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神经科学。作者手稿；PMC 2008年2月9日提供。
以最终编辑形式发布为：
神经科学。2007年2月9日；144(3): 950–960.
2006年11月28日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.neuroscience.2006.10.20
预防性维修识别码：项目经理1857306
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院17556
PMID：17137722

Aβ疫苗接种，而非硝基-NSAID治疗，会增加血管淀粉样蛋白和微出血，同时两者都会减少实质淀粉样蛋白。

唐娜·M·威尔科克,* 保罗·T·詹岑,* 李清友,大卫·摩根、和马西娅·戈登#
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

Aβ疫苗接种1–42NCX-2216是一种新型一氧化氮释放氟比洛芬衍生物，其治疗分别显示可减少转基因小鼠淀粉样蛋白沉积，并被认为是阿尔茨海默病的潜在治疗方法。在当前的研究中，我们用Aβ治疗双转基因淀粉样前体蛋白和早老素-1（APP+PS1）小鼠1–42接种，NCX-2216或同时使用两种药物9个月。我们发现，所有治疗都能在相同程度上减少淀粉样蛋白沉积，无论是致密的还是弥散的，而只有接种疫苗的动物，无论是否接受非甾体抗炎药（NSAID）治疗，都显示出与剩余淀粉样蛋白堆积相关的小胶质细胞活化增加。我们还发现，积极的Aβ疫苗接种导致大脑淀粉样血管病和相关微出血显著增加，而NCX-2216则没有，尽管实质淀粉样蛋白减少相似。联合使用NCX-2216并没有减弱疫苗的这种效果。这是首次报告表明，主动免疫可导致血管淀粉样蛋白增加和微出血，正如被动免疫所观察到的那样。联合注射非甾体抗炎药和Aβ疫苗并不会显著改变Aβ免疫治疗的效果。这些治疗方法在血管淀粉样蛋白发育方面的差异可能反映了疫苗的清除作用，而不是氟比洛芬的生产调节作用。

关键词：小胶质细胞、炎症、脑淀粉样血管病、免疫治疗阿尔茨海默病

介绍

阿尔茨海默病（AD）是一种进行性神经退行性疾病，目前尚无任何疾病修饰治疗。AD的淀粉样蛋白假说表明，由聚集的淀粉样-β（Aβ）肽组成的淀粉样斑块是疾病进展的核心，防止堆积和/或清除现有沉积物将阻止AD的进展(Hardy和Selkoe，2002年). 去除和预防淀粉样沉积的一种方法是免疫治疗。Schenk和Elan Pharmaceuticals Inc.的同事首次在小鼠中进行免疫治疗(Schenk等人，1999年)who表明，用Aβ主动免疫PDAPP转基因小鼠1–42导致产生抗Aβ抗体，并阻止年轻小鼠淀粉样蛋白的积累，并清除老年小鼠现有的淀粉样蛋白沉积。通过相同方案进行免疫也可以预防双转基因APP+PS1小鼠的认知缺陷(Morgan等人，2000年)和CRND8转基因APP小鼠(Janus等人，2000年). 后来发现，使用抗Aβ抗体对转基因小鼠进行被动免疫可显著减少淀粉样蛋白沉积(巴德等人，2000年;Wilcock等人，2004b)但也增加了微出血的发生率（Pfeifer等人，2002年；Racke等人，2005年)与脑淀粉样血管病（CAA）增加相关(Wilcock等人，2004c).

另一种治疗AD的潜在方法是使用非甾体抗炎药（NSAID）。流行病学研究表明，长期使用非甾体抗炎药可以延缓甚至预防AD的发作(Szekely等人，2004年;麦肯齐和穆尼奥斯，1998年). 有人认为，这种作用的机制是抑制AD中发生的慢性炎症(Akiyama等人，2000年). 然而，最近的数据表明，一些非甾体抗炎药，尤其是氟比洛芬，可能在AD中有一种新的作用机制，即将γ-分泌酶的裂解从高淀粉样蛋白生成的42氨基酸产物转变为明显无害的38氨基酸产物(Weggen等人，2001年). 我们之前已经证明，新型非甾体抗炎药NCX-2216可以降低双转基因APP+PS1小鼠的淀粉样蛋白水平(Jantzen等人，2002年). 该药物由硝基丁酯部分通过甲氧基苯基（阿魏酸）连接剂偶联到氟比洛芬。该药物的目标是在胃中释放一氧化氮，以尽量减少市场上大多数非甾体抗炎药广泛报道的胃肠道不良事件(詹姆斯，1999).

