点位于转录起始位点≈250 bp 5′处，被前脂肪细胞而非脂肪细胞中的核因子所覆盖(8,11)，因此被命名为CUP（C/EBPα未分化蛋白）(11). 在脂肪细胞分化过程中，CUP结合活性似乎随着C/EBPα基因的转录激活而下调(11)增加了CUP作为基因阻遏物的可能性。
最近，我们发现，除了C/EBPα基因近端5′侧翼区域的CUP结合位点（CUP-1位点）外，在5′非翻译区域（GCCGCCG）中还有另一个潜在的结合位点（CUP-2位点），该位点包含相同的核心序列(10). 通过突变C/EBPα启动子-报告子结构中的位点，证明了这两个位点都是抑制所必需的，并表明只有当这两个CUP位点都发生突变时，报告基因的转录才会被解除表达(10). 因此，双CUP位点似乎是必要的，以确保C/EBPα基因在分化前保持在抑制状态。
为了表征CUP并研究其对C/EBPα基因转录的影响，我们着手分离和表达CUP cDNA。由于多次尝试表达克隆CUP cDNA均未成功，我们从3T3-L1前脂肪细胞中纯化CUP，以获得足够的氨基酸序列，用于设计寡核苷酸探针进行文库筛选。在本文中，我们报道了CUP的纯化和蛋白质的部分序列测定。从这个序列信息中，我们发现并验证了CUP实际上是转录因子AP-2α的一种亚型。我们进一步证明，在3T3-L1脂肪细胞中，由C/EBPα基因启动子介导的AP-2α/CUP反抑制报告基因表达。
实验程序
人重组AP-2α1来自Promega，兔抗hAP-2α抗体和兔抗hSp1抗体来自Santa Cruz Biotechnology。CMV-hAP-2α1表达载体由R.Buettner（德国雷根斯堡大学）提供。蛋白质通过Bradford方法测定(12).
细胞培养和诱导分化。
3T3-L1前脂肪细胞在含有10%（vol/vol）小牛血清的DMEM中保存和增殖。诱导冲突后两天（指定为第0天）的细胞分化(13)直到第2天，DMEM含有10%（vol/vol）胎牛血清、1μg/ml胰岛素、1μM地塞米松和0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤。然后用补充有10%胎牛血清和每毫升1μg胰岛素的DMEM喂养细胞2天，之后每隔一天用含有10%胎牛血浆的DMEM。脂肪细胞基因的表达和脂肪细胞表型的获得从第3天开始，到第8天达到最大值。
电泳迁移率偏移测定（EMSA）。
EMSA的执行如前所述(10). 对于竞争实验，在添加放射性标记的寡核苷酸之前，添加50倍的未标记竞争对手寡核苷酸。小鼠C/EBPα启动子的CUP-1位点寡核苷酸的序列（斜线表示分隔连接子序列）为GATC/GGAGGCCGCCGAGGG/。人C/EBPα启动子CUP-1位点寡核苷酸序列(14)用于EMSA的是GGCGACGCGCGGCCGGGGGGCGGGGAGT（图。). 共有野生型和突变型AP-2结合位点寡核苷酸，即GATCGAACTGCCCCGCGGCCCCGT和GATCGACCGCTT公司GCGGCCCCGT分别来自Santa Cruz Biotechnology。核提取物是通过修改NUN方案制备的，如前所述(10). 在线性响应范围内，用磷成像仪定量蛋白质复合物的形成；为每个净化运行建立了CUP结合活性的任意单位（例如，表中所示的运行)促进净化步骤之间的活性比较。
表1
| 步骤 | 蛋白质，μg | 活动，任意单位 | 比活度，单位/μg | 收益率，% | 纯化，-倍 |
|---|
| 细胞* | 80,000 | — | — | — | — |
| 核提取物 | 17,900 | 10,500 | 0.59 | 100 | 1 |
| DNA-纤维素 | 200 | 7,350 | 37 | 70 | 63 |
| CUP-1亲和矩阵 | 0.4 | 4,200 | 10,500 | 40 | 17,800 |
