几种酵母/真菌物种有能力采用两种生长形式,一种是营养生长(酵母)形式和假菌丝或丝状形式。致病性生物,如白色念珠菌,这个形态学过渡对宿主组织的侵袭很重要,因此发病机理(1). 在非致病生物中,这种转变可能发生由于营养限制,因此被认为是允许觅食营养物质的机制。洞察信号形态变化所必需的转导机制将有助于理解基本的生物现象和发病机制。
芽殖酵母酿酒酵母提供了研究形态转变的遗传系统植物向丝状发育。在二倍体酵母中环境固定氮导致植物性过渡细胞呈圆形并以两极方式萌芽的生长假菌丝生长,细胞拉长,呈单极性萌发萌芽模式(2). 在单倍体酵母中,营养限制导致类似的发育开关,允许细胞穿透表面琼脂培养基的侵入性生长过程(见参考文献)。三–6用于审查)。为了简单起见,我们将使用术语丝状形式来指假性菌丝生长和侵袭性生长,尽管有这两种生长反应之间的差异。
丝状真菌至少需要两条信号转导途径增长。一种途径使用信息素中的许多成分反应途径,尤其是p21-活化激酶(PAK)激酶Ste20,前两层的激酶Ste11和Ste7丝裂原活化蛋白(MAP)激酶级联和转录因子Ste12(7,8),但具有独特的成分以及MAP激酶Kss1公司(9–11)和第二转录因子Tec1(12,13). 这个第二条途径包括最近发现的Gpr1,推测为G蛋白偶联受体(GPCR)类受体及其相关Gα亚单位,Gpa2(14,15). Gpr1被认为可以感知可发酵糖,与cAMP依赖性蛋白激酶A偶联(16). Ras2也通过此途径影响信号传导(17):损失RAS2系统防止入侵和过度活动RAS2V19型导致超细丝化。这些信号转导的靶点很少路径是已知的,但其中之一是浮动11基因,它是单倍体和二倍体丝状生长所需(14,18,19).与刚才列举的组件相比丝状生长,几种蛋白质似乎起着描述了丝状化负调节器。Hsl1损失或Hsl7导致超丝状化(20). 这些蛋白质与七肽环并抑制细胞周期调节器Swe1(21,22). 在此外,Hsl7可能与Ste20直接相互作用以防止丝状菌增长(23).
触发丝状生长的信号是不明确的。这里,我们通过使用标准平板清洗试验显示,葡萄糖的去除YPD培养基导致单倍体酵母的结构性侵入性生长。更准确地确定葡萄糖在侵袭性生长中的作用对此,我们开发了一种单细胞侵袭性生长试验。直接在有或无葡萄糖的情况下观察细胞,发现从营养生长到丝状生长的显著转变形态,在第一次细胞分裂时表现明显。我们使用这种分析表明侵袭性生长是由损失引起的指可发酵的糖,如葡萄糖。我们还发现一些超侵袭性生长突变体的丝状形态是完全被葡萄糖抑制。血糖控制研究入侵中的蛋白质揭示了全球调控的需求Snf1蛋白与转录因子的抑制功能侵袭中的Sip4。
材料和方法
菌株、质粒和微生物技术。
表中列出了酵母菌株.全部菌株与∑1278b背景的HYL333和334同基因(由怀特黑德生物医学研究所G.Fink提供,马萨诸塞州剑桥市)。通过消化一步替换质粒elm1|URA3,kss1|URA3,hsl1|URA3,hsl7|URA5,snf1|URA3,ste11|URA3,ste12|URA3,或ste20|URA3,或PCR-衍生的断裂碎片。这个ste12ŞURA3,ste11|URA3,ste20|URA3,kss1|URA3、和STE11型-4集成以前报告过构造(24)pRS315和316质粒(25). PCR Southern分析证实了基因断裂和表型。导致超侵袭性生长的质粒通过序列分析进行分析(26). 酵母和细菌菌株使用标准方法传播(27). 酵母提取物/蛋白胨/葡萄糖(YPD)和合成全葡萄糖(SCD)介质已描述(28)和是在同一时间制作的其他媒体的一致性。低氮合成低氨组氨酸葡萄糖(SLAHD)培养基的制备如下所述(2). 酵母按照描述进行了转换(29). 细菌转化、细菌DNA制备和质粒构建采用标准方法进行(30). HYL333和334是用于其他侵袭性生长研究的同源菌株(G.Fink,个人通信)。同类菌株也有相同的作为亲本菌株的特征(例如,Snf1依赖入侵,以及因葡萄糖消耗而侵入),但长度较短细胞形态。我们尚未探讨这一差异。可发酵的芽型和细胞伸长的糖依赖性变化在Sc252JHa、W303和246-1-1菌株背景中观察到(未显示)。