本实验的目的是比较两种治疗方法，即疫苗接种和NCX-2216，这两种方法分别对高淀粉样蛋白产生APP+PS1转基因系的病理学产生适度影响。从理论上讲，这两种疗法可能在降低淀粉样蛋白的效果上协同作用，或者通过对小胶质细胞的相反影响相互抵消。我们给APP+PS1小鼠喂食补充了NCX-2216的食物9个月，同时还积极给一些小鼠接种疫苗。我们希望确定a）两种治疗对淀粉样蛋白去除的影响，b）非甾体抗炎药通过阻断小胶质细胞活化和调理淀粉样蛋白的吞噬作用来干扰疫苗介导的aβ去除的潜力，c）被动免疫治疗的血管效应是否也在主动免疫中发现，和d）非甾体抗炎药是否可以改变这些不良反应。

实验程序

实验设计

通过Tg2576 APP转基因小鼠杂交获得双转基因APP+PS1小鼠(肖等人，1996年)带有5.1系M146L PS1转基因小鼠(Duff等人，1996年)如前所述(Holcomb等人，1998年). 10个月大的APP+PS1被分配到四个实验组中的一个。第一组接受Aβ1–42接种如下所述的疫苗以及控制饮食。第二组接受补充NCX-2216的饮食，如下所述，不接种疫苗。第三组接受补充有Aβ的NCX-2216饮食1–42接种疫苗。最后一组接受了不接种疫苗的对照饮食。

药物治疗

人类Aβ1–42将肽（巴赫姆，普鲁士国王，PA）悬浮在2.2 mg ml无热原I型水中−1然后与10X PBS混合生成1X PBS，并在37°C下培养过夜。第一次接种时，抗原悬浮液与弗氏完全佐剂（西格玛-阿尔德里奇，圣路易斯，密苏里州）1:1混合，皮下注射100μg Aβ。对于以下四种疫苗接种，抗原悬浮液与弗氏不完全佐剂（密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）以1:1的比例混合。对于剩余的疫苗接种，抗原悬浮液与矿物油以1:1的比例混合。前四次接种每两周进行一次，后两次每月接种一次，其余两次每两个月接种一次。

补充NCX-2216的膳食及其对照膳食由Harlan Teklad（威斯康星州麦迪逊）制备。对照饮食是专门为啮齿类动物设计的平衡固定配方饮食（Harlan Teklad 22/5啮齿类动物饮食，威斯康星州麦迪逊）。该饮食最初添加浓度为375ppm的NCX-2216。由于在治疗的前6周内接受这种饮食的组的消耗（2 NCX-2216和5 NCX-2216+疫苗接种），饮食被重新配制成187 ppm的浓度。尸检未发现明显的大体病变，死亡前未观察到任何疾病行为。研究开始3周后（第二次接种后），小鼠开始接受NCX-2216（375ppm）。七周后，接受NCX-2216的小鼠接受了187ppm的低剂量饮食，并持续了9个月，直到研究结束。研究结束时的最终样本量为12只未经治疗的APP小鼠、7只接种疫苗的小鼠、10只接受NCX-2216治疗的小鼠和3只同时接受这两种治疗的小鼠。

组织制备和组织学

在20个月大时，即最后一次接种后的两个月，处死小鼠。在献祭当天，称量小鼠体重，过量服用100mg/kg的戊巴比妥钠溶液（雅培实验室，北芝加哥伊利诺伊州），采集血样，并用25ml 0.9%氯化钠对小鼠进行心内灌注。快速取出大脑，将大脑左半部浸泡在新制备的4%多聚甲醛中，置于100mM磷酸钾缓冲液（pH 7.2）中固定24小时，以进行组织病理学检查。然后将半脑在10%、20%和30%蔗糖中依次培养24小时，以保护它们。使用滑动切片机收集厚度为25μm的水平切片，并将其保存在4o个C在Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水中加入叠氮化钠（pH 7.2），以防止微生物生长。如前所述，在整个大脑中随机选择间隔600μm的八个等距组织切片，并使用自由浮动免疫组织化学方法对总Aβ（兔多克隆抗Aβ，USF培养；1:10000稀释）和CD45（大鼠单克隆抗CD45，1:5000稀释，Serotec，Raleigh，NC）进行染色(Gordon等人，2001年,Wilcock等人，2004b). 使用0.2%刚果红溶液在80%的NaCl饱和乙醇中对间隔600μm的第二组组织切片进行染色。另一组切片也被安装，并用2%亚铁氰化钾在2%盐酸中染色15分钟，然后在1%中性红溶液中复染1分钟。

