可视化单个流感病毒的感染

摘要

流感的感染途径是一个复杂的多步骤过程：病毒通过受体介导的内吞进入细胞，然后从内吞转移小泡到早期内体，最后到晚期内体，其中病毒与内膜融合释放病毒基因(1–7),许多其他重要医学病毒所遵循的途径(三,4). 利用细胞构成感染的内吞机制，流感是一种理想的探针用于探索细胞的内吞途径。然而，尽管付出了巨大努力在调查流感感染时病毒的内吞作用和内吞传播仍然难以捉摸。其中包括细胞内吞作用的重要和一般问题：细胞不同阶段内吞小室的转运机制内吞途径，以及这些隔室和封闭的内吞是如何进行的货物成熟(6–8)?实时成像内吞途径的困难表现为解决上述问题的主要障碍。在这项工作中，通过跟踪单个流感病毒的实时行为(9–12),我们已经解剖了病毒进入过程的各个阶段，观察到内吞病毒运输中短暂的、以前未观察到的步骤，以及获得了细胞内吞途径的动态图片流感。我们发现携带病毒的内体在体内运输细胞分为三个不同的阶段，每个阶段都有不同的细胞骨架马达-蛋白质依赖机制。我们发现了令人惊讶的内吞作用酸化动力学：主要是内吞物的初始酸化发生在核周区域，这就对之前的图片提出了质疑细胞外围的早期内体是早期酸化位点用于内吞货物(13,14).

材料和方法

病毒和荧光标记。购买流感病毒X-31查尔斯·里弗实验室。用亲脂性染料标记病毒与1,1′-二十八烷基-3,3,3′，3′-四甲基吲哚二碳菁（DiD）（分子探针）在22°C下放置2小时。用胺反应Cy3标记和CypHer5（Amersham Pharmacia），病毒在在22°C的碳酸盐缓冲液（pH 9.3）中放置1小时。在这两种情况下，未结合染料通过缓冲液交换将其移入50 mM Hepes缓冲液（pH 7.4，145 mM NaCl）中使用凝胶过滤柱。实验前，病毒聚集用0.2μm孔径的过滤器去除。

细胞培养和药物治疗。中国仓鼠卵巢（CHO）细胞（美国型培养物收集）保存在5%的CO中₂Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，Invitrogen）中10%的环境每2-3天进行一次FBS和传票。经过6到7次传代后，细胞丢弃，解冻新的冰冻细胞。对于荧光成像，CHO细胞在含有10%FBS的DMEM培养皿中培养多边形(我-赖氨酸）涂层玻璃盖滑到底部。之前荧光实验中，细胞在无血清、无酚红中清洗使用100 mM Hepes缓冲液（pH 8.0）强化培养基。为了破坏微管，细胞与含有60μM诺卡唑的培养基孵育30分钟在实验之前。为了破坏肌动蛋白丝，将细胞与含有20μM细胞松弛素D（cyto-D）的培养基实验。这些药物一直保存在细胞培养基中实验。为了抑制动力蛋白活性，细胞被微量注射抗达因中间链单克隆抗体（Chemicon），在首席执行官₂实验前培养15分钟。HeLa细胞（美国型培养物收集）保存在最低基本培养基中含10%FBS的（Invitrogen）。

荧光和差分干涉对比度（DIC）成像。DiD标记的病毒被633纳米氦氖激发激光（Melles-Greot），而Cy3/Cypher5标记的病毒同时出现用532-nm二极管泵浦Nd:YAG激光器（CrystaLaser，雷诺，内华达州）和氦氖激光器。一种定制的多色分束器（弗吉尼亚州布拉特波罗市Chroma Technology），在波长处反射520–550 nm和615–655 nm，并传输其余可见光光谱用于将激光线反射到样品上，而发射荧光。收集荧光发射通过数值孔径为1.45的油浸物镜（奥林巴斯）和在电荷耦合器件（CCD）相机上成像（Roper Scientific，CoolSnap总部）。对Cy3和CypHer5的荧光发射进行光谱分离通过650 nm长程二向色反射镜（Chroma Technologies）成像到两个CCD摄像头的单独区域。585/70-nm带通滤波器用于Cy3荧光发射，CypHer5使用650长通滤波器排放。以每秒两帧的速度记录图像序列。DIC光学（Olympus）用于获得荧光前后的细胞图像成像。实验在37°C下进行。

