人乳腺癌中Clusterin的过度表达

摘要

最初因其聚集精子的活性而得名，1凝集素参与了许多生物学过程，包括精子成熟、脂质转运、程序性细胞死亡、补体级联调节、膜再循环、细胞粘附和型钢混凝土-诱导转化。2由于它已由多个实验室在不同的系统中独立研究，因此被赋予了不同的名称，例如SGP-2、聚集蛋白、载脂蛋白J、SP 40–40、补体裂解抑制剂、gp80、糖蛋白III和T64。三簇合蛋白的人类同源物由449个氨基酸组成，其中两个40-kd亚基（α和β）由一个独特的五个二硫键基序连接。4蛋白质前体编码在单个2 kb mRNA上，该mRNA由位于8号染色体（8p21）上的单个拷贝基因转录而来。5物种间的高度序列保守性、广泛的组织分布和高循环浓度表明clusterin在生物学上发挥着重要作用。聚集蛋白是否真的是一种多功能蛋白质，或者其各种功能的共同机制尚不清楚。

clusterin的一些功能可能与肿瘤发生有关：这些功能包括补体防御、细胞凋亡的启动、膜保护和细胞-细胞或细胞-基质接触的维持。除了在免疫系统调节中的作用外，没有明确的生化证据支持聚集蛋白的特定功能。6凝集素是液相膜攻击复合物（SC5b-9）的一部分，作为补体抑制剂发挥作用。6-8补体系统的生理作用之一是溶解外来细胞，包括感染病毒的细胞和肿瘤细胞。9因此，表达使补体系统失活的表面成分的肿瘤细胞将能够避免补体系统的破坏，从而继续长大并发展为更多的恶性肿瘤。

基于凋亡组织中的高水平表达，最初提出该蛋白可能与凋亡有关。6因此，clusterin mRNA已被广泛用作凋亡细胞死亡的遗传标记。三在激素依赖性组织中，如前列腺和乳腺，激素消融后可诱导聚集蛋白表达。10,11然而，这些研究并没有分析是哪些细胞导致了聚集素基因表达的增加，哪些细胞发生了凋亡，哪些细胞注定要存活。然而，最近越来越多的证据表明，在发生凋亡的细胞中，聚集素的表达并没有增强，而是下调，并且其在凋亡组织中的表达仅限于存活的旁观者细胞。12-14此外，如大鼠肝脏所示，该基因的表达是在细胞凋亡以外的过程中诱导的，包括有丝分裂和坏死。15这些过程涉及到实质性的膜重塑，表明聚集蛋白的表达可能参与维持膜完整性，并在膜重塑过程中防止补体攻击。8如果clusterin参与预防膜重塑过程中的免疫攻击，clusterin的异常表达可能参与炎症和肿瘤疾病的发病机制。先前的实验工作表明，聚簇素在形态转化中发挥了作用。16-18

由于凝集素可能提供一种逃避免疫监视和细胞凋亡的方法，因此更好地了解其表达的生物学可能会导致对癌症进展的新见解。在这项研究中，我们检测了该分子在一大组乳腺肿瘤中的表达。这是首次报告显示，从乳腺癌发生的早期到晚期，聚集素在恶性上皮中表达。

材料和方法

结果

正常上皮细胞中clusterin的表达均为阴性。良性病变仅在19%的样本中呈阳性染色（30例中8例）：18例纤维腺瘤中2例呈阳性染色，6例纤维囊性疾病中1例呈阳性，4例结节性腺病中1例，2例乳头状瘤中1例阳性，12例无异型性导管增生中3例呈阳性。与这些良性病变相比，非典型增生中clusterin表达增加（7/15，47%，P（P）=0.08）和导管癌就地（35人中的17人，49%，P（P）=0.01）（图1▶，表1▶). 在高级别（14例中的7例，50%）和低级别（21例中的10例，48%）DCIS中也有类似的聚集蛋白表达。在浸润性癌中，与良性病变相比，clusterin表达显著增加(P（P）< 0.001). 因此，53%（114例中的60例）的原发癌聚集蛋白表达阳性（表1）▶.在浸润性癌中包含以下区域就地疾病组（31例），两组分表达相似。Clusterin的表达也显示从原发癌到淋巴结转移癌的显著增加，其中40例中只有8例Clusterin表达阴性(P（P）=0.004）（图2▶; 表1▶). 淋巴结的染色强度和细胞分布与原发肿瘤相似。在15例原发性癌阴性的病例中，有10例（67%）淋巴结转移呈阳性，而大多数（25例中有22例，88%）有clusterin表达的原发性癌在淋巴结转移中也显示出免疫染色（图2）▶.

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图1。

增殖性病变和DCIS中聚集素表达的免疫组织化学分析。一：Clusterin阴性导管增生，无异型性。B类：不典型导管增生，染色阳性。C类和D类：低级别DCIS中可见强烈的细胞质聚集蛋白染色，核级别中等，无坏死(C类)在高级DCIS中(D类). 所有字段均放大×400。所有切片均用苏木精复染。

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图2。

浸润性乳腺癌中clusterin的免疫组化和细胞质阳性染色就地杂交。一和B类：小叶癌中聚集素的免疫反应性（原始放大倍数：×50和×400）。C类和D类:现场polly中clusterin mRNA的杂交分析(C类)适度(D类)分化型导管癌（均为400例）。E类和F类浸润性导管癌的淋巴结转移（×100和×400）。所有切片均用苏木精复染。

染色模式为颗粒细胞质（图1和图2）▶ ▶这表明clusterin可能存在于分泌囊泡中。只有3例出现核染色。

我们发现聚集蛋白免疫反应程度与雌激素和孕激素受体表达呈负相关(P（P）=0.02和P（P）分别=0.001）。聚簇素阳性肿瘤的平均直径大于阴性肿瘤的直径（3.01与2.28) (P（P）= 0.04). 关于分化程度，大多数低分化肿瘤的clusterin表达呈阳性（9/12），尽管与高分化和中分化肿瘤的表达相比没有统计学意义。我们没有检测到聚集蛋白免疫反应与癌症分期、绝经状态（绝经前后）、组织学类型或Ki67免疫染色之间的任何相关性（表2）▶.