使用Image-Pro Plus（Media Control netics，Silver Spring，MD）软件对刚果红染色、CD45和Aβ免疫组织化学进行定量，以分析阳性染色所占的面积百分比。使用恒定的灯泡温度和曝光，在100倍放大的条件下收集来自额叶皮层的一个区域和海马体的三个非重叠区域的图像，所有图像都是在同一时段收集的。使用Image Pro Plus软件，使用代表高和低染色水平的图像来建立红、绿和蓝值（RGB），以区分阳性染色。使用相同的RGB值收集每个图像中阳性染色所占的百分比面积。计算每只动物额叶皮层的平均值，并将海马体的所有区域结合起来，得出海马体的单个值。对刚果红进行初步分析，得出总值。在手动编辑掉所有实质淀粉样沉积物后，进行第二次分析，以获得限制血管刚果红染色的百分比区域。为了估计刚果红的实质面积，我们从总百分比中减去了血管淀粉样蛋白值。对于含铁血黄素染色，检查了八个等距切片，计算了所有切片上普鲁士蓝阳性沉积的数量，并计算了每个切片的含铁血色素沉积的平均数量。为了评估可能的治疗相关差异，使用StatView（SAS Institute Inc，NC）对每个治疗组的数值进行单向方差分析，然后进行Fischer最小二乘均值差异比较。

血样在4点凝结两小时o个C.然后以3800rpm离心样品15分钟，然后收集血清并储存在−80o个C、。

抗体滴度测量

使用从血清中的抗aβ抗体中分离aβ的方法测量血清中的抗体滴度。此方法之前已描述(Li等人，2004年)然而，在当前的研究中，分离是在pH值为3.5的条件下进行的，而之前报道的是pH值为2.5。简单地说，使用pH 3.5的离解缓冲液将血清稀释为1:100，并在室温下培养20分钟。然后使用Microcon离心装置（YM-10，10000MW截止，密立波州，比勒里卡，马萨诸塞州）在室温下以8000×g的速度离心血清20分钟。然后将样品贮存器倒置到第二个试管中，以1000×g离心3分钟。将收集到的含有从aβ肽中分离出的抗体的溶液调节至pH 7.0。然后通过ELISA分析这些样本以确定抗体滴度。96块钢板涂有Aβ1–42肽过夜，封闭，然后在37℃孵育1小时o个用两倍连续稀释的血清样品。添加了抗鼠过氧化物酶（西格玛-阿尔德里奇，圣路易斯，密苏里州），并使用3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（西格马-阿尔德里希，圣路易，密苏中州）开发了ELISA。

结果

根据Aβ1–42接种方案。在单独接种Aβ疫苗或接种Aβ和NCX-2216的APP+PS1转基因小鼠中观察到显著的抗体滴度，两组之间没有显著差异(图1). 正如预期的那样，对照组治疗的APP+PS1小鼠以及仅接受NCX-2216的小鼠均未表现出抗Aβ抗体滴度。与其他人在主动免疫方案中接种后报告的结果相比，这些滴度（约8μg/ml）较低(Seabrook等人，2004年;Das等人，2003年). 这可能反映了小鼠牺牲时的高龄（20个月）、用于测量抗体滴度的ELISA协议中实验室之间的差异或上次接种后的2个月间隔。然而，我们之前已经证明，在停止接种两个月后抗体滴度仅下降20%(Dickey等人，2001年).

