分子细胞生物学。2006年8月；26(16): 5933–5945.
凝血酶通过钙通道激活内皮细胞AMP-活化蛋白激酶2+/钙调素依赖性蛋白激酶β
,1 ,2 ,2和1,*
纳丁·斯塔曼
德国耶拿弗里德里希·席勒大学分子细胞生物学研究所，1英国伦敦哈默史密斯医院帝国学院MRC临床科学中心细胞应激小组2
安吉拉·伍兹
德国耶拿弗里德里希·席勒大学分子细胞生物学研究所，1英国伦敦哈默史密斯医院帝国学院MRC临床科学中心细胞应激小组2
大卫·卡林
德国耶拿弗里德里希·席勒大学分子细胞生物学研究所，1英国伦敦哈默史密斯医院帝国学院MRC临床科学中心细胞应激小组2
雷金·海勒
德国耶拿弗里德里希·席勒大学分子细胞生物学研究所，1英国伦敦哈默史密斯医院帝国学院MRC临床科学中心细胞应激小组2
德国耶拿弗里德里希·席勒大学分子细胞生物学研究所，1英国伦敦哈默史密斯医院帝国学院MRC临床科学中心细胞应激小组2
2006年3月3日收到；2006年4月7日修订；2006年5月26日接受。
摘要
AMP-activated protein kinase（AMPK）是细胞能量状态的传感器，用于响应代谢应激和其他调节信号。AMPK由上游激酶控制，最近被鉴定为LKB1或Ca2+/钙调素依赖性蛋白激酶β（CaMKKβ）。我们对人内皮细胞的研究表明，AMPK被凝血酶通过钙激活2+-凝血酶受体蛋白酶激活受体1和G的依赖性机制q个-蛋白介导磷脂酶C活化。STO-609对CaMKK的抑制或RNA干扰对CaMKβ的下调显著降低凝血酶诱导的AMPK活化，表明CaMKK-β是负责AMPK的激酶。相反，LKB1的下调并不影响凝血酶诱导的AMPK活化，而是通过5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷取消了AMPK的磷酸化。凝血酶刺激导致乙酰辅酶A羧化酶（ACC）和内皮型一氧化氮合酶（eNOS）磷酸化，这是AMPK的两个下游靶点。抑制或下调CaMKKβ或AMPK可消除ACC对凝血酶的磷酸化反应，但对eNOS磷酸化没有影响，表明凝血酶刺激的eNOS的磷酸化不是由AMPK介导的。我们的研究结果强调了Ca的作用2+作为AMPK激活的调节器，以响应生理刺激。我们还证明内皮细胞有两条激活AMPK的途径，一条激活Ca2+/CaMKKβ依赖性和一个AMP/LKB1依赖性。
AMP-activated protein kinase（AMPK）是一种异三聚体丝氨酸/苏氨酸激酶，由催化α亚基和调节β、γ亚基组成(6,16). AMPK被证明是细胞能量状态的传感器。在细胞内ATP下降后，AMP/ATP比率升高激活它，并启动一系列旨在调节细胞水平能量平衡的变化。这些过程包括抑制需要ATP的合成代谢途径，刺激生成ATP的分解代谢途径以及基因和蛋白质表达的变化(6,16). 此外，AMPK通过调节脂联素、瘦素或ghrelin等激素的作用，起到调节全身能量代谢的作用(28).
AMPK激活需要α亚单位激活环中苏氨酸172的磷酸化(18). 最近已经鉴定出两种AMPK激活激酶。LKB1是一种肿瘤抑制激酶，与两个辅助亚单位STRAD和MO25复合，已被证明磷酸化AMPK(19,23,38,46). 钙2+/钙调素依赖性蛋白激酶β（CaMKKβ）也被鉴定为AMPK激酶(20,25,45). 除了磷酸化外，AMPK还通过AMP的结合而被变构激活，这也可以促进苏氨酸172的磷酸化(21). 然而，如高渗应激或抗糖尿病药物二甲双胍所示，AMPK可以以AMP依赖的方式激活(14). CaMKKβ作用于AMPK上游的发现表明，除了AMP/ATP比率的变化外，细胞内Ca增加2+可能作为激活AMPK的第二条途径。
AMPK在不同来源的内皮细胞中广泛表达。内皮AMPK被缺氧应激激活(33)，过氧亚硝酸盐(49,50)，激素包括脂联素(7,35)和雌二醇(37)，二甲双胍(51)和血管介质，如缓激肽(32)和组胺或凝血酶(40). 一些研究表明，AMPK可能在内皮细胞能量供应中发挥作用(10); 防止细胞凋亡(26); 炎症、血管生成和灌注维持的调节(5,33,35,36). 最近，AMPK和内皮型一氧化氮合酶（eNOS）激活之间的联系引起了广泛关注，NO的形成被认为与AMPK的血管生成和抗炎作用有关(7,31,33,35,37,40,49,50,51). 因此，据报道，AMPK在其丝氨酸残基1177处磷酸化eNOS(7,8,31,33,35,40,49,50)或增强eNOS与热休克蛋白90之间的相互作用(37).
