美国呼吸细胞分子生物学杂志。2007年1月；36(1): 78–84.
肠道富集的Krüppel样因子与Smad3的相互作用抑制肌成纤维细胞分化
收稿日期：2006年1月27日；2006年6月1日接受。
摘要
据报道，富肠Krüppel-like因子（GKLF）可部分抑制α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)通过与已知激活物（如Sp1和其他类似Krüppel因子）竞争结合TGF-β控制元件（TCE）的基因转录。通过TCE的这种不完全抑制表明了另一种机制，这在本研究中进行了评估。结果表明α-SMATCE中突变的启动子在大鼠肺成纤维细胞中仍然容易受到GKLF的抑制，这与存在一种额外的TCE非依赖性机制一致。自TGF-β诱导以来α-SMA表达是Smad3依赖性的，GKLF和Smad3之间的潜在相互作用被检测为这种额外抑制机制的基础。共免疫沉淀和酵母双杂交试验表明，GKLF可以通过Smad3-MH2结构域结合Smad3。电泳迁移率变化分析和ChIP分析表明，这种GKLF–Smad3相互作用抑制了Smad3与Smad3结合元件（SBE）的结合α-SMA启动子，以及含有SBE的人工启动子的活性。进一步分析使用形状记忆合金3(−/−)成纤维细胞证实，GKLF对TCE的非依赖性抑制依赖于Smad3。这些数据综合起来表明，除了通过TCE抑制外，GKLF还抑制α-SMA通过与Smad3相互作用来阻止Smad3与SBE结合的基因表达。这是第一个直接将GKLF与Smad3联系起来的证据，Smad3是TGF-β信号传导的关键细胞内介质，这将有助于更清楚地了解GKLF如何调节TGF-α诱导的基因表达的机制。
关键词：α-平滑肌肌动蛋白、GKLF、KLF4、Smad3、TGF-β
临床相关性
我们的数据表明，除了通过TCE抑制外，GKLF还通过与Smad3相互作用来抑制α-SMA基因表达，以阻止Smad3与SBE结合。这是第一个将GKLF与Smad3直接联系起来的证据。
从头开始肌成纤维细胞的出现是组织修复、重塑和纤维化的特征。在肺纤维化中，这种细胞的出现和持续存在被认为对纤维化的发病机制很重要，并且是特发性肺纤维化中成纤维细胞病灶的一个共同特征(1). 该细胞通常通过表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)主要在正常成人平滑肌细胞中表达，在心肌和骨骼肌发育过程中短暂表达(2,三). 然而，它的表达并非仅限于平滑肌细胞，并且是其他细胞（如肌成纤维细胞）的显著特征(4–7). TGF-β强烈激活其表达并诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞分化(4,8–10). 在肌成纤维细胞分化中，Smad3介导TGF-β诱导α-SMA通过结合Smad-binding元件（SBE）表达基因，该元件位于转录起始位点的−552至−513处α-SMA基因启动子(4). 此外，另一个TGF-β控制元件（TCE）位于转录起始位点的−56到−45α-SMA基因启动子对基础和TGF-β−诱导的α-SMA基因表达(4,11–15).
TCE分析表明，它包含肠富Krüppel-like因子（GKLF）和其他Krüppel样因子（如Sp1和BTEB2）的5′-G/AG/AGGC/TGC/T-3′的最小必需结合序列(13–16). 转染GKLF表达结构抑制α-SMA基因表达，而转染Sp1或BTEB2激活其表达，从而表明α-SMA通过这些抑制（如GKLF）和刺激（如BTEB2）Krüppel-like因子在TCE启动子(13,14). 然而，GKLF对α-SMA启动子与TCE无关(15). 这种与TCE无关的机制尚未确定。GKLF，也称为KLüppel-like factor 4（KLF4），属于Krüppel样锌指转录因子家族，其特征为三种CX2CX公司三外汇5LX公司2换热器三由高度保守的7-氨基酸间隔区TGEKP（Y/F）X分离的H锌指基序(16). 它在调节细胞周期以及细胞生长和分化中起着重要作用(17–20). 尽管有越来越多的证据表明，这种转录因子在调节许多关键细胞过程的基因表达方面具有重要意义，但负责这种调节的分子机制仍然不完整。
Smad3是许多细胞中介导TGF-β信号传导的关键分子(21,22). 它由N端狂犬病域1（MH1）和C端狂犬学域2（MH2）组成，通过富含脯氨酸的连接子连接(23,24). Smad3的MH1结构域介导与含有“CAGA”序列的DNA直接结合，并与其他转录因子一起调节启动子活性(24). MH2结构域介导与其他蛋白质的相互作用，形成同源或异源复合物，从而激活或抑制靶基因表达(25).