我们通过免疫组织化学方法发现乳腺癌中聚集蛋白表达增加与这些上皮细胞的凋亡活性呈负相关。因此，clusterin阳性肿瘤的平均凋亡指数为0.60与1.1聚集素阴性肿瘤（表2）▶.

我们还通过就地对30例随机选择的乳腺癌进行杂交，以确定乳腺肿瘤中clusterin表达的特异性细胞模式。乳腺癌细胞中聚集蛋白免疫组化检测的定性结果与就地杂交（图2）▶事实上，用这种方法检查的30例患者中，只有2例ISH阳性，免疫组化阴性。在所有情况下，感测探针均未发出杂交信号，证明了所观察到的标记的特异性。

通过单变量分析，与短期无复发生存相关的变量为高组织学分级(P（P）<0.001），肿瘤较大(P（P）=0.01），存在淋巴结转移(P（P）<0.001），雌激素和孕激素受体阴性(P（P）=0.02）和高凋亡指数(P（P）=0.004）（表3）▶。凝集素阳性和阴性肿瘤之间未观察到差异。在多变量分析中，只有腋窝淋巴结状态（相对危险度为2.99；95%可信区间为1.41-6.35）、组织学分级（2.33；1.22-4.43）和凋亡程度（1.88；1.11-3.18）具有独立的预后价值。

讨论

先前的研究描述了聚集蛋白在几种类型的癌症中的表达增加。在视网膜细胞被突变的Rous肉瘤病毒恶性转化后，它会增加。16在实验性前列腺癌中，N-亚硝基-N-甲基脲引发和丙酸睾酮促进后，聚集素表达水平较高。17聚集蛋白上调与前列腺癌前病变相关18与正常前列腺上皮或良性前列腺病变相比，前列腺癌中clusterin的表达更高。22与同一患者正常肾组织中聚集素mRNA水平相比，肾透明细胞癌中聚集素的转录活性高出三到四倍。23

据我们所知，本研究是首次探讨聚集素在乳腺癌发生发展中的潜在作用。我们的研究结果表明，该基因的上调与肿瘤从正常组织到癌前和恶性乳腺病变的不同进展步骤密切相关，在淋巴结转移中表达更高。因此，clusterin的过度表达可能代表了一种后天获得的表型特征，有助于乳腺肿瘤细胞的局部侵袭和扩散，事实上，我们的结果也表明clusterin的表达与肿瘤大小呈正相关。因此，凝集素可能是确定特定乳腺肿瘤侵袭性的重要因素。

Clusterin过度表达与雌激素和孕激素受体阴性状态显著相关。此外，在三种侵袭性癌中检测到核聚集蛋白的表达，雌激素和孕激素受体的表达也为阴性。在之前的一项研究中，Akakura等人24据报道，复发性雄激素依赖性肿瘤细胞的核聚集蛋白染色，这些作者认为细胞核中聚集蛋白的存在可能有助于抑制凋亡过程中的早期事件。

根据其他报告，我们还发现聚集素基因表达与程序性细胞死亡没有直接关系。12,15,25事实上，我们发现聚集蛋白阳性肿瘤的凋亡指数低于阴性肿瘤。一项研究报告，将反义寡核苷酸转染到凝集素后，细胞死亡显著增加。14这种负相关可能支持这样一种假设，即防止凋亡死亡可能在一定程度上解释了肿瘤的生物学侵袭行为。然而，凝集素在细胞死亡/存活机制中的确切生物学功能尚待确定。在这个意义上，最近的一项研究报告了在退化大鼠腹侧前列腺的凋亡细胞和存活细胞中聚集素的不同亚型。26凋亡相关亚型主要定位于核周区，而存活相关亚型定位于细胞质，这在我们研究的大多数原发性和转移性乳腺癌中都有发现。需要进一步的研究来确定聚集蛋白不同亚型的确切功能，以及它们表达的变化如何改变肿瘤细胞的特性。

Clusterin介导的对补体诱导的细胞溶解的抑制可能保护癌细胞免受补体介导的细胞溶解，并有助于这些细胞的高度转移表型。它存在于细胞表面，并普遍存在于几乎所有类型的生物流体中，可能保护细胞膜免受有害成分的影响。这种保护作用可能有利于肿瘤细胞的转移表型，肿瘤细胞可以在组织和体液中迁移而不会造成过度损伤。2因此，一个吸引人的假设是，聚集素诱导是对环境变化的反应，而不是细胞死亡的诱因。以这种方式，聚簇素可以被认为是热休克蛋白的细胞外版本。26,27

总之，乳腺癌中凝集素的检测表明，该蛋白可能在乳腺肿瘤的发生和发展中起作用，尽管尚未证明其作为生存预后因素具有临床实用性。需要进一步研究来区分聚集蛋白是否反映了肿瘤进展增加的原因或影响。

致谢

脚注

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