图像分析。电影堆栈中的每个帧都由处理与高斯空间滤波器卷积以去除背景和噪声(15). 病毒峰值为通过递归积分连接到每个亮区的亮区来检测局部最大值。每个病毒的位置计算为明亮区域。当病毒处于焦点位置，当病毒出现时，误差可达150nm有点不对焦。通过配对重建病毒轨迹根据在强度上的接近性和相似性。用于完整的定量分析轨迹，只有那些开始于细胞外围区域的病毒分析了焦平面内的表面和粗略运动。病毒结合核周区正上方倾向于与病灶垂直移动平面。它们的输运性质无法定量分析。

结果和讨论

个体流感病毒感染的可视化。首先，我们通过追踪单个病毒研究流感的传播和融合用荧光显微镜观察活细胞。我们使用了标签方案可以检测单个病毒及其膜融合物理轨迹。CHO细胞和X-31流感被用作模型细胞和病毒系统。流感病毒被标记为DiD，一种荧光亲脂性染料，能自发分裂成病毒膜。染料标记的病毒具有传染性，而染料标记的不具有传染性影响病毒的传染性（参见支持文本，已发布作为PNAS网站上的支持信息，网址：www.pnas.org).DiD染料的表面密度足够高，因此荧光基本上被熄灭，但仍允许单个染料标记的病毒以被清楚地检测到。荧光强度的显著增加是预计病毒与内体融合。这是一种常用的方法信号病毒、囊泡和细胞融合(16). 我们测量了在里面体外标记病毒与红细胞的融合动力学融合pH值（pH5），并获得融合速率常数≈0.1秒^–1(支持文本图6，已发布作为PNAS网站上的支持信息）。该结果与先前确定的流感病毒或表达流感病毒的细胞的融合动力学有无亲脂性的流感融合蛋白染料(17–19),表明病毒融合动力学不受亲脂性的干扰染料。

为了说明荧光信号在在感染的不同阶段，我们使用了低温预培养方法允许多种病毒同步感染(1). 病毒被孵化细胞在4°C下放置10分钟，与细胞结合而不发生内吞。这个然后迅速将温度升高到37°C，开始感染。病毒启动后2分钟和15分钟的荧光图像感染显示在图。1一这些图像清楚地说明了重要的病毒向核周区转运。病毒与内体融合通过荧光去淬证明。大约四分之一的病毒在20分钟后融合，这与观察到的三分之二的病毒具有本质上的融合破坏性(支持文本)和，in此外，细胞中15%的病毒没有到达核周区域在以下实时病毒跟踪实验中，病毒通过低温预培养方法添加到细胞中或就地37°C时。这两种方法在病毒转运特性以及融合和酸化动力学。

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图1。

CHO中单个流感病毒的荧光图像和融合位点细胞。(一)CHO细胞的DIC图像(左侧)和荧光DiD标记病毒2分钟图像(居中)和15分钟(赖特)感染后。细细的白线追踪着核边界。(b条)单个病毒的融合位点标记为红星。细胞和细胞核的边界被厚厚的灰色和白色细线。单元格之间的边界为在驾驶员信息中心（DIC）图像中可以识别出清晰的轮廓。原子核是可见为高对比度包围的细胞中心附近的卵圆形区域囊泡结构。看起来似乎在原子核内的恒星最有可能表明核上方或下方的融合事件。

病毒在细胞内的三阶段主动运输。跟踪实时的单个病毒使我们能够毫不含糊地揭示其动态病毒在细胞中的转运。图。2一显示了病毒从细胞外围，向核周区移动并与晚期融合内体。有一部电影展示了这种病毒的传播和融合在电影1中，作为支持信息发布在PNAS网站上。病毒速度和荧光强度的时间轨迹如所示图2b条.这些结果说明了以前未知的三阶段运输模式这在病毒中是高度可复制的：病毒首先在细胞外围（阶段I），然后采用快速单向运动朝向细胞核（第二阶段），然后是间歇性的，通常是双向的核周区运动（III期），最后与荧光显著增强所示的内体(图2b条). 我们确定阶梯状持续单病毒轨迹中的融合事件荧光增加至少是3倍，通常大于因子为5，高于预融合强度。这种三级运输行为对流感感染至关重要。我们的控制实验HeLa细胞，一种已知的低效流感感染细胞(20,21)，显示出更少的病毒融合。对HeLa细胞中单个病毒轨迹的分析表明大多数病毒主要局限于细胞外周，没有II期和III运输(支持文本和图7，发布为PNAS网站上的支持信息）。