在本研究中，我们假设GKLF抑制TCE非依赖性机制α-SMA转录可能由GKLF和Smad3之间的直接相互作用介导，从而干扰Smad3结合和激活α-SMA发起人。结果表明，GKLF确实在其MH2结构域结合Smad3，从而阻止Smad3与SBE结合α-SMA发起人。这有效地消除了Smad3激活的能力α-SMA基因表达以及含有SBE的人工启动子。因此，GKLF调控其靶基因表达的新机制被提出。
材料和方法
细胞培养
Fisher 344只大鼠购自Charles River Laboratories，Inc.（马萨诸塞州威明顿）形状记忆合金3基因敲除小鼠(形状记忆合金3(−/−))（菌株名称：129-形状记忆合金3tm1棒/J） 和相应的对照野生型小鼠(形状记忆合金3(+/+))来自杰克逊实验室（马里兰州巴尔港）。从大鼠或小鼠肺部分离成纤维细胞，并按前述方法进行培养(4,12). 对于TGF-β1或碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）处理，将成纤维细胞在完全培养基中培养过夜，然后通过在PBS中冲洗两次并在含有0.5%PDS的Dulbecco改良Eagle’s培养基（DMEM）中培养8小时来去除血清。然后添加2 ng/ml TGF-β1或50 ng/ml bFGF（明尼苏达州明尼阿波利斯R&D Systems公司）在收获前的不同时间进行试验。
启动子结构和cDNA克隆
野生型老鼠α-SMA通过PCR克隆启动子，并将其插入无启动子载体pGL3-basic（Promega，Madison，WI）的SmaI位点，形成融合质粒pGL3-αSMAp（也称为α-SMAp-luc），如前所述(4)产生了一种结构，其中荧光素酶的表达由大鼠驱动α-SMA发起人。使TCE突变α-SMA启动子突变-荧光素酶融合质粒，pGL3-α-SMAp-TCEm（也称为α-SMAp-TCEm）引物A（5′-TGGGAAGCGAGATACCA-3′）和B（5′-TGGTCTGATCCCTGCAGCTCCCA-3′）对应于α-SMA与之前一样，按照Stratagene（加州拉霍亚）的方案，在QuickChange突变中使用了TCE结合位点突变的−64到−36启动子，以及野生型α-SMAp-luc融合质粒pGL3-α-SMAp(4). 人工pBV-luc启动子构建物和含有四个串联SBE的同一载体SBE4-luc是Bert Vogelstein博士（马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学）的慷慨捐赠(26).
GKLF表达质粒pMT3-GKLF是Vincent W.Yang博士（佐治亚州亚特兰大埃默里大学医学院）慷慨赠送的礼物(16)，并用于瞬时转染研究。为了生产重组Smad3和GKLF，使用质粒pEGFPC2-RSmad3通过PCR扩增这些分子的编码区(4)或pMT3-GKLF作为模板。将其插入载体pGEX-4T-2（Amersham Biosciences，Piscataway，NJ）的框架中，分别形成GST融合蛋白表达质粒pGEX-Smad3和pGEX-GKLF。各自的GST融合蛋白在大肠杆菌并通过谷胱甘肽结合琼脂糖珠层析纯化至均匀（凝胶电泳上的单一条带）（Amersham Biosciences）。
西方印迹法
像以前一样进行了蛋白质印迹(4). 简单地说，按上述方法处理细胞，加入或不加入TGF-β，处理指定时间，然后采集细胞进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。转移到硝化纤维素膜上并阻断非特异性结合后，使用抗α-SMA单克隆抗体（Sigma，St Louis，MO）通过化学发光检测α-SMA。使用同种型匹配的非免疫球蛋白来确认抗体的特异性。
转染和报告基因检测