表1
应变 | 相关基因型 | 参考 |
---|
HYL333型 | 材料一乌拉3-52 | G.芬克 |
HYL334型 | 材料αura3-52 | G.公司。芬克 |
1 | 乙基333吕2 | A.戈林 |
2 | HYL333/HYL330型 | 本研究 |
三 | HYL333型钢12 | 本研究 |
4 | HYL333型钢20 | 这个学习 |
5 | HYL333型钢4 | 本研究 |
6 | HYL333型钢5 | 本研究 |
7 | HYL333型STE11-4标准 | 本研究 |
8 | HYL333型RAS2V19型 | 本研究 |
9 | HYL333型hsl1型 | 本研究 |
10 | HYL333型hsl7型 | 这个学习 |
11 | HYL333型grr1 | 本研究 |
12 | HYL333型snf1 | 本研究 |
13 | HYL333型snf1hsl7型 | 本研究 |
14 | HYL333型snf1 hsl1 | 这个学习 |
15 | HYL333/334型snf1/snf1 | 本研究 |
16 | 乙基333第1批STE11-4 | 本研究 |
17 | HYL333型snf1 pbs2 | 本研究 |
18 | HYL333型snf1grr1级 | 本研究 |
19 | HYL333型snf1型sip4 | 这个学习 |
20 | HYL333型信噪比4 | 本研究 |
21 | HYL333型米格1 | 本研究 |
22 | HYL333型hap4型 | 这个学习 |
23 | HYL333型sip1型 | 本研究 |
24 | HYL333型sip4型 | 本研究 |
25 | HYL333型硫酸钾2 | 这个学习 |
单细胞侵袭性生长试验。
使用缺乏葡萄糖的合成完整培养基(SC培养基)检查生长习性。细胞能够分裂20多个细胞在这种介质上,可能是因为碳源贫乏污染琼脂。细胞在SCD中生长到固定相液体培养基,用水冲洗两次,然后涂在新浇好的液体上浓度为10的SCD或SC培养基4细胞/平板。平板在25°C下培养24小时酵母型(yf)和丝状菌型(ff)微菌落的出现通过显微镜检查进行评估。指定了一个微菌落yf如果微菌落的每个细胞都是圆形的,如果没有单极芽如果超过50%的细胞被拉长并且如果50%以上的细胞以单极方式发芽。不属于上述任何一类的微群落是罕见(低于10%),不被视为总数的一部分百分比。出现单极芽和通过检查至少200个细胞来确定细长的形态来自20细胞(或更少)阶段的微克隆。质粒通过选择合适的营养缺陷型,维持在SC培养基上标记,对花丝形成没有影响。
平板洗涤测定。
按说明进行平板清洗试验(8). 我们很小心不要打破琼脂的平面。入侵被允许进行在30°C下放置3天,用水清洗并摩擦盘子用湿手指用力去除未侵入细胞琼脂。通过平板清洗监测SC培养基的侵入将S板在25°C下培养24小时,并如上所述清洗,并用显微镜检查。
显微镜。