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图2。

追踪单个流感病毒的传播和融合。(一)DiD标记病毒在细胞内的轨迹。的颜色轨迹用彩色条表示统一的时间轴来编码时间从0秒（黑色）到500秒（黄色）。红星表示聚变地点。（比例尺：10μm）(b条)速度的时间轨迹（黑色）和病毒的DiD荧光强度（蓝色）。t吨₁,t吨₂、和t_三是阶段I、II和III的持续时间，分别是。每种病毒的第二阶段运动都可以被一致识别细胞外周快速单向移位的轨迹到核周区域。第一阶段定义为在此之前的时期瞬态运动，第三阶段被定义为第二阶段之后的阶段，但融合前。(c（c）)第一阶段病毒传播速度直方图。(插入)显示的是测得的平均均方位移（Δr²〉）vs.病毒的时间（Δt）（绿色符号）。绿线适合Δr²〉 =常数+DΔt+（vΔt）²D=0.001微米²/s和v=0.02μm/s。小常数项是由于噪音。第一阶段约60%的病毒轨迹表现出超线性Δr的相关性²〉Δt。因为运动的类扩散分量（DΔt），即瞬时速度直方图中（=Δr/Δt）取决于Δt，选择Δt是为了0.5 s英寸c（c）–e（电子）. (d日)病毒直方图第二阶段的速度。(e（电子）)阶段病毒传播速度直方图三、(插入)所示为的典型示例〈Δr²〉与Δt。代表第三阶段相对较快的运动，Δr²〉vs.Δt图仅使用病毒所在的点进行计算以>0.3μm/s的速度行驶。绿线是第一条线的拟合Δr的八个数据点²〉=常数+D′Δt+（v′Δt）²D′=0.5微米²/s和v′=0.4μm/s。小常数项到期噪音。

第一阶段肌动蛋白依赖性转运。单病毒分析这三个阶段的轨迹提供了对病毒转运机制。首先，我们描述第一阶段的特征三个平均持续时间为6分钟（图8一，这是作为支持信息发布在PNAS网站上）。这个阶段代表发生在细胞外围的病毒的运动距离初始结合部位2μm以内。图2c（c）显示了瞬时病毒速度的分布和平均值的相关性病毒传播的平方距离（Δr²〉）上的该阶段的行进时间（Δt）。尽管自由扩散会导致Δr的严格线性相关²〉开Δt，我们的实验数据清楚地显示了与支配二次项表明病毒运动是定向的。收件人测试与这种定向运动相关的机制，我们测量了诺康唑（一种能破坏细胞生长的药物）治疗后细胞内的病毒轨迹微管或细胞-D，一种破坏肌动蛋白丝的药物。这个诺卡唑处理的细胞中观察到的运动与未经处理的细胞中的第一阶段运动(图。三一). 相反，细胞-D处理细胞中的病毒表现出更有限的流动性(图。三一). 这些结果表明，第一阶段的运动是依赖肌动蛋白的主动转运。中病毒轨迹的比较未经处理的细胞和肌动蛋白分裂细胞中的细胞表明，肌动蛋白病毒结合后几秒钟内，依赖性运动迅速开始到牢房(图3b条).这种运动可能代表了含病毒内吞的运输细胞内的小泡，由肌动蛋白丝上的肌球蛋白马达控制(7)或由肌动蛋白推动与李斯特菌基于肌动蛋白的运动方式类似的纤丝(7,22,23). 然而，我们不能排除阶段I涉及动作相关运动的可能性电池表面(24,25).

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图3。

药物和抗体对病毒转运特性的影响。(一)在未治疗的，细胞-D处理的细胞和诺卡唑处理的细胞。箭头在上部赖特表示最小半径(第页_跳跃)的以轨迹原点为中心的圆，可以覆盖整个轨迹在给定时间的轨迹。(b条)平均值第页_跳跃在许多轨道上作为时间的函数。这个第页_跳跃在未经处理和诺卡唑处理的细胞中快速检测超过r_跳跃在细胞-D处理的细胞中获得。快速，首次增加第页_跳跃在细胞-D处理曲线中可能是由于病毒传播受限或而固定在玻璃上的病毒则不会发生。(c（c）)病毒未经处理细胞、诺卡唑处理细胞、，细胞注射抗动力蛋白（1mg/ml）。时间色标类似至中所述图2.（比例尺：10μm）

