液相状态下信噪比增加>10000倍核磁共振

摘要

核磁共振有两个主要应用：光谱和成像。核磁共振光谱学已被公认为主要分析技术之一由于可以获得有关分子的详细信息结构、动力学以及分子内和分子间的相互作用。MRI是一种具有优越软组织对比度和广泛诊断能力的无创技术值。该技术获得了广泛的临床认可，具有很好的效果在诊断医学中的重要性。

然而，尽管技术进步显著（领域不断扩大电子强度和冷却），核磁共振的应用受到与其他分析方法相比，固有的低灵敏度。从根本上讲，低灵敏度源于核自旋和室温下的热能相比。在1.5 T和室温的磁场强度¹H旋转极化到只有5 ppm，因此提高了200000理论上是可能的。两个最敏感的核是¹H和¹⁹F、 它们具有较大的磁矩和100%的丰度。但是，即使在目前可用的最大场强（21T）下，这些核也是极化率分别为70和67 ppm。对于其他低核磁矩（1/4用于¹³C和1/10¹⁵N比较具有¹H） ，理论增强因子成比例更大的。弱核极化通常由高浓度（即大量核自旋）。然而其他几个核的灵敏度因低自然浓度而进一步降低NMR活性同位素丰度（1.1%¹³C和0.36%¹⁵N） ●●●●。

人们提出了一系列增强核极化的方法自旋（表示超极化方法），例如光泵浦(1),对位-氢致极化(2,三)和动态核能极化（DNP）(4,5). 这些方法具有创造接近统一的非热极化的潜力。光学泵送惰性气体^三他和¹²⁹Xe已应用于MRI肺部。超极化¹²⁹Xe还广泛用于核磁共振波谱体内和在体外(6). 光泵浦然而，该方法仅限于某些惰性气体的极化同位素。PHIP效应包括插入对位-氢通过催化氢化转化为底物分子。的自旋顺序由此产生的氢化分子可以通过以下方式转化为核极化各种方法(4,5). PHIP方法取决于底物分子中的双键或三键。第三次超极化DNP方法是基于固态核自旋的极化。这个机制需要存在未成对电子，这些电子被添加到例如，有机自由基。为了使DNP过程有效的，自由基必须均匀分布在样品中。收件人在水样、玻璃成型剂（例如甘油或乙二醇）中实现这一点，添加以防止结晶并在冷却样品。在固态中，高电子自旋极化为通过微波辐射，部分转移到核自旋。一直以来先前证明了¹H和¹³C可以分别增加到几乎100%和50%(7,8)，通过低DNP温度。该方法主要用于极化的生产中子散射实验的靶。也使用了DNP方法提高固态核磁共振的灵敏度(9). 增强170[1观察到±50-¹³C] 9 T和20 K下的甘氨酸，以及二维魔法角旋转¹³C类-¹³C类相关谱观察到的增强约为17[美]-¹³C、，¹⁵N] 9 T和≈100 K时的脯氨酸(10). 然而，即使使用所谓魔角旋转的应用，光谱分辨率这些DNP增强固态核磁共振的例子与液相核磁共振。

本研究的目的是开发一种超极化方法可以使液体中的有机分子达到接近统一的极化解决方案。我们描述了一种溶解相，DNP-增强NMR（DNP-NMR）方法样品的核自旋在固态下超极化随后在快速溶解后带入液体溶液。用这个方法，我们表明可以获得极化的冷固体样品在保持其核极化的同时将其转化为溶液。这将启用DNP-NMR方法可用于各种不同的体内和在体外应用和利用窄核磁共振谱线在溶液中，提高了灵敏度和光谱分辨率。我们通过显示增强极化的示例演示该方法¹³C和¹⁵尿素的固态和液态中的N。在戈尔曼的文章等.(11)，示例[¹³C] 尿素作为体内示出了成像。