小鼠和人类C/EBPα基因启动子CUP-1结合位点区域的核苷酸序列。小鼠C/EBPα基因启动子中带下划线的碱基表示前脂肪细胞核提取物印有DNaseI足迹的区域(8)或rAP-2α1（M.-S.J.和M.D.L.，未发表的结果）。上覆的基底表示AP-2一致序列（-GCCNNGGC或G）。粗体字母表示人类C/EBPα基因启动子中的碱基(14)与小鼠基因中的足迹不同。
从3T3-L1前脂肪细胞中纯化CUP。
所有程序均在4°C下进行。将合成的CUP-1结合位点寡核苷酸（GATC/CAGGCGCCGGGGGG/）寡聚，以产生5到10个mers，这些mers与CNBr活化的Sepharose 4B（Pharmacia）偶联，即22μg寡核苷酸/ml基质，如Pharmaccia手册中所述。将来自200个10cm单层的2天后（第0天）3T3-L1前脂肪细胞的核提取物（见上文）调节至100mM KCl（在含有40mM Tris-HCl/1mM DTT/0.5mM苯甲基磺酰氟的缓冲液D中，pH 7.5），并在100000×克持续45分钟；将上清液吸附到8ml小牛胸腺DNA-纤维素（Sigma）中过夜，倒入1×8-cm柱中，并用20柱体积的含有100mM KCl的缓冲液D洗涤。通过定量EMSA监测各组分的CUP活性。通过梯度洗脱，CUP结合活性在≈450 mM KCl处以单峰形式洗脱。将含有最大CUP活性的组分混合，在PD-10柱（Pharmacia）上脱盐，与poly[d（a-C）/d（G-T）]（0.1μG/μG蛋白质）混合，然后在含有100 mM KCl的缓冲液d中用0.5 ml CUP结合位点亲和矩阵平衡过夜。将混合物倒入0.5×1-cm的色谱柱中，用相同的含KCl的缓冲液洗涤，然后进行梯度洗脱（100–700 mM KCl），CUP活性在≈400 mM KCl洗脱。将亲和色谱的组分在40 V下进行EMSA或SDS/PAGE（10%丙烯酰胺）14-16 h，然后SDS凝胶被银染（图。B类).
结合位点寡核苷酸亲和层析纯化CUP。(一)通过DNA-纤维素层析纯化的CUP应用于CUP-1结合位点寡核苷酸-Sepharose柱，并以KCl梯度（□）进行洗脱。用定量EMSA监测洗脱部分中的CUP结合活性（•）。(B类)对50μl选定部分进行SDS/PAGE，然后对凝胶进行银染色。W公司（f）指柱的最终清洗，S指起始材料（来自DNA-纤维素色谱的混合组分），F指CUP-1结合位点亲和柱的流通体积，STD指分子质量标准。箭头表示50-kDa频带。
CUP色氨酸肽的氨基酸序列和质量分析。
含有CUP结合活性峰值的组分（图。一将组分27–31）混合，进行SDS/PAGE，在聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（ProBlott，Applied Biosystems）上印迹，并用考马斯蓝染色。切除50-kDa带并还原，然后用异丙基乙酰胺烷基化(15)然后在37°C下用0.2μg胰蛋白酶（冷冻Promega改性）在20μl含有0.5%Zwittergent 3–16（Calbiochem）的0.05 M碳铵中消化17小时(16). 肽在C18毛细管柱（LC填料）上使用原型毛细管梯度HPLC（Waters）分离，具有较小的延迟体积，以便于手工收集组分(17). 溶剂A为0.1%三氟乙酸，溶剂B为含有0.08%三氟乙酸的乙腈。使用0–80%B的线性梯度在60分钟内洗脱肽，并在195 nm处检测。在494型CL-PE-Applied Biosystems测序仪上，使用6 mm微型滤筒，并配备在线毛细管甲状旁腺素分析仪（140D型），对解析良好的峰进行测序。峰值与司法创新使用Nelson Analytical 760接口的软件。对DEC Alpha进行序列解释(18).
