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图6。Western blot分析MMC处理的MCF7和U2OS细胞中指示蛋白在指示时间点的p53依赖性表达。b-Actin作为加载对照。

图7。Western blot分析显示，在MMC治疗HCT116 p53的指定时间点之前，用zVAD治疗2小时后，指定蛋白的表达^+/+和p53^-/-细胞。b-肌动蛋白被用作负荷控制。

图8。STS处理的HCT116 p53在指定时间点的指示蛋白的Western blot分析^+/+和p53^-/-细胞。b-肌动蛋白被用作负荷控制。

SI文本

将25 ml浓缩分析试剂（Bio-Rad）添加到100 ml Milli-Q水中用96 well微孔板稀释的1 ml溶解样品中，以测定样品的蛋白质浓度（1）。使用不同浓度的牛血清白蛋白构建标准曲线。使用多扫描阅读器（Labsystems）读取平板。

使用前，将所有样品稀释至500 ml，其中含有7 M尿素、2 M硫脲、1%3-（3-氯酰胺丙基）二甲基铵-1-丙基磺酸（CHAPS）、0.4%固定化pH梯度（IPG）缓冲液、0.3%二硫苏糖醇（DTT）和微量溴酚蓝。通过对样品溶液中的预制IPG条（Bio-Rad）进行主动复水，将总细胞提取物用于等电聚焦。使用高分辨率微pH范围（pH:3.9-5.1；4.7-5.9；5.5-6.7；6.3-8）IPG条带。蛋白质（400 mg/IPG条）被加载并在蛋白质IEF细胞（Bio-Rad）中聚焦约52900 Vh过夜。等电聚焦（IEF）后，立即用50 mM Tris-HCl（pH 8.8）在6 M尿素、30%甘油和2%十二烷基硫酸钠中使板条平衡2 x 15分钟。DTT（2%）包含在第一平衡步骤中，碘乙酰胺（2.5%）包含在第二平衡步骤中以还原和烷基化游离硫醇。第二维度使用具有10-13%线性丙烯酰胺梯度（1.5 x 200 x 230 mm）的SDS凝胶。将IEF条小心地涂在凝胶顶部，并使用溶解在SDS/PAGE流动缓冲液中的温琼脂糖（0.5%）固定到位。电泳在42000 Vh下进行过夜。为了进行图像分析，凝胶用硝酸银（2，3）染色。对于制备凝胶，使用了更多材料（两到十倍），并使用Sypro-Ruby（分子探针）或Silver Plus染色（Bio-Rad）对斑点进行了可视化。

使用GS-710成像密度计（Bio-Rad）以84.7 x 84.7 mm分辨率扫描2D凝胶。使用Bio-Read的PDQuest软件分析数据。

使用PDQuest 7.1软件，将来自不同治疗时间点的多肽斑点与参考凝胶中的斑点进行匹配。光斑强度标准化，

减去背景，定位峰并测定相对染色强度。通过使用学生t检验和Mann-Whitney检验进行统计分析来确定表达变化（P<0.05）。

使用EXQuest斑点切割器（Bio-Rad）去除Sypro-Ruby凝胶中的蛋白质斑点。使用MassPREP机器人蛋白质处理系统（Micromass）进行凝胶内消化。凝胶块去渍。添加胰蛋白酶（25µl的12 ng/µl溶液，在50 mM Ambic中），并在40°C下培养4.5小时。用30µl 5%甲酸/2%乙腈提取肽，然后用24µl 2.5%甲酸/50%乙腈提取。乙腈在大气压下在10℃下蒸发过夜^o（o）C.对于电喷雾电离（ESI）MS/MS，肽提取物用C脱盐₁₈ZipTips（Millipore），使用10µl 70%乙腈/0.1%三氟乙酸（TFA）活化并平衡两次，10µl 50%乙腈/0.1%TFA活化并平衡两次，最后使用10µl 0.1%TFA活化并平衡两次。通过移液20次将样品装载到ZipTip上，并使用10µl 0.1%TFA清洗两次。用60%乙腈/1%乙酸洗脱胰蛋白酶片段。

光盘（CD）-自动处理胰蛋白酶消化物的技术。使用Gyrolab MALDI SP1工作站（瑞典Gyros AB）分析低产量蛋白质样品，以提高制备效率。在该仪器中，96个微柱被纳入CD平台，并通过反相色谱用于平行脱盐。每列用C填充₁₈树脂的体积为10 nl，置于颗粒过滤器顶部。用50%的乙腈在水中调节色谱柱。样品被加载到柱上，溶剂通过旋转圆盘通过。将含有盐和其他极性成分的洗涤液（200 nl 0.1%TFA）导入废物出口。使用含有1mg/mlα-氰基-4-羟基肉桂酸基质和0.1%TFA的200nl 50%乙腈从色谱柱中洗脱肽。将洗脱液捕获在200 x 400µm的开放MALDI靶区中，使溶剂蒸发，肽/基质混合物结晶。对于光盘上的MALDI分析，将光盘平台切成两半，以容纳MALDI仪器的目标隔间。在质谱分析中，使用了旅行者DE-PRO（应用生物系统）、Biflex或Ultraflex TOF/TOF仪器（Bruker），该仪器在反射器模式下工作。

胰蛋白酶片段通过基质辅助激光解吸电离（MALDI）MS（Voyager DE-PRO，Applied Biosystems）和电喷雾电离（ESI）四极飞行时间串联MS（Micromass）进行分析。样品与饱和α-氰基-4-羟基肉桂酸溶液在50%乙腈/0.1%TFA中以1:1（v/v）的比例混合。使用MS-Fit搜索程序进行数据库搜索(http://prospector.ucsf.edu/). 只考虑具有三个或更多匹配肽质量的蛋白质命中。进一步的要求是该蛋白应为人类蛋白或与人类蛋白高度同源，并且理论上的pI和M_第页值不应与在2D凝胶分离中观察到的值过度偏离。串联质谱仪配备了正交取样ES-界面（Z喷雾，微粒）。样品通过镀金纳米ES针（Protana）引入。施加800-1000 V的毛细管电压、40-45 V的锥电压和4.2 eV的碰撞能量。将样品气溶胶溶解在氮气流中。在碰撞诱导解离（CID）过程中，以氩气为碰撞气体，碰撞能量在15-30 eV范围内。