第二阶段中Dynein在微管上的定向转运。接下来，我们描述第二阶段的特征，一个短暂的运动爆发用高速单病毒成像直接观察。病毒在体内的传播第二阶段的特征是细胞快速单向运动以瞬时速度1–4μm/s(图2a、 b条,和d日). 该值与逆行肌动蛋白（一种负向终末运动蛋白）在微管上行走(26). 第二阶段运动通常只持续几秒钟（图8b条). 它不存在诺康唑治疗细胞中病毒的轨迹(图3c（c）)，表示这种快速运动确实依赖于微管。这个阶段也是通过微量注射1 mg/ml的抗干扰素抗体到单元格(图3c（c）). 这个在较低浓度的抗痛感素下，抑制效果较差（数据不是如图所示）。这些结果表明，在第二阶段，病毒被转运通过微管上的动力蛋白运动蛋白。因为这种运动发生在病毒融合，它代表了携带病毒的内吞运动隔室（内体或内吞载体囊泡；参考文献。13和27).

中微管的竞争性正负端运动第三阶段。在这种快速的第二阶段运动之后，病毒经历了速度急剧下降，核周区进入第三阶段(图2a、 b条、和e（电子）). 在这个阶段，可以观察到病毒在移动断断续续地，经常沿着同一路径来回移动，清楚地表明运动是有方向的。Δr²〉与。Δt图(图。2e（电子）)显示了低Δt下的超线性相关性与定向运动和振荡行为一致的范围高Δt范围与前后运动一致。这些结果强烈提示在这个阶段含有病毒的内吞室由负端导向电机和正端导向电机运输在微管上。运动的间歇性和相对较慢的速度很可能是由这些发动机之间的竞争引起的(11). 的确，我们可以通过向病毒完成第二阶段运动后的细胞(支持文本图9，作为支持信息发布在PNAS网站上现场）。从单向（第二阶段）到双向（第三阶段）的变化这里观察到的运动表明内吞途径，内吞区室从具有主要是膜结合的动力蛋白活性plus-end-directed motor activities，与之前的研究结果一致动力蛋白和驱动蛋白在不同细胞膜上的分布不同隔间(28).

病毒融合。膜染料对病毒的特异性标记使我们不仅可以检测物理轨迹，还可以检测融合荧光显示的带有内体的单个病毒事件去淬火(图2b条).融合位点主要在核周区域(图1b条)，一致与主要位于原子核(8,14). 平均融合时间从我们的单病毒轨迹得到的结果是在结合后8分钟，非常与之前测量的集合时间（8分钟）吻合良好内吞病毒进入CHO细胞的晚期内体(29). 这个数量一致性表明染料标记不会显著干扰病毒进入动力学。晚期内体pH值（pH5）对流感融合至关重要(14,29). 事实上，病毒融合在存在亲油性弱碱氯化铵时未观察到已知可提高内体pH值(1)在诺卡唑存在下也未观察到这种情况（数据未显示）。

有人认为，在进入晚期内体的内吞途径中内吞货物至少经历两个酸化步骤，其中一个来自细胞外pH值至早期内体pH值（pH≈6），随后变为晚期内体pH值（pH≈5）(14,29–32).因为流感融合和融合需要后期内体pH值pH值为5时，动力学非常迅速(支持文本和图6），病毒融合是第二酸化步骤的理想指标。我们的结果表明融合和第二酸化步骤平均发生2核周区快速运动后min。

细胞内途径的初始酸化发生在II期之后核周边地区的运输。我们直接探索了早期通过追踪标记的单个病毒来酸化内吞途径使用对pH敏感的染料。这种方法允许我们同时关联单个病毒的pH值、细胞位置和运动信息。这个用对pH敏感的CypHer5染料和对pH不敏感的Cy3共同标记病毒染料。这种染料标记程序也不会影响病毒的传染性(支持文本). 两者的荧光发射比率染料是pH在6和8之间的pH指示剂。图4一和b条显示细胞内典型的病毒轨迹病毒速度和pH值的相应时间轨迹。电影2，显示该病毒的转运和酸化被发表为PNAS网站上的支持信息。令人惊讶的是，首字母病毒酸化至pH 6发生在核周区第二阶段快速移动。统计学(图。4c（c）)表明大多数病毒都经历过它们快速进入核周后的初始酸化步骤区域。此外，初始酸化时间与快速运动的开始时间(支持文本和图10，作为支持信息发布在PNAS网站上）。这个快速移动和初始酸化之间的平均时间为平均只有0.5分钟，清楚地表明这是一个不同于导致融合的酸化(图。4c（c）).