根据制造商之前的说明，使用FuGENE6试剂（印第安纳波利斯罗氏应用科学公司）或脂质体2000（加利福尼亚州卡尔斯巴德英维特罗根公司）进行细胞瞬时转染(4). 使用无内毒素的Qiagen柱试剂盒（加利福尼亚州巴伦西亚Qiangen Inc）分离超螺旋DNA。除非另有说明，否则每次培养时，将2μg感兴趣的构建物DNA和1μg质粒pRL-TK控制载体（用于归一化）共同转染到有或没有2 ng/ml TGF-β处理的细胞中。在实验中检查Smad3和/或GKLF对α-SMA启动子活性，Smad3表达质粒和/或GKLF表达质粒各1μg与α-SMA启动子报告基因构建。转染后48小时收获细胞，萤火虫或雷尼利亚使用Promega的双荧光素酶分析系统测量荧光素素酶。通过将萤火虫荧光素酶活性归一化为雷尼利亚荧光素酶。每个结构体的实验重复两到四次，相对活性（无启动子折叠对照）表示为平均值±SE。
酵母双杂交检测
在杂交猎人双杂交系统（Invitrogen）中，Smad3及其截断突变体、删除MH2结构域的Smad3（MH1）、删除MH1结构域的Smad3（MHz）和删除磷酸化位点的全长Smad3被克隆到“诱饵”载体pHybLex/Zeo中，形成pHybLex-Smad3、pHyblec-Smad3（MH2）、pHyplex-Smad3（MH3）、，和pHyblex-Smad3-ΔP。它们与细菌衍生的LexA DBD融合表达。GKLF在“猎物”载体pYESTrp2中与B42 AD一起克隆，形成pYESTrp2-GKLF。根据制造商的协议，pHybLex/Zeo“诱饵”和pYESTrp2“猎物”融合构建物通过醋酸锂方法依次转化为酵母菌株L40(马塔·希斯3200trp1–901 leu2–3112 ade2 LYS2∷(4lexAop-HIS3)URA3型∷(8lexAop-lacZ公司)镀锌4)宿主基因组LexAop-lacZ报告者。在两个Trp上生长的共转换物−和Zeo+用ONPG液体分析法测定选择性培养基中的β-半乳糖苷酶活性(o个-硝基苯酚-β-D-半乳糖苷）作为底物，根据BD Biosciences Clontech（加利福尼亚州帕洛阿尔托）的协议，在液氮中通过冷冻-解冻进行分解。
共免疫沉淀分析
根据制造商的协议，使用Co-IP试剂盒（印第安纳波利斯罗氏应用科学公司）进行细胞裂解和免疫沉淀。抗-GKLF抗体来自Santa Cruz Biotechnology，Inc.（加利福尼亚州圣克鲁斯），抗Smad3抗体来自Upstate USA，Inc.（弗吉尼亚州夏洛茨维尔）。免疫印迹按上文关于蛋白质印迹的部分所述进行。
电泳迁移率变化分析
通过电泳迁移率变化分析（EMSA）测试GST-Smad3融合蛋白结合SBE的能力。一种双链SBE寡核苷酸探针，其核苷酸序列对应于α-SMA合成了序列为5′-TACAGACTTCATGACTACACA CAGACCACACTAC-3′的启动子并用于EMSA。它被标记为γ-32P通过T4多核苷酸激酶，与1μg感兴趣的蛋白质、1.0μg Poly dI-dC、0.1μg Poly-L-赖氨酸在Dignam缓冲液C中孵育，最终体积为25μL，EMSA反应混合物在加入探针之前仅在冰上与GKLF或GST预孵育30分钟，并在室温下再孵育20分钟。然后在4%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上在1×三硼酸盐/EDTA电泳缓冲液（TBE）中150 V下电泳约2 h，对样品进行分析。电泳后，将凝胶干燥并暴露于X射线胶片中24–48 h。
染色质免疫沉淀分析