使用标准微生物技术(31). 对于需要通过×40或×100目标进行观察的实验,用4毫升蒸馏水刮除细胞,蒸馏水由离心,再悬浮在20μl水中,通过显微镜检查。为了进行芽痕染色,如上所述收集细胞,在1μg/ml Calcoflour(Sigma)中再次悬浮10分钟,清洗两次在水中,用荧光显微镜观察。
结果
葡萄糖消耗导致组织侵袭。
先前的报道表明,营养限制会导致单倍体酵母的侵袭性生长(8),所以我们调查了各种营养素发现从YPD培养基(YP培养基)中去除葡萄糖导致通过平皿洗涤试验(图。). 在YP上生长的前16小时,相比之下YPD公司。显微镜检查显示YP上有丝状结构在第一个单元格分区内(未显示)。添加葡萄糖或防止其他可发酵糖(果糖或甘露糖)进入YP培养基超侵袭性生长(未显示)。从中移除其他组件富培养基,如酵母提取物(PD)或蛋白胨(YD)不会导致酵母在葡萄糖存在下的超侵袭性生长(未显示)。
去除葡萄糖会导致结构性侵袭。等浓度在YPD(加葡萄糖)或YP培养基(减葡萄糖),孵育16小时和48小时,并拍照。YP上的细胞生长可能是使用低碳源进行的存在于酵母提取物或琼脂中。
单细胞侵袭性生长试验。
我们在缺乏葡萄糖的合成培养基(SC)上观察到微克隆介质,图。一). 这些微克隆由单极的细长细胞组成洗盘法显示出芽模式并侵入琼脂将琼脂平分,然后进行显微镜检查(图。B类). 检测到琼脂侵入含有10个细胞的微克隆。ff形态为与之前报告的相同(8)以及侵入YPD培养基的细胞(未显示)。相反,微克隆在含有yf细胞的葡萄糖(SCD)合成培养基上,圆形轴向萌芽的细胞,没有一个侵入琼脂(图。A插图). 葡萄糖位于中心在SC板上观察相同细胞类型平板:扩散葡萄糖区域的yf微克隆和ff扩散葡萄糖区域外的微克隆。独特的过渡标记了yf和ff微克隆之间的边界;一很少观察到同时显示这两个特征的单个微菌落。
单细胞侵袭性生长试验。(一)的单元格将∑1278b背景扩散到SC培养基上并孵育24h,在×200的条件下,通过光学显微镜观察微菌落。(插入)形成于在相同放大倍数下出现葡萄糖。(B类)琼脂侵入缺乏葡萄糖的培养基。野生型细胞扩散到SC上培养基,在25°C下培养24小时。盘子是用剃须刀刀片,截面垂直于通过光学显微镜直接观察入侵情况。(C类)侵入性生长突变体在培养基上具有表型缺乏葡萄糖。将等浓度的细胞分散到培养基上缺乏葡萄糖。突变基因型如下:上部左侧,野生型;右上,钢20;左下方,钢12;和右下角,hsl7型.一,B类、和C类比例相同比例尺输入一代表40μm。
已知侵袭性疾病所需功能缺陷的突变体通过单细胞分析检查生长情况以确认其合法性检测结果。两者都有钢20和钢12突变体细长细胞形成和单极出芽有缺陷(图。C类). 单极芽接缺陷更严重对于钢20变种比钢12突变体单细胞分析(图。C类),与结果一致通过平板清洗试验获得(未显示和7、8)。损失STE公司基因,例如蒸汽发生器4和STE5型,入侵不需要,也不会影响单细胞分析观察到的形态转变(未显示)。我们检查了超侵袭性生长突变体,发现高铁7号线产生包含超细长的微菌落通过单细胞分析(图。C) ●●●●。因此,减少的突变而促进侵袭性生长的突变对单细胞分析显示的细胞表型。
我们研究了不同刺激对yf和ff生长的影响。发现较低浓度的葡萄糖会导致成比例的yf微克隆的较小晕,显示出直接关系葡萄糖浓度和酵母形态生长之间的关系(表). 可发酵糖(蔗糖、甘露糖、,和果糖)导致了yf的增长,尽管yf救援的光环是小于葡萄糖。非发酵碳源(例如糖原和甘油)不能促进yf生长(表). 缺乏固定氮、氨基酸或核苷酸的培养基没有导致ff生长,添加SDS或盐不会诱导ff生长在存在葡萄糖的情况下(表). 最后,找出其中一种酵母提取物或蛋白胨不能阻止ff形态,而YPD培养基使yf生长恢复到与单独葡萄糖相同的程度(表).