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Aβ1–42接种疫苗，无论是否经过NCX-2216治疗，都能产生可检测的抗Aβ抗体滴度。该图显示了未接受治疗（Cont）、Aβ1–42接种疫苗（vacc）、NCX-2216饮食（NCX）或同时接种Aβ1–42接种NCX-2216饮食（vacc+NCX）。与循环Aβ分离后，滴度以μg IgG/ml血清表示。**表示P<0.01。

APP+PS1转基因小鼠在10个月大时的病理学，即研究开始时的小鼠年龄，已经在前面详细描述过(Gordon等人，2002年). 总之，在10个月大的时候，这些小鼠的额叶皮层和海马的总Aβ染色分别为25%和8%，而刚果红染色显示额叶皮层的10%和海马的2%为阳性染色。虽然未量化，但在10个月大的APP+PS1转基因小鼠中可检测到血管淀粉样蛋白。10个月大时，小胶质细胞激活率低，只有0.2%的额叶皮层出现阳性染色。

Aβ免疫组织化学显示了该年龄段APP+PS1转基因小鼠海马的预测染色模式(图2面板A）。CA1区以及海马齿状回和门区沉积有高密度的aβ。海马体其余部分的沉积物较少。其他脑区显示出Aβ染色，与之前APP+PS1转基因小鼠的显示类似(Gordon等人，2002年). 接种疫苗或NCX-2216治疗后，在整个大脑中观察到Aβ免疫组织化学减少。在海马体中，整个区域都观察到显著减少，尤其是CA1和齿状回区域(图2B组-疫苗接种和C组-NCX-2216）。有趣的是，尽管每种治疗都有单独的疗效，但当两种治疗同时进行时，Aβ没有额外的降低(图2面板D）。对阳性染色所占面积百分比的分析表明，单独接种、单独接种NCX-2216和联合接种NCX-225均能减少额叶皮层和海马的Aβ沉积(图3). Aβ1–42仅接种疫苗就可使额叶皮层aβ沉积减少35%（P<0.01）(图3A组）和海马减少25%（P<0.01）(图3面板B）。NCX-2216单独治疗后，额叶皮质减少18%（P=0.06），海马减少20%（P<0.01）(图3面板B）。Aβ1–42与NCX-2216联合接种后，额叶皮质减少40%（P<0.01）(图3A组）和海马体减少30%（P<0.05）(图3面板B）。与三个治疗组相比，这些减少没有显著差异。

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所有三个治疗组的Aβ免疫组化均降低。未经治疗的APP+PS1转基因小鼠海马中显示Aβ免疫组化（A组），Aβ1–42接种疫苗（B组）、NCX-2216饮食（C组）或同时接种Aβ1–42接种NCX-2216饮食（D组）。在面板A中，CA1：菊角1，CA3：菊角3，DG：齿状回。面板A中的比例尺=120μm。

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Aβ免疫组织化学定量显示，与对照组APP+PS1转基因小鼠相比，所有三个治疗组的表达量均减少。图表显示了未接受治疗（续）、Aβ1–42接种疫苗（vacc）、NCX-2216饮食（NCX）或同时接种Aβ1–42接种NCX-2216饮食（vacc+NCX）。面板A显示额叶皮层的量化，而面板B显示海马体的量化。*与未经治疗的小鼠相比，表示P<0.05，**表示P<0.01。

刚果红是一种组织化学染色剂，在β折叠片形成中结合致密淀粉样沉积物。刚果红染色在该年龄段APP+PS1转基因小鼠中的分布与Aβ免疫组织化学观察到的非常相似。然而，与30%的海马被Aβ阳性染色所占据相反，只有2%的海马被刚果红阳性染色所占领(图4A组），显示了Aβ免疫组化测量中弥漫性斑块的丰富性。接种Aβ疫苗后，我们观察到嗜酸性淀粉样蛋白沉积减少，特别是在海马门区域以及CA1和齿状回区域周围(图4面板B）。在接受NCX-2216治疗的小鼠中观察到致密淀粉样沉积的类似减少(图4C组）或同时接受Aβ的小鼠1–42疫苗接种和NCX-2216(图4面板D）。刚果红阳性染色所占面积百分比的量化显示，与对照APP+PS1转基因小鼠相比，所有三个治疗组的额叶皮层和海马中刚果红染色总量显著减少(图5面板A）。额叶皮质和海马的这些减少分别为25-35%和30-40%，三个治疗组之间没有显著差异。