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图4。

跟踪单个流感病毒的传播和酸化。(一)细胞内Cy3/CypHer5标记病毒的轨迹。这个彩色条表示从0到450秒的统一时间轴。绿色星表示初始酸化位置。（比例尺：10μm）(b条)速度的时间轨迹（黑色）以及CypHer5和Cy3的比率病毒的荧光发射（红色）。t吨₄定义时间在第二阶段结束和初始酸化事件之间经过。这个根据校准的pH依赖性标记pH值CypHer 5和Cy3之间的强度比（未显示数据）。(c（c）)t的直方图_三和t₄如图。​图2b条2b条和4b条,分别是。

上述结果描绘了一幅引人注目的画面：大多数内吞携带病毒的隔间在核周区。这一结果使之前建议的分布在外围区域的早期内体细胞成熟至pH≈6时，是内吞货物(13,14,29–32).相反，我们的结果表明，含有病毒的内吞室在这些内体酸化之前留下早期内体病毒载体本身的酸化主要发生在核周微管快速运动后的区域。值得注意的是，在处理过的细胞中诺卡唑抑制了病毒的快速移动细胞外围酸化至pH 6，但酸化速度较慢比未经处理的细胞(支持文本). 因此，令人惊讶的是核周区域的后期初始酸化步骤表明初始酸化与快速酸化的关系正常细胞中微管依赖性运动，而不是初始酸化的微管依赖运动。

结论

总之，我们使用实时荧光显微镜跟踪单个流感病毒在活细胞中的感染途径和动力学。由用荧光指示剂监测病毒的酸化和融合粒子，我们已经研究了病毒感染途径和单病毒的内吞转运特性级别。我们的单病毒轨迹清楚地剖析了病毒的内吞并明确证明病毒转运由病毒-基因组融合前的三个不同阶段，第一阶段是细胞外周的肌动蛋白依赖性主动转运，第二阶段为快速以及微管上的动力蛋白向核周区的定向运动，第三阶段是一种间歇性主动运输，包括正和溃疡周围区微管上的负向终末运动蛋白。单个病毒轨迹揭示了快速II期转运后的含病毒内吞室：变化膜结合马达蛋白的分布或活性，初始酸化至pH 6，随后酸化至流感融合pH（pH5). 令我们惊讶的是，最初的酸化步骤发生在核周微管快速运动后的区域早期内体是早期酸化位点的先前建议靶向内体和溶酶体的内吞物质。组合上一个结果(7)和研究结果在这项工作中，我们提出了一个通向晚期内体的内吞途径模型如所示图5.作为流感是一种利用细胞成分的机会性病原体感染的内吞途径，这里导出的模型(图5)应具有一般性细胞内吞途径的意义。

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图5。

晚期内吞体的内吞途径模型。(1)病毒在肌动蛋白中内化并运输到早期内体（EE）（AT）依赖方式（第一阶段运动）。(2)含有病毒的内吞室使EE保持在细胞外pH值通过携带病毒的内吞载体囊泡（ECV）萌发发生来自EE(13,27)或者富含膜EE再循环的管状区域，以留下更具泡状的EE，其中包含病毒(33). (三)ECV或囊泡EE通过微管上的动力蛋白定向运动（MT）（第二阶段运动）。(4)ECV或囊泡EE通过以下方式成熟为成熟内体（ME）改变膜结合运动蛋白活性（从第二阶段过渡第三阶段运动）。(5)内体通过改变进一步成熟其pH值从细胞外值降至pH≈6（初始酸化为由CypHer 5和Cy3之间荧光比率的变化表示与病毒结合）。(6)进一步酸化会使pH值内体至晚期内体（LE）值，pH≈5（第二次酸化如病毒融合所示）。

补充材料

致谢

笔记

缩写：CHO，中国仓鼠卵巢；DIC，差分干扰对比度；细胞-D、细胞松弛素D；做，1,1'-二十八烷基-3,3,3'-，3'-四甲基吲哚二花青。

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