材料和方法

DNP偏振器。 磁铁和低温恒温器.一幅DNP偏振器如图所示图。1偏光镜基于标准、高分辨率、，窄孔7-T磁体和低温恒温器（Magnex，牛津）(1). 低温恒温器被改装用于容纳70 mm in的薄壁（0.01英寸）不锈钢管通过移除所有钻孔管来确定直径。不锈钢管的末端是铜热交换器，通过毛细管连接到液氦杜瓦瓶管。此布置构成一个可变温度插件（VTI）（第3部分在里面图1). 氦的流动通过毛细管由针阀从外部控制。VTI与气冷屏蔽热接触液氮杜瓦瓶。磁心到上法兰的距离为800 mm。磁铁充电至3.35 T，并由八个低温垫片填隙在直径为10-mm和10-mm的圆柱体内，均匀性大于0.1 ppm长度。

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图1。

DNP偏振器和部件示意图。1、DNP偏振器；2,真空泵；3、VTI；4、微波源；5、压力传感器；6、样品港口；7、微波容器；8、样品支架；9、样品容器；10,溶解棒。

DNP插件.DNP嵌件放置在磁铁(图1). DNP公司插件由一个中心玻璃纤维管（内径18mm）组成，用于引导插入时的样本。样品被引导至磁铁中心端部位于圆柱形金属容器中（直径38 mm，高度50 mm）（零件7英寸图1). 的功能金属容器用于限制微波，微波被引导到容器从外部通过波导管。在VTI顶部法兰上50-μm聚酯薄膜放置在WR10 E弯板和短的穿过顶部法兰的直WR10波导管。聚酯薄膜用作真空密封。波导管继续以27 mm的长度过渡到WR28，a500 mm薄壁不锈钢WR28件，最后在黄铜WR28。下部黄铜WR28将微波耦合到金属中容器通过圆柱体侧面的缝隙。金属内部容器，放置一对鞍形线圈（直径16mm，长度16mm）测量核磁共振信号。鞍形线圈与同轴传输装置相连线路（UT85-SS-CuBe，牛津仪器，Tubney Woods，U.K.），进一步延伸至调谐和匹配网络。调谐和匹配电路包括并联可变电容器、可变电感和串联变量电容器。通过调整传输线的长度和可变阻抗，NMR电路在¹³35.89 MHz的C频率和¹H频率142.7兆赫。这个¹³C 90°翻转角≈100μs功率为15 W。压力传感器（零件5英寸图1)测量氦VTI外部通过3mm不锈钢管。进入VTI的氦气流量在伺服回路。通过测量跨接电压来监测氦的水平三个100ΩAllen-Bradley碳电阻。恒定电流加热电阻顺序，同时测量跨接电压。电压剖面是氦气相和液相的特征。第一个电阻器放置在磁心上方50毫米处，另外两个电阻器放置在磁心上方间距为10 mm。根据液氦的液位，针头阀门由步进电机打开或关闭，液氦液位可以保持在下部和中部电阻器之间。

泵.200米^三/h罗茨泵和40米^三/h旋片式背压泵（Leybold）（零件2 in图1)连接到50毫米VTI侧面的端口。泵送系统能够维持蒸汽压力≈0.8 mbar（1 bar=100 kPa）（对应于槽温度1.2 K）。蒸汽压力用作温度测量。泵可以通过电动蝶阀关闭阀门。

微波发生器.微波源（ELVA-1，St。俄罗斯，彼得堡）（第4部分图。1)在94 GHz的调谐范围内，最大输出功率为200 mW500 MHz，频率调制带宽为10 kHz。输出电平通过模拟固态可以连续衰减高达60 dB衰减器。频率通过模拟调谐输入进行控制。频率调制的任意波形可以通过附加的模拟输入。

软件.偏光镜由LABVIEW程序控制在个人计算机控制器上运行。VTI压力通过RS232连接。用于控制微波频率、微波功率和Allen-Bradley电阻器由PXI-6052E采样卡（National Instruments，德克萨斯州奥斯汀）。