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三个治疗组的刚果红染色均减少。未经治疗的APP+PS1转基因小鼠海马刚果红染色（A组），Aβ1–42接种疫苗（B组）、NCX-2216饮食（C组）或同时接种Aβ1–42接种NCX-2216饮食（D组）。在面板A中，CA1：菊角1，CA3：菊角3，DG：齿状回。面板A中的比例尺=120μm。

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刚果红染色定量显示，所有三个治疗组的刚果红总量均减少，但Aβ后血管刚果红增加1–42接种疫苗。图表显示了未接受治疗（续）、Aβ1–42接种疫苗（vacc）、NCX-2216饮食（NCX）或同时接种Aβ1–42接种NCX-2216饮食（vacc+NCX）。实心条表示额叶皮层的数值，而开放条表示海马体的数值。面板A显示刚果红总量的量化，面板B显示血管刚果红的量化，而面板C显示实质刚果红的计算。**表示与对照组相比P<0.01，如面板B所示。

有趣的是，当我们在用于刚果红总量量化的相同图像上量化血管系统中的刚果红染色时，我们观察到接受Aβ疫苗接种的小鼠在接受或不接受NCX-2216治疗的情况下增加，但在单独接受NCX-22016治疗的小鼠中没有增加(图5面板B）。Aβ治疗1–42单独接种疫苗导致额叶皮层血管淀粉样蛋白增加2倍，海马增加1.75倍(图5面板B）。当Aβ1–42接种NCX-2216后，我们观察到额叶皮层增加了3倍，海马增加了2.5倍(图5B组），这两个治疗组没有显著差异。

从刚果红总值中减去血管刚果红值，以计算实质淀粉样蛋白负荷。这表明Aβ1–42接种NCX-2216治疗前后，在减少额叶皮层（P<0.05）和海马（P=0.4）实质淀粉样蛋白沉积方面，其效果略优于NCX-226。

普鲁士蓝染色检测含铁血黄素，这是一种由小胶质细胞引起的血红蛋白降解产物，小胶质细胞存在于发生小出血的地方。在对照APP+PS1小鼠以及用NCX-2216治疗的小鼠中检测到少量微出血。然而，接种Aβ后1–42我们观察到大量的微出血以及一些较大的出血，如图所示图6（面板B和D）。定量地说，我们观察到aβ引起的微出血数量增加了4倍1–42接种疫苗，当小鼠接种NCX-2216疫苗时，这种增加是相同的(图6面板E）。此外，值得注意的是，接种疫苗后出现的微出血更大。

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Aβ后CAA相关微出血增加1–42接种疫苗。切片用普鲁士蓝染色含铁血黄素（静脉外铁），细胞用得克萨斯红复染。面板A和C显示对照处理的APP+PS1转基因小鼠的海马，而面板B和D显示Aβ1–42接种APP+PS1转基因小鼠。对于面板A和B，面板A中的比例尺代表120μm。面板C和D是面板a和B方框中所示区域的较高放大倍数，面板C中的比例尺=50μm。在面板A中，CA1：菊角1，CA3：菊角3，DG：齿状回。面板E显示了普鲁士蓝染色的量化，并显示了未接受治疗（续）、Aβ1–42接种疫苗（vacc）、NCX-2216饮食（NCX）或同时接种Aβ1–42接种NCX-2216饮食（vacc+NCX）。**与对照组相比，P<0.01。