这是使用Upstate USA Inc.（弗吉尼亚州夏洛茨维尔）提供的工具，使用前面描述的制造商协议进行的(27). 肺成纤维细胞转染GKLF表达质粒（pMT3-GKLF）或仅转染表达载体（pMT3）。转染后4小时，用TGF-β处理细胞24小时。然后用1%甲醛在DMEM中固定，使结合转录因子与DNA交联，然后用PBS洗涤两次样品，然后悬浮在SDS裂解缓冲液中。在超声波将DNA剪切到平均1000个碱基对后，将裂解液离心并收集上清液。用蛋白A琼脂糖预处理后，将每个样品分别校准（20μl），作为PCR分析中的“输入DNA”。然后将每个样品的剩余部分等分为三份，与(1)抗Smad3抗体（抗Smad3-结合DNA部分）(2)非免疫兔IgG（非特异性抗体背景DNA分数），或(三)PBS缓冲液（无抗体背景分数）。任何形成的免疫复合物都用蛋白A琼脂糖亲和吸附，并通过离心收集。用新制的洗脱缓冲液（1%SDS，0.1 M NaHCO）从蛋白A琼脂糖中洗脱结合DNA三). 将洗脱液和原始“输入DNA”样品在65°C下培养4 h以逆转交联，然后与寡核苷酸引物A（5′-ACGGTCCTAAGCATGATAT-3′）和B（5′-CTTACCTGATGGATGG-3′）一起用作PCR分析的模板。这些引物设计用于扩增764 bpα-SMA包含SBE的启动子区域。然后用1.3%琼脂糖凝胶电泳和新英格兰生物实验室公司（马萨诸塞州伊普斯威奇）的100 bp DNA阶梯对PCR产物进行分析。
结果
GKLF对野生型和TCE突变的α-SMA启动子的影响
从头开始诱导肌成纤维细胞分化是创伤愈合、组织修复和纤维化/重塑的关键特征，受TGF-β的调节(4,8–12). α-SMA是肌成纤维细胞分化最常用的标记基因(4–7)其在TGF-β刺激的大鼠肺成纤维细胞中的表达依赖于Smad3与SBE的结合α-SMA发起人(4). 其表达也被GKLF部分通过与TCE结合而抑制α-SMA发起人(13–15). 然而，GKLF抑制α-SMA基因表达并不完全依赖TCE，特别是其与Smad3介导的启动子激活的相互作用尚未被探索。为了检验这种可能性，GKLF表达质粒对野生型或TCE突变的影响α-SMA分析肺成纤维细胞基因启动子活性。如所示，与GKLF质粒共转染可显著抑制（>50%）α-SMATGF-β处理的肺成纤维细胞中的启动子活性。TCE突变的启动子活性低于野生型启动子的活性，但GKLF显示出类似的抑制作用（>50%）。这些结果除了证实了TCE对于α-SMATGF-β诱导的基因表达清楚地表明TCE突变α-SMAGKLF仍能抑制肺成纤维细胞的启动子活性。这一发现与GKLF抑制TCE无关机制的存在相一致α-SMA发起人。
GKLF对α-SMA启动子活性的抑制作用。如图所示，将野生型和TCE突变的α-SMA启动子突变构建物与GKLF表达质粒或空表达载体共同转染到大鼠肺成纤维细胞中。然后用转化生长因子-β处理细胞，并分析萤火虫和雷尼利亚荧光素酶活性。标准化后雷尼利亚荧光素酶活性，数据表示为无启动子折叠对照，并显示为平均值±SE。每个组合的实验重复两到四次，结果相似。
Smad3-GKLF结合相互作用
Smad3是TGF-β信号传导的关键细胞内介质，对TGF-α-SMA通过结合在α-SMA发起人(4). 鉴于Smad3的这一重要作用，使用免疫共沉淀（co-IP）分析评估了GKLF与Smad3直接相互作用干扰其激活功能的可能性。用抗Smad3抗体对成纤维细胞裂解物进行免疫沉淀，然后用抗GKLF抗体进行免疫印迹，产生了与GKLF预期分子量一起迁移的阳性条带(,上部面板). 当用抗GKLF抗体进行免疫沉淀，然后用抗Smad3抗体进行免疫印迹时，也产生了迁移Smad3预期分子量的阳性信号(,中间面板). 在这两种情况下，使用对照IgG而不是特定的免疫沉淀抗体在免疫印迹时都无法产生信号。这些结果表明GKLF在成纤维细胞提取物中结合Smad3的能力。由于Smad3被磷酸化并在TGF-β的作用下转位到细胞核(24)Co-IP分析还考察了磷酸化对Smad3与GKLF相互作用的影响。用抗GKLF抗体对裂解产物进行免疫沉淀，用抗磷酸化S-mad3抗体进行免疫印迹后，观察到一个强烈的信号，表明Smad3的磷酸化并不影响其与GKLF的相互作用(,底部面板).