样品处理和溶解。 准备样品.尿素（99%¹³C-标记，505 mg，8.27 mmol）溶解在甘油（1.26 g）中，得到接近饱和的溶液[29%尿素（wt/wt）]，体积为1.38 ml。三烷基自由基（三{8-羧基-2,2,6,6-四[2-（1-羟乙基）]-苯并（1,2-d:4,5-d′）双（1,3）二噻吩-4-基}甲基钠盐）(12)已添加到浓度达到15或20 mM。溶液的一部分（40-50mg）作为液滴分配到液氮中并转移到样品容器（零件9英寸图。1)作为冷冻颗粒。制备了低分子量样品以类似的方式减少尿素在给定量的甘油。

加载样本.样品架（第8部分图1)是特氟隆管设计用于容纳样品容器（零件9图1)在中的位置磁场并随后使样品在溶解。装载样品容器时，样品架和容器首先在氮气浴中冷却。随后，冻结通过样品架上的开口将颗粒放入容器中，并且将样品架降到VTI中。样品支架用橡胶隔板。将VTI抽空至0.8 mbar，以将样品冷却至1.2 K，开始样品的微波辐照。在极化过程中，样品在中心浸没在液氦中磁场（3.35 T）。

样品的溶解.在解散前不久停止微波照射，用氦气对VTI加压，并且将样品从磁性中心升高10厘米，使其离开液体氦。在此位置，磁场≈3 T。10-ml注射器为填充有7ml沸水并连接到注射棒（第10部分在里面图1). 注射棒是两个聚四氟乙烯管在碳纤维管内运行的组件。这个外壳的下部是开口的，允许插入样品容器。特氟龙外壳还包含一个混合室，确保样品离开磁场前的必要稀释偏光镜。将棒插入样品架后，拧紧连接到样品容器，快速注入热水（<1s） 通过棒中的一根管子进入样品容器。样品被热水溶解，并通过第二根管子转移至接收管容器。

极化测量。固态极化为通过使用Varian（加利福尼亚州帕洛阿尔托）INOVA400测量核磁共振信号进行量化慰问。在5μs脉冲后获得自由感应衰减(4.5°). 自由感应衰减（15μs）的前三个点是在加权（2-kHz线宽）傅里叶变换之前省略，产生固态光谱。核磁共振信号强度通过数值测量三阶多项式基线后核磁共振吸收线的积分修正。通过比较积分来量化核极化DNP-NMR光谱和热平衡固态光谱。

液相核磁共振谱是在同一控制台和9.4-T上获得的高分辨率核磁共振磁体。转移超极化液体溶液旋转器中的5 mm核磁共振管，并在<6 s内插入9.4-T磁铁。液相极化通过与热极化的比较来量化当热平衡谱可以在一次收购中获得。否则[¹³C] 使用尿素。信噪比（SNR）测量如下峰值高度除以200-Hz噪声的标准偏差在应用1-Hz指数权重函数之后的光谱区域。

结果

固态极化。检查信号轮廓低温下微波辐照时间的积累温度以及监测自旋-晶格弛豫时间，T型₁，停止辐照后[¹³C] 测量了尿素（参见图2). 建立时间常数，τ_波尔，为4900秒。关闭微波炉后，T型₁测量值为28200 s。最大值¹³C类15 mM自由基在固态下的极化率为42%浓度，微波频率93.952 GHz，微波功率100 mW（源输出电平），温度为1.1 K。增加自由基后浓度为20 mM时，最大极化率降至26%(图3)，以及建立时间常数和松弛时间分别缩短至2755和15800 s，分别是。单指数数据拟合的误差总计<2%案例。相同样品制备结果的差异<10%。

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图2。

¹³固体中的C极化随时间的变化15 mM自由基浓度。增加的曲线显示极化微波积累（93.952 GHz，100 mW源输出）。下降的曲线显示了关闭微波后的极化衰减。数据的单指数拟合产生极化建立时间常数为4900 s，松弛时间为28200 s。