CD45免疫组化显示小胶质细胞处于激活状态。CD45免疫染色用刚果红复染显示对照组APP+PS1转基因小鼠致密、嗜稠淀粉样沉积物周围的小胶质细胞激活(图7面板A）。Aβ治疗1–42仅接种疫苗似乎就可以在剩余的致密淀粉样沉积物和血管沉积物周围显示出更多的小胶质细胞活化(图7面板B）。仅用NCX-2216治疗，其余淀粉样沉积周围的小胶质细胞活化没有变化。(图7面板C）。有趣的是，Aβ1–42与NCX-2216处理一起接种疫苗显示出与单独接种疫苗相同的染色模式；在薄壁组织和血管中残留淀粉样沉积物周围似乎有更多的小胶质细胞活化(图7面板D）。量化CD45免疫组织化学染色阳性的区域百分比显示，在任何治疗组的额叶皮层中均无明显变化(图8面板A）。NCX-2216治疗后，海马区小胶质细胞活化显著减少(图8然而，在Aβ1–42接种疫苗或同时进行两种治疗(图8面板B）。然而，这些测量结果不仅反映了每个沉积物中小胶质细胞的激活量，还反映了存在沉积物的数量。由于观察到所有治疗都显著减少了致密淀粉样沉积，我们计算了CD45免疫组织化学与刚果红总面积的比值，以估计每个淀粉样沉积的小胶质细胞活化。我们发现Aβ1–42接种或不接种NCX-2216治疗后，CD45:刚果红比率增加，这表明与额叶皮层残留淀粉样蛋白沉积相关的小胶质细胞活化增加(图8面板C）和海马(图8面板D）。在接受NCX-2216治疗后，额叶皮层的比率没有变化(图8面板C）或海马(图8面板D）。

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给予Aβ的小鼠在剩余斑块周围CD45免疫组织化学增加1–42接种疫苗。未经治疗的APP+PS1转基因小鼠（A组）的海马中显示刚果红CD45免疫组化染色，Aβ1–42接种疫苗（B组）、NCX-2216饮食（C组）或同时接种Aβ1–42接种NCX-2216饮食（D组）。在面板A中，CA1：菊角1，CA3：菊角3，DG：齿状回。面板A中的比例尺=120μm。

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CD45免疫组织化学定量显示Aβ后残留沉积物周围增加1–42接种疫苗。图表显示了未接受治疗（续）、Aβ1–42接种疫苗（vacc）、NCX-2216饮食（NCX）或同时接种Aβ1–42接种NCX-2216饮食（vacc+NCX）。面板A和B显示CD45阳性染色所占总面积百分比的量化，面板C和D显示CD45染色与刚果红的计算比率。面板A和C显示额叶皮质的量化，而面板B和D显示海马的量化。*与对照APP+PS1小鼠相比，表明P<0.05。

讨论

我们在这里展示了两种降低Aβ的疗法，Aβ1–42接种疫苗和NCX-2216在减少紧凑和弥散状态下的Aβ沉积方面同样有效。然而，两种疗法的联合应用并没有增加淀粉样蛋白的去除。Aβ主动免疫增加了CAA水平和微出血，NCX-2216治疗未观察到这种效果。NCX-2216并没有减弱Aβ疫苗接种的这种潜在不利影响。

NCX-2216此前已被证明可以减少APP+PS1转基因小鼠中淀粉样蛋白的沉积。Jantzen等人（2002年）结果表明，在APP+PS1转基因小鼠的饮食中给予NCX-2216 5个月后，淀粉样蛋白负荷显著降低。在当前的研究中，我们发现，使用NCX-2216治疗9个月后，Aβ免疫组化检测到淀粉样蛋白负荷显著降低，其中大多数染色沉积物呈弥漫性，刚果红检测到致密淀粉样蛋白沉积。这些减少的百分比与之前观察到的类似(Jantzen等人，2002年). NCX-2216减少淀粉样蛋白沉积的机制尚不清楚。体外研究表明，一些非甾体抗炎药可以通过与环氧化酶抑制无关的γ-分泌酶抑制来减少Aβ的生成(Weggen等人，2001年). 也有研究表明，NCX-2216激活过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）比亲本NSAID氟比洛芬更有效(Bernado等人，2006年)这表明了Aβ减少的另一种机制，因为在转基因小鼠模型中，PPAR-γ激动剂吡格列酮也能在体内减少Aβ(Heneka等人，2005年)，可能是通过下调β-分泌酶RNA的表达(Sastre等人，2006年).