对0.2μl分离的HPLC组分进行质量分析，这些组分用于预先制好的基质斑点（5μl 20 mg/mlα-氰基-4-羟基肉桂酸+5 mg/ml硝化纤维素溶于50%丙酮/50%异丙醇）(19)在目标板上。离子通过基质辅助激光解吸/电离和氮激光（337 nm）形成。光谱由PerSeptive Biosystems Voyager Elite飞行时间质谱仪采集，该质谱仪以反射延迟提取模式运行。
Western Blot分析。
将SDS-聚丙烯酰胺凝胶电印在PVDF膜（密理博）上。用化学发光法（Amersham Corp.）检测抗hAP-2抗体和辣根过氧化物酶结合山羊抗兔IgG（Sigma）作为二级抗体，对膜进行了检测。
转染。
将分化的3T3-L1脂肪细胞瞬时共转染（磷酸钙沉淀法；参考文献。20)在第3天或第4天，使用1μg启动子-报告子构建物，其中包含343bps的5′-侧翼序列和pGL3-BA荧光素酶或无启动子载体中C/EBPα基因的整个5′-非翻译区(10)以及10μg CMV-hAP-2α1表达载体(21)或缺乏AP-2α1 cDNA插入的控制载体。在培养48小时后，制备细胞提取物并测定荧光素酶活性。
结果和讨论
CUP的纯化和色氨酸的序列分析。
使用与C/EBPα基因中CUP-1结合位点相对应的寡核苷酸探针定量EMSA来监测纯化过程中的CUP活性。对3T3-L1前脂肪细胞（通常为200 10-cm细胞单层）的核提取物进行DNA-纤维素层析。CUP与该基质的结合异常紧密，洗脱需要≈450 mM KCl，导致≈60倍的纯化（表). 将含有最高CUP活性的DNA-纤维素柱的馏分混合，应用于CUP-1结合位点寡核苷酸亲和矩阵，并用KCl梯度洗脱。典型的洗脱曲线如图所示。一CUP在≈400 mM KCl时以单峰活性洗脱。活性峰正好对应于≈50kDa的主要银染蛋白（图。B类). 将活性最高的组分（组分27–31）混合，进行SDS/PAGE，将其印在PVDF膜上，并切除含有50-kDa蛋白的膜段，用胰蛋白酶消化。通过HPLC分离后，对几个分辨率良好的胰蛋白酶肽进行Edman氨基酸序列测定和质谱分析。
利用QSQESGLLHTHR和SNSNAVSAIPIN两个肽的序列搜索包含GenBank、Swiss Prot和protein Identification Resource的组合非冗余蛋白质序列数据库。获得了与小鼠AP-2α序列的精确匹配，即分别来自小鼠AP-2β1的氨基酸101-112和185-196的预测胰蛋白酶裂解产物(22,23). AP-2β中未发现这些肽序列(21). 其他七种CUP胰蛋白酶肽的质谱分析与小鼠AP-2α1的氨基酸113-124、218-226、229-236、272-280、316-323、324-334和347-356的预测胰蛋白酶裂解产物的质量完全对应。因此，可以得出结论，亲和层析的CUP活性峰值部分包含小鼠AP-2α的亚型，但不包含AP-2β的亚型。此外，由于CUP的近似分子质量≈50 kDa，而小鼠AP-2α-1、-2、-3和-4的分子质量（基于氨基酸序列）为48、32、47和52 kDa(23)通过亲和层析纯化的50-kDa CUP/AP-2α亚型分别为AP-2α-1、-3或-4。
AP-2α2是一种缺乏反式激活结构域的显性负亚型，其分子量为32 kDa(23)，CUP不能为AP-2α2。然而，应该注意的是，SDS/PAGE经常检测到分子量≈32 kDa的额外银染带，与CUP结合位点亲和矩阵中的50-kDa CUP带共稀释（结果未显示）。因此，CUP复合体中可能存在另一种核蛋白，可能是AP-2α2。目前正在进行研究，以确定脂肪细胞分化过程中AP-2α的哪些亚型表达。
验证CUP是AP-2α异构体。
几行证据证实CUP是AP-2α的亚型。Western blot分析表明，纯化的CUP被针对与人类AP-2α1的C末端氨基酸序列（氨基酸420–437）对应的肽的抗体识别（图。一)小鼠和人类AP-2α1的序列仅在该区域存在一个氨基酸的差异。如图所示。一，通过SDS/PAGE-Western blotting估计的CUP和重组AP-2α1的分子量相似，即≈50kDa。然而，与该抗体的相互作用并不能区分AP-2α亚型（AP-2α-1、-2、-3或-4），因为所有亚型的C末端序列都是相同的(23).