GKLF–Smad3相互作用的共免疫沉淀分析。用TGF-β或仅用缓冲液（无）处理成纤维细胞48小时。然后提取总蛋白，用蛋白A珠预先分离后，用抗Smad3孵育(上部面板)或抗GKLF抗体(中间的和下部面板)（IP抗体）或相应的IgG对照。在严格清洗后，洗脱结合在各个珠子上的蛋白质，并使用指示的IB抗体对等体积洗脱液进行Western blot分析。
为了证实和扩展这一发现，在酵母双杂交系统中进行了Smad3的缺失分析。将全长Smad3、缺失MH2结构域的Smad3（MH1）、缺失MH1结构域的Smad3（MHz）或缺失磷酸化位点的全长Smad2分别作为“诱饵”与LexA DBD融合。每一种都与B42 AD融合的GKLF“猎物”共同转染到含有基因组整合LexAop-lacZ报告子的酵母菌株L40中。在证实Trp的联合转染后−和Zeo+选择培养基，测试β-半乳糖苷酶活性，以显示“诱饵”和“猎物”之间的相互作用与相应的纯载体对照相比，全长Smad3和GKLF之间观察到显著的相互作用。Smad3的MH1结构域缺失导致GKLF-Smad3相互作用增强8倍以上。相反，MH2结构域的缺失导致GKLF和Smad3之间的相互作用减少了75%以上。与Co-IP分析一致，Smad3磷酸化位点的缺失不会影响GKLF-Smad3相互作用。这些发现证实了GKLF和Smad3之间的直接结合作用，似乎主要通过Smad3的MH2结构域。
表1。
富肠KRüPPEL-LIKE因子-Smad3相互作用的酵母双杂交分析
| “猎物”
|
|---|
| “诱饵” | pYE结构2 | pYEStrp2-GKLF公司 |
|---|
| pHyblex-Zeo公司 | 0.45 ± 0.03 | 0.41 ± 0.04 |
| pHyblex-Smad3型 | 0.43 ± 0.17 | 5.43 ± 0.16 |
| pHyblex-Smad3（MH1） | 0.42 ± 0.12 | 1.32 ± 0.35 |
| pHyblex-Smad3（MH2） | 0.97 ± 0.06 | 43.89 ± 0.11 |
| pHyblex-Smad3–ΔP | 0.047 ± 0.05 | 4.78 ± 0.13 |
GKLF对Smad3与SBE结合的影响
由于Smad3与α-SMA基因启动子调控其表达(4)，GKLF可能会抑制α-SMA通过影响Smad3与该启动子上SBE的结合来表达。EMSA使用重组GKLF和Smad3结合32含有SBE结合位点的P标记合成寡核苷酸探针α-SMA发起人。如有指示，Smad3仅在添加探针之前与GKLF或GST预孵育。如所示，用SBE探针孵育GST未能产生移位或延迟带(车道1)，但Smad3与SBE探针的孵育导致出现一个大位移（延迟）带，表明Smad3（但不是GST）与热探针结合(车道2). 与GST预孵育对Smad3与SBE探针的结合没有显著影响，但通过添加100倍过量的冷探针而消除(车道4)从而证实与探针结合的特异性。有趣的是，在加入热SBE探针之前，Smad3与GKLF的预孵育显著降低了Smad3对该探针的结合(车道5-7). 这种GKLF抑制作用的特异性得到了GST预孵育作用的缺乏的支持(车道3). 这些结果表明，GKLF–Smad3相互作用抑制了Smad3与SBE的结合α-SMA发起人。
GKLF对Smad3与SBE结合的影响。32与大鼠SBE序列相对应的P标记双链寡核苷酸探针α-SMA启动子与重组Smad3蛋白或GST蛋白孵育，然后通过凝胶电泳进行分析。在添加放射性标记探针之前，用指示物质对选定的样品进行预处理。移位的带指示DNA-蛋白质复合物的形成箭头如图所示，添加100倍多余的未标记探针，用于记录结合的特异性。从一个具有代表性的实验中放映了一部电影，该实验重复了两次，得到了类似的结果。
为了进一步证实GKLF抑制Smad3与SBE的结合α-SMA将启动子、GKLF表达质粒或仅表达载体转染到大鼠肺成纤维细胞中，然后用TGF-β处理细胞24小时。然后固定细胞并裂解细胞进行ChIP测定，以确定GKLF对Smad3与DNA结合的影响。如所示，Smad3绑定到α-SMA与仅用空载体转染细胞相比，GKLF表达质粒转染细胞中的启动子DNA减少。这一结果进一步证实了GKLF抑制Smad3与SBE的结合α-SMA发起人。