Aβ1–42在转基因小鼠中，主动接种疫苗可以产生抗Aβ抗体滴度并减少淀粉样蛋白沉积(Schenk等人，1999年). 在APP+PS1转基因小鼠中，它也被证明可以减轻记忆丧失(Morgan等人，2000年)和单个转基因APP小鼠(Janus等人，2000年). 我们还发现，在主动接种疫苗后，去除致密的、嗜胶粒淀粉样蛋白沉积似乎依赖于小胶质细胞的激活(Wilcock等人，2001年)并在颅内直接注射抗Aβ抗体(Wilcock等人，2003年). 在当前的研究中，我们表明Aβ疫苗接种可产生显著的抗Aβ抗体滴度，减少淀粉样蛋白沉积，并增加与剩余致密淀粉样蛋白沉积物相关的小胶质细胞活化。有人建议，Aβ免疫治疗可以防止淀粉样蛋白进一步积聚或清除现有沉积物。目前的研究在这个问题上没有结论。而Aβ中的淀粉样蛋白负荷1–42接种疫苗的小鼠比我们之前在10个月大的小鼠中观察到的大（本研究开始时的小鼠年龄）(Gordon等人，2002年)目前尚不清楚这些结果是否主要反映了淀粉样蛋白沉积的部分预防，或者是否发生了某些沉积的清除和周转。

有趣的是，我们还发现接种疫苗后CAA和CAA相关微出血明显增加。我们之前已经证明，这种现象是在用Aβ抗体进行被动免疫后发生的(Wilcock等人，2004c). 其他组也表明，用抗Aβ抗体治疗老年APP转基因小鼠会导致血管微出血的发生率增加（Pfeifer等人，2002；Racke等人，2005年). 然而，到目前为止，在主动免疫后，这种血管不良事件尚未报告。一些使用转基因小鼠检测抗Aβ免疫治疗的研究检查了大脑是否有微出血，但没有检测到此类事件。其中一项研究使用了不同的转基因小鼠模型（J20 APP转基因小鼠），仅在10个月大时，即接种6个月疫苗后对其进行检测(Seabrook等人，2006年). Jucker及其同事（2002年）在对老年和年轻APP转基因小鼠进行被动免疫治疗后发现，年龄似乎是免疫治疗相关微出血发生的一个重要因素。只有CAA显著的老年小鼠出现了微出血，而接受相同被动免疫方案的6月龄小鼠没有出现任何微出血。研究人员Racke及其同事（2005年）也证明了微出血的发生依赖于所使用的抗体。用266（中区抗体；不结合斑块）或3D6（N末端抗体；结合斑块）抗Aβ抗体被动免疫22个月大的PDAPP转基因小鼠6周，发现只有3D6抗体导致CAA发病率增加。作者认为，结果表明斑块结合是增加微出血发生的必要条件。我们之前已经证明，在这里使用的主动免疫方案后产生的抗Aβ抗体主要是具有Aβ反应性的N末端抗体，与可溶性Aβ1-40、Aβ竞争1–42和Aβ1–16(Dickey等人，2001年)，但不通过Aβ10-20、20-29或29-40。我们还发现，用这种方案进行主动免疫会产生主要为IgG1和IgG2b等型的抗体，以及低水平的IgG2a(Dickey等人，2001年).

主动Aβ疫苗接种进入2期临床试验，由于6%的患者出现脑膜脑炎而终止给药(Orgogozo等人，2003年). 尽管试验暂停，但仍继续观察患者，一些患者继续产生抗Aβ抗体。来自试验中患者的两份尸检报告显示，患有脑膜脑炎的患者脑部有T细胞浸润(Nicoll等人，2003年;Ferrer等人，2004年). 在迄今为止公布的三份尸检报告中，所有报告都表明接种疫苗的患者CAA的严重程度高于同一阶段AD患者的平均水平(Nicoll等人，2003年;Ferrer等人，2004年;Masliah等人，2005年). 其中一份报告还指出，大脑中存在“多发性皮层出血”(Ferrer等人，2004年)第二分表示CAA“严重”（3分），通常表示有出血(Masliah等人，2005年).

虽然有人可能假设较低剂量的抗体可以防止免疫治疗引起的血管不良事件的发生，但随着时间的推移，即使相对较低水平的抗aβ抗体也足以产生CAA相关的微出血。此外，仅使用NCX-2216治疗，淀粉样蛋白沉积的减少程度与疫苗相似，但并未导致血管沉积的增加。考虑到主动免疫和被动免疫都会增加血管染色，似乎与抗体介导的清除有关的某些东西是导致CAA增加的原因，而不是淀粉样蛋白减少就其本身而言。