验证CUP是AP-2α亚型。(一)重组hAP-2α1和纯化CUP的免疫印迹。50μl纯化的CUP（来自馏分29；图。一)或10 ng人rAP-2α1经SDS/PAGE（10%丙烯酰胺）处理，然后将凝胶转移到PVDF膜上，并用兔抗hAP-2α抗体进行探测。(B类)人rAP-2α1（rAP2）、第7天脂肪细胞核提取物（A）或第0天前脂肪细胞核提取物（P）与32在存在或不存在免疫前血清（PI）、抗hAP-2α抗血清（AP-2）、抗-hSp1抗血清（Sp-1）或未标记野生型（AP-2，或突变型（AP-2M）AP-2结合位点寡核苷酸的情况下，使用P标记的CUP-1结合位点寡聚核苷酸探针。NE，核提取物。单箭头标识CUP–寡核苷酸探针复合物，双箭头标识抗hAP-2α抗体超移带的位置。
EMSA证实，与前脂肪细胞核提取物形成的CUP/CUP位点寡核苷酸复合物含有AP-2α亚型。前脂肪细胞核提取物和重组AP-2α1，但不包括脂肪细胞核提取物（缺乏CUP），都特异性结合到CUP-1结合位点（图。B类，1–3道）和共识AP-2（结果未显示）寡核苷酸。重组AP-2α1产生两个蛋白质复合物（1区），较慢的对应于全长AP-2αl，较快的来自蛋白质水解产物，也可在Western blots上检测到（结果未显示）。抗-AP-2α抗体，但不是无关抗体（抗Sp1；第6道）或免疫前血清（第4道），会超转移前脂肪细胞核提取物（第5道）或纯化的CUP或重组AP-2α1产生的CUP位点寡核苷酸-蛋白质复合物（结果未显示）。CUP位点寡核苷酸-蛋白质复合物被未标记的共有AP-2位点寡核苷酸竞争，而不是被突变的共有AP-2位点寡核苷酸竞争，这表明了结合的特异性（通道7和8）。
早期的研究(8)表明C/EBPα基因近端启动子内的CUP-1位点是3T3-L1前脂肪细胞核提取物的DNaseI足迹，而不是脂肪细胞。与上述证据一致，即AP-2α是前脂肪细胞中在该位点结合的DNA结合蛋白，rAP-2α1也覆盖该位点（结果未显示）。
本实验室之前的调查(10,11)揭示了脂肪细胞分化过程中CUP结合活性降低与C/EBPα基因转录速率增加之间的反向动力学关系。为了确定CUP/AP-2α蛋白表达的减少（可能通过CUP/AP-3α基因转录的减少）是否可以解释CUP结合活性的降低，在脂肪细胞分化过程中对这两个过程进行了监测。如图所示。 一和B类诱导分化后（第0天），CUP结合活性和AP-2α蛋白水平分别迅速协调下降，到第4天几乎检测不到。此外，快速分裂的3T3-L1前脂肪细胞（第-4天）缺乏CUP蛋白和结合活性，但当细胞在汇合处生长受阻时（第-2天），结合活性显著增加。综上所述，这些发现提供了令人信服的证据，证明CUP是（或含有）AP-2α-1、-3或-4。
脂肪细胞分化过程中AP-2α和CUP结合活性的变化。(一)3T3-L1前脂肪细胞分化过程中核提取物的CUP结合活性。使用CUP-1结合位点寡核苷酸作为标记探针，对指定日期制备的核提取物进行Western blot分析或EMSA。D-4指增殖的3T3-L1前脂肪细胞；D-2和D0是指融合前脂肪细胞和融合后2天的前脂肪细胞；D1、D2、D3、D4、D5、D6和D7分别指诱导分化后的第1、2、3、4、5、6和7天的细胞。(B类)在3T3-L1前脂肪细胞分化过程中，通过核提取物的Western blot分析检测AP-2α蛋白。
人类C/EBPα基因启动子包含AP-2/CUP-1结合位点。
之前有报道(14)人类C/EBPα基因缺乏一个功能性CUP-1结合位点，该位点与小鼠C/EBPβ基因的近端启动子（核苷酸−251和核苷酸−236之间）中的功能性CUP结合位点相当，尽管已鉴定出一致的AP-2结合位点序列（参考文献。14; 另请参见图。). 鉴于我们发现CUP是一种AP-2α亚型，我们对这个问题进行了重新研究。EMSA使用与人类C/EBPα启动子中潜在AP-2结合位点相对应的寡核苷酸探针进行；然而，寡核苷酸比先前测试的一致序列延长了5′，但没有成功(14). 该探针与rAP-2α1和前脂肪细胞核提取物产生蛋白质复合物（图。，车道1和2）。很明显，前脂肪细胞核提取物形成的复合物之一含有CUP/AP-2α，因为它被hAP-2抗体超转移（第3条车道），被未标记的CUP-1位点寡核苷酸特异性竞争（结果未显示），而不是与脂肪细胞核提取物（第5条车道）形成。应该记得，与hAP-2α形成的两个配合物（图。，通道1）均被hAP-2α抗体超转移（结果未显示），移动速度更快的复合物是由于重组hAP-2 a的蛋白水解产物所致。在前脂肪细胞核提取物中未检测到这种裂解产物。综上所述，这些结果表明，与小鼠启动子一样，人类C/EBPα启动子在同一区域具有功能性CUP/AP-2结合位点（图。).