表2
刺激措施补充* | %伊夫† | %ff(关闭)‡ | yf半径§ |
---|
谷氨酸(1 M) | >95 | <5 | 20 |
谷氨酸(0.25M) | >95 | <5 | 15 |
葡萄糖(0.06 M) | >95 | <5 | 4 |
蔗糖(1M) | >95 | <5 | 12 |
甘露糖(1M) | >95 | <5 | 11 |
糖原(100%) | <5 | >95 | 0 |
甘油(100%) | <5 | >95 | 0 |
谷氨酸(1M)+0.1%SDS公司 | >95 | <5 | 20 |
谷氨酸(1 M)+1 M氯化钠¶ | >95 | <5 | 20 |
YPD公司 | >95 | <5 | 20 |
YP公司 | <5 | >95 | 0 |
蛋白胨(10%) | <5 | >95 | 0 |
酵母提取物(10%) | <5 | >95 | 0 |
刺激远离的‖ |
氮气 | 90 | 10 | 不适用 |
氨基酸 | >95 | <5 | 不适用 |
乌拉西尔 | >95 | <5 | 不适用 |
葡萄糖抑制超侵袭性生长突变表型。
我们通过单细胞法测定葡萄糖对细胞形态的影响这些突变体。我们发现形态完全被抑制的表型hsl1型和hsl7型葡萄糖(图。). 这种抑制与细长细胞形态观察hsl1型和hsl7型突变体仅在固定相观察到,但不在指数增长期间(21). Ras通路过度激活通过集成RAS2V19型等位基因(32)或删除BCY1型(33)导致细胞形态异常,包括超长细胞,一种被葡萄糖(图。). 的ff形态STE11型-4和硫酸钾2突变体(24,34)曾经也被葡萄糖抑制(图。). 相反,elm1级和grr1突变体(35,36)形态不规则存在或不存在超细长细胞和弯曲细胞葡萄糖(图。). 因此,可以区分构成性(grr1级和elm1级)和超侵袭性(hsl1,hsl7、bcy1、RAS2V19、sok2和STE11型-4)基于葡萄糖行为的突变体。为了支持这一区别,在第一个细胞内观察到构成突变体的侵袭YPD上的分区(未显示)。
葡萄糖抑制超侵袭性生长突变表型。相等细胞在SCD或SC培养基上培养16小时。一将5μl的1 M葡萄糖点置于SC中心的过滤器上以允许观察yf和ff细胞类型。这个RAS2V19型在YP和YPD培养基上比较等位基因是因为富培养基上侵袭性生长表型更明显。全部图片比例相同,条在左下角角代表40μm。
葡萄糖饥饿时细胞伸长和单极性萌芽。
我们使用单细胞分析检测第一次细胞分裂或不含葡萄糖。将单个细胞置于SC或SCD培养基上(通过微操作)并检查yf或ff在随后的细胞分裂。SC培养基上产生的第一个芽为1.5是SCD介质的倍长(且更薄)(图。). 事实上,超过90%的人SC培养基上产生的子体被拉长。伸长细胞在SCD培养基上很少观察到(<1%)。细胞的萌芽模式通过直接可视化的方法比较添加或不添加葡萄糖的生长情况微菌落和芽痕染色计数。祖先细胞有时在SC培养基上失去轴向芽接模式(图。);25%的新芽形成于对极或某一地点从第一个芽中随机选择(表). 更引人注目的是子细胞在SC培养基上是单极的(大于85%的芽计数;表). 女儿的第二和第三芽是在95%以上的时间内与第一远端芽相邻。两者都有祖细胞及其子细胞在SCD上的轴向模式(≈98%)。将葡萄糖点在盘子上含有ff微克隆导致新的子代呈现球形第一次细胞分裂的形态和轴向出芽模式(未显示)。
