图5

H（H）₂O（运行）₂直接抑制HsAtgA的活性。(A类)通过培养重组His来测试裂解活性₆-HsAtg4A（0.1μg）和His₆-GATE-16-HA（0.3μg）在50 KT反应缓冲液中，30°C，在指定浓度的DTT存在下放置45分钟，然后使用抗-His单克隆抗体进行Western blot分析。使用Bio-Read Multi-Analyyst程序用密度计对三个单独实验产生的谱带进行量化，并将其表示为总GATE-16中裂解形式的平均百分比。(^*)表示未裂开的His₆-GATE-16-HA和(^**)表明劈开了他的₆-门-16。(B类)他的₆-HsAtg4A在200μM DTT存在下于4°C孵育10分钟₆-然后在50 KT中培养HsAtg4A（0.1μg）（以获得15μM DTT），H的指示浓度为₂O（运行）₂在25°C下保持5分钟，然后重组His₆-添加GATE-16-HA（0.3μg），并在30°C下孵育45分钟。对三个单独实验的反应混合物进行了分析，并如（A）所述。(C类)他的₆-HsAtg4A（0.1μg）与重组His孵育₆-GATE-16-HA（0.3μg），在以下程序后：不处理（1道）；在25°C下用200μM DTT预处理5分钟（第2车道）；用200μM DTT治疗，然后用1 mM H治疗₂O（运行）₂在25°C下保持5分钟（3号车道）；用200μM DTT治疗，然后用1 mM H治疗₂O（运行）₂持续5分钟，然后进行2 mM DTT（车道4）。反应混合物用抗-His单克隆抗体进行Western blot分析。