Smad3与α-SMA启动子结合的ChIP分析。用GKLF表达质粒或空载体转染大鼠肺成纤维细胞，然后用TGF-β处理。用甲醛固定和超声处理后，将裂解物与抗Smad3抗体（anti-Smad3）、非免疫兔IgG（rabbit IgG）或PBS孵育，如图所示。这些沉淀的DNA样本以及未经处理的完整样本（输入DNA）通过PCR使用跨越SBE区域的引物进行分析α-SMA发起人。用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物和100-bp DNA梯形图。图中显示了具有代表性的凝胶。
GKLF对TCE非依赖性抑制及其对Smad3的依赖性
为了进一步测试GKLF对TCE非依赖性抑制是否依赖Smad3α-SMA基因启动子活性分析形状记忆合金3(+/+)或形状记忆合金3(−/−)肺成纤维细胞。结果表明，与GKLF表达质粒共转染可显著抑制（>50%）TGF-β处理的TCE突变启动子活性形状记忆合金3(+/+)单元格(). 然而，GKLF在形状记忆合金3(−/−)细胞。这一结果表明，GKLF对TCE的非依赖性抑制依赖于Smad3。然而，GKLF缺乏可检测的抑制作用可能是由于在形状记忆合金3(−/−)细胞，尽管它仍比无启动子对照高约2倍。因此，为了证实GKLF抑制SBE依赖性启动子活性的能力，而不依赖于对TCE的任何影响，Smad3调节的人工启动子（pSBE4-luc）被用于与Smad3和GKLF表达质粒的联合转染研究。在该人工启动子或其对照（缺乏SBE）构建物中未发现TCE位点。正如预期的那样，用TGF-β处理细胞和/或与Smad3质粒联合转染，可显著诱导该人工启动子(). 当GKLF表达质粒仅与pSBE4-luc人工启动子构建物共转染时，TGF-β处理的细胞中的启动子活性显著受到抑制，而未经TGF-。在没有或存在TGF-β治疗的情况下，与GKLF质粒共转染可显著抑制Smad3过度表达引起的活性增加。这些结果证实了GKLF能够独立于TCE抑制Smad3依赖性（以及SBE依赖性）启动子活性。
GKLF对TCE非依赖性抑制依赖于Smad3。TCE突变的α-SMA启动子与GKLF表达质粒或空表达载体共同转染到形状记忆合金3(+/+)或形状记忆合金3(−/−)成纤维细胞如图所示。然后用TGF-β处理细胞，然后分析萤火虫和雷尼利亚荧光素酶活性。标准化后雷尼利亚荧光素酶活性，数据表示为无启动子折叠对照，并显示为平均值±SE。每个组合的实验重复两到四次，结果相似。
GKLF抑制Smad3调节的人工启动子。将人工pBV-luc荧光素酶融合构建物（pBV）和具有四个串联SBE重复序列（pSBE4）的相同载体转染NIH3T3细胞，并与指定表达质粒或空载体对照（C2）共同转染。用TGF-β或仅用缓冲液（无）处理后，对细胞进行萤火虫和雷尼利亚荧光素酶活性。将Renilla荧光素酶活性归一化后，结果表示为pBV控制启动子活性的倍数增加，并显示为平均值±SE。每个组合的实验重复两到四次，结果相似。
讨论
α-SMA是细胞中最丰富的蛋白质之一，在心肌和骨骼肌的发育过程中瞬时表达(2,三). 它也是肌成纤维细胞的重要标志物从头开始的在伤口愈合的早期纤维增生阶段，癌症的促结缔组织增生反应，组织修复/重塑，以及多器官的纤维化(4–8). 肌成纤维细胞是细胞外基质和细胞因子的关键来源，对纤维化的发展和进展至关重要(28). 因此，了解α-SMA与肌成纤维细胞的出现和持续相关的基因表达可以为纤维化疾病的发病机制提供关键的见解。
GKLF是一种类似Krüppel的转录因子，被发现参与调节多种生物过程，包括通过阻断细胞周期G1/S进程抑制细胞增殖(18)加速表皮通透性屏障的形成(29)增殖分化开关的抑制和鳞状上皮异型增生的发生(30). 因此，研究GKLF对肌成纤维细胞分化的调控机制也有助于了解其在这些过程中的作用。