含或不含葡萄糖的细胞有显著差异第一次细胞分裂中的形态。细胞在SCD或SC上生长培养基,刮下平板,离心,拍照。典型显示了微克隆的示例。所有照片都是一样的标尺,标尺位于左下方角代表10μm。
表3
单元格 | 巴德 | 预算模式,%*
|
---|
轴向 | 随机 | 对面 |
---|
米† | 2档、3档或第四 | 75 | 5 | 20 |
第1页 | 第一 | 15 | 0 | 85 |
第1页 | 第二 | 98 | 0 | 2 |
D2类 | 第一 | 13 | 0 | 87 |
D2类 | 第二 | 98 | 0 | 2 |
葡萄糖控制蛋白对正确的侵袭很重要。
为了确定入侵的遗传要求对葡萄糖缺乏的反应,我们破坏了已知参与的基因在血糖控制中。Snf1蛋白是脱除葡萄糖抑制基因和葡萄糖引起的细胞整体变化饥饿(参见参考。37). 我们发现了snf1突变体有一个与侵袭性生长缺陷相当的严重侵袭性生长缺损属于蒸汽发生器20(图。一).在平板清洗和单细胞分析中,snf1突变体不会侵入琼脂,形成细长的细胞,也不会在单极模式。我们还发现Grr1的损失(35),一个函数Snf1拮抗剂,完全抑制snf1型突变体(图。B类). 部分抑制这个snf1侵袭性生长缺陷和yf形态通过破坏观察到高铁7号线(图。B类),或由介绍多动症STE11型-4等位基因(未显示)。这个第1批STE11-4应变增加更多慢于含有任一单一突变的菌株(未显示)。
正常侵入需要Snf1和Sip4。(一)在YPD培养基上发现等浓度的细胞并生长在30°C下持续3天。这些盘子被拍照、清洗和再次拍照。(B类)细胞浓度相等置于SC培养基上,在25°C下培养16小时拍照。对于B类,所有照片都是在同一时间拍摄的标尺,标尺位于左上角代表40μm。
已知Snf1与Snf4交互以控制Snf1的子集功能(38)但我们发现SNF4系列有一个侵入中较轻的缺陷(图。一). 这个snf4型突变体表现出单个细胞生长ff的缺陷分析(图。B类),表明Snf4是Snf1侵袭性生长函数的子集。Snf1还与和关联激活Sip4(39),激活从发酵到呼吸的双向转换诱导的基因(40). 我们发现SIP4系列具有超侵袭性生长传统和单细胞分析的表型(图。
一和B类). 中断SIP4系列在一个snf1突变体部分恢复入侵;然而sip4 snf1细胞的侵袭程度与野生型或sip4型细胞。损失HAP4型,MIG1公司,或SIP1公司对侵入性生长没有影响平板清洗或单细胞分析(未显示),表明葡萄糖控制蛋白的一个特定子集是必需的入侵。
讨论
葡萄糖消耗是单倍体侵袭性生长的触发因素。
我们已经获得证据表明,葡萄糖(或其他可发酵糖)引起单倍体侵入性生长。我们最初通过平板清洗试验观察到野生型细胞对缺乏葡萄糖的富培养基的结构性侵入。后续实验证明,在缺乏葡萄糖的合成培养基上,细胞采用细长形态,单极出芽模式侵入被葡萄糖完全抑制的agar表型。引人注目的是,大多数超侵袭性生长的细长细胞形态突变体也被葡萄糖抑制。与角色保持一致葡萄糖在控制侵袭中,我们发现葡萄糖控制蛋白质Snf1和Sip4对侵袭性生长(见下文)。相反,缺乏固定的氮、氨基酸或核苷酸不会引起入侵。拉斯维加斯成丝需要路径(2)可能与葡萄糖连接通过检测细胞中cAMP的水平来消耗,这会受到影响通过葡萄糖浓度(41). 事实上浮动11基因,其中是入侵所必需的,并且是两个目标的已知目标RAS系统和STE20标准-依赖性信号转导路径(19),在富含葡萄糖的环境中转录受到抑制环境(42).