人C/EBPα基因中寡核苷酸序列对应于小鼠基因中CUP-1结合位点的前脂肪细胞和脂肪细胞核提取物的EMSA。用来自3T3-L1前脂肪细胞（P；第0天）或脂肪细胞（A；第7天）的核提取物进行EMSA，其中人C/EBPα基因中的寡核苷酸序列对应于小鼠C/EBPα基因中的CUP-1结合位点。如有指示，在与标记的寡核苷酸探针孵育之前，用抗hAP-2α（AP-2）抗体或免疫前血清（PI）处理核提取物。左边的两个箭头表示与rAP-2形成的复合物；右箭头所示为前脂肪细胞核提取物形成的复合物。
AP-2α1对C/EBPα基因启动子介导的报告基因表达的反式抑制。
先前的研究表明，C/EBPα基因启动子中的双CUP结合位点具有抑制作用(10). 因此，C/EBPα启动子荧光素酶中CUP结合位点的突变在3T3-L1前脂肪细胞中构建了去抑制的报告基因表达，但在3T3_L1脂肪细胞中没有。为了确定AP-2α是否能够抑制C/EBPα基因启动子介导的转录，将C/EBPβ启动子荧光素酶构建物与AP-2α1表达载体或缺乏AP-2α1cDNA插入的控制载体共同转染到第3天的3T3-L1脂肪细胞（或3T3-LI前脂肪细胞）。如图所示。，AP-2α1的表达显著“反式抑制”C/EBPα启动子引导的转录，而对照载体没有影响。在五个不同的实验中，跨抑制的程度从55%到90%不等。重要的是，AP-2α1表达载体对3T3-L1前脂肪细胞中C/EBPα启动子荧光素酶结构的表达没有影响（结果未显示）。因此，可以得出结论，AP-2α1能够抑制C/EBPα基因启动子驱动的转录，并且可能至少部分负责在分化前维持基因处于抑制状态。虽然AP-2可以作为C/EBPα基因的阻遏物，但其阻遏机制尚不清楚。虽然AP-2通常被认为是一种转录激活物，但它也被证明是许多基因的阻遏物，包括星状1型胶原基因(24)，K3角蛋白(25)，乙酰胆碱酯酶(26)，原胸腺素(27)，鸟氨酸脱羧酶(27)，视网膜脂肪酸结合蛋白(28)，维甲酸受体β(29)和软骨衍生维甲酸敏感蛋白(30). 目前正在进行研究，以确定AP-2α抑制C/EBPα基因的机制，并评估其对分化程序的影响。
AP-2α1对3T3-L1脂肪细胞中C/EBPα基因启动子介导的报告基因表达的转染抑制。第3天3T3-L1脂肪细胞与AP-2α1或对照（缺少AP-2α1cDNA插入物）表达载体和无启动子（缺少C/EBPα启动子）或C/EBPβ启动子荧光素酶构建物短暂共转染。48小时后，对细胞提取物进行荧光素酶分析。结果来自五个独立的实验。