先前的研究已经充分证明了GKLF通过与平滑肌细胞中某些基因启动子中的TCE相互作用介导的对基因表达的抑制作用。一些反作用因子，无论是激活物如Sp1和BTEB2，还是阻遏物如GKLF，已被证明与TCE竞争结合并相互调节基因表达(13,14). 然而，GKLF的很大一部分抑制作用不能通过与TCE的这种相互作用来解释，因为TCE突变的构建体仍然容易受到GKLF的抑制(15). 基于这一发现，该研究的作者建议存在额外的TCE非依赖性GKLF抑制机制(15). 在这项研究中，我们研究了这种潜在的机制，并将重点放在GKLF与先前建立的Smad3依赖性激活的α-SMA发起人(4). 使用TCE突变的研究结果α-SMA启动子结构证实了GKLF抑制TGF-β诱导的TCE非依赖性机制的存在α-SMA大鼠肺成纤维细胞的表达。
我们的数据表明，GKLF可以通过其MH2结构域结合Smad3。去除Smad3 MH1结构域增强了GKLF-Smad3相互作用。已知Smad3-MH1结构域负责启动子中Smad3与SBE的结合。GKLF–Smad3 MH2相互作用可能导致Smad3构象（二级/三级结构）变化，导致Smad3-MH1结构域结合SBE的能力降低。其他Smad3相互作用蛋白也是如此，例如锌指转录因子Evi-1(31). 在我们的研究中，GKLF作为相互作用蛋白也观察到了类似的效果。GKLF与Smad3的结合显著降低了Smad3与SBE的结合α-SMA启动子，与启动子活性降低有关。由于全长Smad3和GKLF之间的相互作用弱于仅Smad3 MH2结构域和GKLF之间的交互作用，因此当MH1结构域完好无损时，MH2结构体的构象可能不太利于与GKLFs结合。相反，GKLF与MH2结构域的结合可能会限制MH1结构域与SBE的结合。
Smad2是另一种潜在的转录因子，在许多细胞中调节TGF-β信号传导(23–25). 它在结构和功能上与Smad3非常相似，但不直接与DNA（或SBE）结合(32). 与TGF-β治疗后Smad3表达增加3倍以上相比，Smad2在成纤维细胞中组成性表达(4). 因此，TGF-β对α-SMA的诱导被认为主要通过Smad3进行(4). 然而，Smad2也被发现激活α-SMA大鼠肝星状细胞的基因表达(33)也可能负责α-SMA在大鼠肺成纤维细胞中。有趣的是，由Smad2介导的这种基本表达水平没有被GKLF抑制，因为没有观察到TCE突变的启动子活性的显著抑制α-SMA启动子突变形状记忆合金3(−/−)GKLF表达质粒转染后的细胞。
虽然我们研究中的数据已经确定了GKLF通过抑制Smad3与SBE的结合来抑制α-SMA表达的TCE-独立机制，但还没有排除其他机制。因此，GKLF对TGF-β信号转导的替代途径以及其他尚未发现的与TCE无关的途径的潜在影响仍有待探索。例如，Smad3的MAP激酶磷酸化(34)可能代表GKLF监管的另一个潜在目标。然而，我们的数据表明Smad3–GKLF相互作用不受Smad3磷酸化状态的影响。然而，已知MAP激酶家族成员，如ERK1/2，是GKLF表达所必需的(35). 由于FGF-2诱导ERK1/2磷酸化(36)拮抗TGF-β对α-SMA基因表达的刺激作用(37)，另一种机制可能是通过诱导该生长因子介导的。FGF-2可能也能抑制α-SMA的表达，而不依赖于TCE。有必要进行进一步研究，以评估这些额外的潜在机制。
致谢
作者感谢埃默里大学医学院Vincent W.Yang博士提供的小鼠GKLF真核表达质粒，以及约翰·霍普金斯大学Bert Vogelstein博士提供的含有启动子和控制结构的人工SBE。
笔记
这项工作得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）HL28737、HL31963、HL52285和HL77297的资助，以及Sandler哮喘研究计划（Sandler Program in Asthma Research）授予S.H.P.的奖项。
最初于2006年7月20日作为DOI:10.1165/rcmb.2006-0043OC出版
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