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图3。

对¹³微波上的C极化自由基浓度为20 mM的频率。输出功率为100 mW，温度≈1.1K。

对¹³微波上的C极化频率如所示图3.DNP谱显示几乎为等强度：93.942 GHz时+26%，94.005 GHz时-22%。分离两个峰值为63 MHz。

这个¹³固体中的C NMR线宽（半最大值时的全宽）状态为6 kHz（2 kHz线宽），共振频率为35.89兆赫。

液态极化。量化核能的收益液体状态下的极化，固体样品根据所述方法并在6s内转移到9.4-T磁体进行核磁共振收购。在这个实验中，未标记（自然丰度¹³C）使用尿素。A类¹³未标记尿素样品的C光谱为获取并与热平衡谱进行比较(图4). 热能平均65小时后获得平衡谱（232128瞬态）在Ernst角条件下（重复时间为1s，脉冲角为13.5°). 这个¹³超极化样品的C极化为20%. 超极化光谱的信噪比为4592热极化样品为7。

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图4。

(A类)¹³尿素C光谱（天然丰度¹³C） 通过DNP-NMR方法超极化。The concentration of尿素为59.6 mM，极化率为20%。(B类)热能同一样品在9.4 T和室温下的平衡光谱。这个在Ernst角条件下获得频谱（脉冲角为13.5°重复时间为1s，基于T型₁60秒）满的¹H解耦。信号在65小时（232128）内平均瞬态）。

一种优雅、简单、准确的测量方法¹³C类极化是为了获得¹⁵N谱并比较积分双峰的(J型-耦合到¹³富含C碳）。极化¹³C是两个积分(图5). 在通过这种方式，获得了37%的极化¹³C.来自同一光谱¹⁵N极化测定为7.8%。

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图5。

¹⁵N（自然丰度）谱¹³C标记尿素。(插入)图中显示了归一化部分积分。这个极化¹³C为37%（部分积分之间的差异），以及¹⁵N为7.8%（通过与已知的参考样品¹⁵N浓度）。固体样品含0.6%（wt/wt）[¹³C] 甘油中的尿素和15 mM自由基。溶解后[¹³C] 尿素为8.24 mM。

讨论

DNP-NMR方法在液相NMR中的应用依赖于以与可能。因为核武器T型₁在固态中在低磁场下，自由基的存在变得很短，这是很难将固体样品从偏光镜中取出。此外应尽可能方便地在最高级别进行解散可能的磁场。开发的溶解方法在DNP偏振器内部，已证明在保护固体状态下产生的核极化。更正损失时样品转移过程中的极化（6 s的转移时间和T型₁60 s的松弛度约为10%）得出的结论是，在溶解过程中几乎没有偏振损失。上微观尺度上，溶解过程尚待表征。然而，假设对溶剂质子的偶极弛豫占主导地位T型₁松弛机制，我们估计最小值T型₁羰基碳的含量在0.5到1.0秒之间3.35 T（在溶解的粘性阶段）。因此，溶解在这个时间尺度上，这个过程必须很快。几个参数，如性质溶解溶剂的温度可能会影响溶解过程中的松弛。

当比较具有15和20 mM自由基浓度的样品时在下部观察到最大的固态和液态极化自由基浓度；然而，这是以延长极化时间。在这种情况下，自由基浓度没有进一步降低研究，因为微波照射1h后的极化构成我们预期的操作时间刻度，最好为20 mM。信号发现增强与微波功率水平无关50-200 mW的间隔（未显示数据）。在50 mW以下，发现增强减少。我们认为，微波功率的最佳值是由于通过电子自旋的共振吸收来加热样品。

DNP光谱似乎由热混合效应控制(13). 积极的和负增强峰相隔63 MHz(图3). 占主导地位的固体效应的贡献将以两倍间隔的峰值出现核Larmor频率，即72 MHz。然而，来自不能排除固体效应。正负增强峰值不对称，这可以用EPR谱的不对称性来解释。我们测试了微波源的频率调制。这之前据报道增加极化并降低极化率(5). 对于被调查者然而，我们并没有观察到频率调制的任何好处。固态下42%的高极化是由于良好的EPR三烷基自由基的线宽。此外，三烷基自由基在水溶性和稳定性的术语。

我们研究了尿素以外的分子，并获得了类似的结果结果。例如，物质（C1-羟甲基-1[¹³C] 环丙基）甲醇(14)用long¹³C类T型₁极化至≈20%。所述DNP-NMR方法能够增强大多数¹³C和¹⁵在我们的经验中，只有在超极化样品的转移。DNP-NMR方法的一般性与其他超极化技术相比，它具有独特性。