为什么侵入富介质比侵入合成介质更好?我们展示了这种侵入不是在富介质上构成的,而是开始的当葡萄糖水平限制植物生长时。入侵可能在富含营养物质的培养基上更健壮,因为其他营养物质(例如,较差碳源、核苷酸和氨基酸)刺激以丝状形式存在的细胞。事实上,添加酵母提取(富培养基的一种成分)到刺激的SC培养基丝状(未发表的结果)。我们的观察表明密度不是向ff增长过渡的因素排泄因子导致侵袭,因为单个细胞可以采用ff增长。
单细胞侵袭性生长试验。
以前对酵母单倍体侵袭性生长的研究依赖于仅在平板清洗试验中进行(8)确定入侵。我们开发了一种单细胞侵入性生长测定法具有与板洗法,可直接检查灯丝单倍体形成。本试验在研究酵母中的丝状物值得注意。首先,检测是渗透剂在野生型细胞中:超过95%的微克隆显示ff在没有葡萄糖的情况下的生长,以及芽的形态变化几乎在每个细胞中都可以看到图案和细胞伸长。这个渗透表型与二倍体假菌丝生长形成对比,其中仅观察到野生型细胞的子集(5–25%)存在于含氮环境中ff的增长(见17、43)。其次该分析可对单极芽接和细胞进行定量分析单倍体酵母向丝状体转化过程中的伸长增长。事实上,可以追踪萌芽事件的确切谱系通过对单个细胞的时间进程检查。最后,能力研究单倍体中的成丝将有助于遗传分析。
葡萄糖消耗后的形态转变很快。第一,在第一阶段,从轴向萌芽转变为非轴向萌芽缺乏葡萄糖的细胞。这种与轴向萌芽的偏差可以是用饥饿时失去瞬态轴向标记来解释(44). 的确,我们观察到在缺乏培养基的情况下,第一芽的形成延迟葡萄糖(未显示)。第二,子细胞采用一种专用的葡萄糖缺乏的单极萌芽模式。这种模式不是人们会从轴向信号的丢失中期待什么(J.普林格尔,并建议单倍体酵母具有将葡萄糖水平与发芽机制联系起来的机制涉及Ste20(在较小程度上涉及Ste12)。最后细胞长度在葡萄糖缺乏的环境,在随后的所有环境中都很明显女儿。以前的报告表明2延迟会导致细胞伸长,而这发生在ff细胞中(45).这可能是这里解释的一部分,但我们也提供了证据使Ste20和Ste12参与长形细胞的形成。
葡萄糖控制蛋白在侵袭中的作用。
我们发现Snf1,一种蛋白激酶,其活性在葡萄糖限制环境是侵袭性生长所必需的。这个结合并调节Snf1的Snf4蛋白仅部分必修的:snf4型经评估突变体具有侵袭性生长通过平板清洗试验,但仅显示有限的反应单细胞分析。虽然Snf1和Snf4具有相似的表型和共享重叠的功能,有证据表明存在不同的功能还有(46). 葡萄糖控制蛋白Grr1的丢失(35),谁的已知突变表型可抑制某些Snf1功能(47),完全抑制了snf1突变体。Snf1的一个目标是Sip4(39),一种转录因子在双人轮班时需要(40). Sip4不需要用于丝状作用;相反,sip4型突变体表现出超侵袭性生长表型。Snf1的第二个目标,可能更相关与Snf1在丝状生长中的作用相比,Msn1本身是必需的丝状生长(48). 为了支持这种可能性,我们发现Msn1的过度表达可以部分抑制snf1侵袭性生长缺陷(未发表数据)。
Snf1可能在形态转变到ff生长中起作用它在检测葡萄糖消耗方面的作用。Snf1是必需的二倍体中的假菌丝生长(未显示)。这些细胞形成细丝为了应对氮限制认为会影响Snf1活动。具有超侵袭性的突变增长,例如STE11型-4,pbs2,和hsl7型部分绕过a的侵袭性生长缺陷snf1突变。因为这些突变对影响葡萄糖传感或代谢,我们推断snf1侵袭性生长缺陷在一定程度上与该作用无关Snf1在葡萄糖传感中的作用。为了进一步支持这一观点,第1批STE11-4突变体的生长速度比任何一种都慢单个突变体,意味着STE公司侵袭性生长途径和Snf1功能。因此,Snf1可能通过多种机制影响侵袭性生长。至少一个真菌病原体的毒力需要Snf1(49),进一步证实葡萄糖控制蛋白在真菌形态发生。