根据近似计算，当前主动免疫研究中获得的滴度（1毫升血清中8μg）在转化为被动免疫方案时，似乎相当于3mg/kg剂量的抗aβ抗体。这是我们之前显示的剂量的30%（使用被动免疫），在抗Aβ抗体治疗三个月后导致微出血和CAA恶化(Wilcock等人，2004c). 使用与本文报道的类似的主动免疫方案，我们之前已经证明抗体滴度在7次免疫后达到最高水平。停止接种后，抗体滴度在两个月后仅下降了20%，上次免疫后14个月仍有可检测的滴度(Dickey等人，2001年). 因此，尽管最终免疫后血清抗体滴度可能会稍高，但我们不会在研究早期预测抗体滴度会显著升高。与我们之前的研究一起(Wilcock等人，2004c)这里的数据表明，当免疫治疗增加血管淀粉样蛋白时，抗Aβ抗体的水平可能不如治疗时间和小鼠年龄显著。

此外，非甾体抗炎药治疗和活性Aβ疫苗接种并没有减轻疫苗接种的血管后果，也没有损害清除率。在我们早期的脑内应用抗Aβ抗体的研究中，我们发现NCX-2216部分减弱了小胶质细胞的激活和抗体引起的致密淀粉样沉积物的清除(Wilcock等人，2004a). 相反，地塞米松完全抑制了这两种作用，这意味着NCX-2216在体内并没有最大限度地抑制小胶质细胞。

服用含有Aβ的NCX-22161–42接种疫苗后，淀粉样蛋白的去除率并没有比单独治疗更高。淀粉样蛋白去除的程度是有限的，aβ去除和生成之间存在动态平衡。我们观察到，在颅内注射LPS后，先前出现了一种平衡效应，即淀粉样蛋白在7天内被清除，但在4周后恢复到控制水平。本质上，小鼠在三周内积累了与最初16个月积累的淀粉样蛋白相同的数量(Herber等人，2004年). 抗体介导的Aβ去除有三种机制。这些是Fc受体介导的小胶质细胞吞噬作用(Bard等人，2003年)Aβ从大脑流出进入血浆(DeMattos等人，2001年)可能通过FcRn受体(Deane等人，2005年)以及抗体对淀粉样沉积物的直接催化分解(Solomon等人，1997年). NSAID介导的Aβ减少的拟议机制（见上文）与抗体介导的减少机制没有任何重叠。抗体介导的小胶质细胞活化可能导致表型转换为活化的小胶质电池状态，而非甾体抗炎药不再起作用。我们以前曾建议小胶质细胞可能存在于不同的激活状态，其中一种可能实际上对AD有益(Morgan等人，2005年).

总之，我们在这里已经表明，两种淀粉样蛋白降低疗法联合使用在其淀粉样蛋白减少能力上没有表现出相加或协同效应。然而，重要的是，我们发现Aβ主动免疫1–42增加CAA水平和微出血。非甾体抗炎药（如NCX-2216）不会减弱这种效应。虽然目前尚不清楚微出血对AD的临床影响，但已有研究表明，CAA与脑出血以及缺血性梗死相关(Attems，2005年). 虽然我们之前已经证明免疫治疗导致的微出血不会影响小鼠的认知能力(Wilcock等人，2004c)本文提供的数据应增加对正在进行的临床试验的担忧，即即使循环中的抗Aβ抗体水平很低，也可能导致治疗时间较长的血管并发症。

致谢

这项工作得到了NIH拨款AG 15490和AG 18478的支持。DGM还从AG25711获得工资支持。唐娜·M·威尔科克（Donna M.Wilcock）是老年痴呆症研究的本杰明学者。作者感谢Karen Ashe和Karen Duff尽早获得本研究中使用的转基因小鼠。我们感谢Ennio Ongini和Nicox，S.A.为我们的研究捐赠NCX-2216。我们还感谢Paul E.Gottschall为我们提供免疫组织化学多克隆抗Aβ抗体。

缩写

AD公司
阿尔茨海默病
应用程序
淀粉样前体蛋白
加利福尼亚州
海马氨角区
CAA公司
脑淀粉样血管病
酶联免疫吸附试验
酶联免疫吸附试验
NSAID公司
非甾体抗炎药
PPARγ
过氧化物酶体增殖物激活受体γ
第1阶段
早老素-1
RGB（RGB）
红、绿、蓝视频分割
核糖核酸
核糖核酸

脚注

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