顺磁性剂的浓度，对于极化，在最终溶液中约为0.2-0.3 mM。然而，在尿素的特殊例子是，99%以上的三丁基自由基可以从通过短阴离子交换柱过滤水溶液。这样的过滤将消除自由基的极小松弛效应并使溶液更适合体内使用。

偏振器能够达到≈1.2 K的基本温度用抽水机汲水⁴在连续微波炉中洗澡辐照。这个温度相对容易获得。提升温度（通过降低泵送速度）不会减少氦气消费量很大，但会对两极分化和极化率。根据我们的经验，DNP增强因子是独立的温度在1-2 K范围内，因此核极化与温度成反比。极化率为通常随温度变化到1的幂以上。这意味着如果可以在个体实验。相反，温度进一步降低(^三He或稀释冰箱）或磁场增加应该以牺牲时间延长为代价，进一步加剧两极分化极化建立时间。

强大的信号增强可以转化为巨大的减少在信号平均时间内。常规核磁共振波谱图465小时后获得信号平均。估计平均值对信噪比的改善为脉冲角度、重复时间和T型₁（厄恩斯特角条件）。尽管如此，增强的信噪比光谱是测量信噪比的656倍。因此，信号平均656²×65小时（3200年）需要在不增强的情况下达到相同的信噪比，尽管T型₁-缩短剂可以用来缩短这个持续时间。

这个¹⁵N极化增强的顺序与¹³C在实验中。然而，没有尝试优化的DNP条件¹⁵N.因此，很可能¹⁵N极化增强可以进一步增加。

DNP-NMR的可能应用

迄今为止，核磁共振和核磁共振在许多生理学研究中的应用由于缺乏敏感性，工艺受到了限制。目前，磁性对于临床全身而言，场强和信噪比限制在3 T以内成像和至21T用于小样品的光谱；没有任何迹象预计会有实质性的技术进步。大多数由于质子相对与其他细胞核相比具有更高的灵敏度和丰度。因为它强信号增强，DNPNMR提供了直接观察的可能性溶液中的低灵敏度核，否则也会如此调查耗时。DNP-NMR实验的持续时间，不考虑极化时间，仅限于采集单个自由感应衰减。在所示示例中，解散和收购是在10秒内执行。大信号增强和短核磁共振采集时间不仅可以显著提高传统核磁共振分析的灵敏度，但也可在以下领域应用传统上不通过核磁共振进行分析。

DNP-NMR在体外使用需要高分辨率核磁共振将分光计（磁铁和控制台）添加到DNP或与DNP结合偏光镜。在所述的实验装置中，溶解的样品为从DNP偏振器传输到高分辨率磁铁。本次转账当前在6秒内执行，因此限制了对short的分析T型₁核。对于高分辨率核磁共振应用更实用的方法是溶解样品并进行光谱分析DNP偏振器内的测量。这需要NMR线圈布置非常接近溶解室，但扩展了可以用这种方法研究的分子和核。

在人体全身成像中，水质子的大浓度允许高质量的解剖图像（即具有良好的对比度和高时间分辨率）。然而，以下信息有限图像中包含了生理相关性。带DNP超极化，可以对质子以外的原子核成像，因此实现基于毫摩尔成像剂的一系列新应用浓度。例如，强信号可以使MR血管造影时间和空间分辨率明显高于目前的水平（如参考文献中概述。11).

结论

我们已经证明了一种基于液相核磁共振的超极化方法固体中的DNP和保存从固态到液态的转变过程中的核极化。该方法能够创建具有强极化核自旋，适用于各种核，例如。，¹³C和¹⁵N.建议的DNP-NMR方法为广泛的新型核磁共振波谱和核磁共振应用在体外和体内因为核的增强≥10000倍极化。

笔记

缩写：DNP，动态核极化；DNP-NMR，DNP-增强核磁共振；VTI，可变温度插件；信噪比，信噪比。

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