凝血酶是诱导AMPK磷酸化的刺激物之一，是一种在血管损伤部位产生的多功能丝氨酸蛋白酶。它介导凝血级联的最后一步，并通过G蛋白偶联蛋白酶激活受体（PAR）进一步激活血管细胞(9). 内皮细胞对凝血酶的反应包括形状和通透性的改变、粘附分子的表达以及细胞因子和自身类群（如NO）的合成，通常与细胞内钙的增加有关2+(三,15,30,42). 迄今为止，在凝血酶刺激内皮细胞时介导AMPK激活的上游激酶尚不清楚。此外，尚不完全清楚AMPK在何种条件下介导其假定下游靶点eNOS的磷酸化，以及凝血酶处理细胞中AMPK和eNOS激活是否相关。
我们研究的目的是研究导致AMPK激活的信号机制以及凝血酶刺激内皮细胞中AMPK的功能相关性q个-蛋白质/磷脂酶C-和钙2+-依赖性和ATP非依赖性。我们的研究确定CaMKKβ是在凝血酶刺激下负责AMPK磷酸化的上游激酶。凝血酶还诱导乙酰辅酶A羧化酶（ACC）磷酸化，ACC是AMPK和eNOS在丝氨酸1177的一个众所周知的下游靶点。然而，通过两种不同的方法（药物抑制或RNA干扰蛋白下调）抑制CaMKKβ或AMPK均表明，只有凝血酶诱导的ACC而非eNOS磷酸化由CaMKK-β/AMPK途径介导。
材料和方法
材料。
与AMPKα（兔多克隆）、磷酸-AMPKα（苏氨酸172，兔单克隆）、磷化-ACC（兔多菌落）和磷酸-eNOS（丝氨酸1177，兔多菌体）反应的抗体从Cell Signaling Technologies（德国法兰克福）获得。抗人eNOS的抗体（单克隆，克隆3）从美国肯塔基州莱克星顿的转导实验室获得。针对ACC和生物素化抗兔免疫球蛋白G（IgG）的兔多克隆抗体来自Upstate Biotechnology（英国邓迪）。山羊抗CaMKKβ抗体和过氧化物酶标记的牛抗山羊IgG来自圣克鲁斯生物技术公司（加州圣克鲁斯）。抗LKB1的小鼠单克隆抗体来自英国剑桥Abcam有限公司。过氧化物酶标记的抗小鼠和抗兔IgG以及过氧化物酶标记的链霉亲和素购自Kirkegaard&Perry Laboratories Inc.（马里兰州盖瑟斯堡）。蛋白酶抑制剂鸡尾酒完全，不含EDTA，来自罗氏诊断有限公司（德国曼海姆），储备溶液按照制造商的说明制备。5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷（AICAR）、钙调素、Gq个-蛋白拮抗剂2A、磷脂酶C抑制剂（U-73122）和AMPK抑制剂（化合物C）以及磷脂酶C激活剂米-3M3FBS来源于默克生物科学/Calbiochem（德国达姆施塔特）。STO-609来自Tocris（密苏里州埃利斯维尔），PAR-1激活肽TFLLR是E.Glusa（德国耶拿耶拿大学）慷慨赠送的礼物。[三H] cGMP Biotrak放射免疫测定法购自Amersham Pharmacia Biotech（德国弗赖堡）。凝血酶、离子霉素、1,2-双（2-氨基苯氧基）乙烷-N个,N个,N个′,N个′-四乙酸四（乙酰氧基甲酯）（BAPTA-AM）和其他试剂购自Sigma Chemical Co.（Deisenhofen，Germany）。
细胞培养。
如前所述，人脐带静脉内皮细胞（HUVEC）在含有15%胎牛血清、5%人血清和7.5μg/ml内皮细胞生长补充剂的M199中培养(22). 第一代或第二代传代后，将细胞置于直径为30 mm的微孔（转染实验和核苷酸测量）或直径为60 mm的培养皿上。在含有0.25%人血清白蛋白（HSA）的无血清M199中孵育6小时后开始实验。在HEPES-HSA缓冲液（10 mM HEPES[PH7.4]，145 mM NaCl，5 mM KCl，1 mM MgSO）中进行抑制剂预培养和细胞刺激4，10 mM葡萄糖，1.5 mM氯化钙20.25%HSA）。离子霉素、化合物C、STO-609和米-将3M3FBS溶解在二甲基亚砜中，并在−20°C下储存，直至使用。使用前立即制备U-73122储备溶液。在实验培养和细胞刺激期间，二甲基亚砜的最终浓度不超过0.1%，而对照细胞接受相同体积的溶剂添加。涉及给药G的实验q个-蛋白拮抗剂2A在如前所述的瞬时透化的细胞中进行(24,27). 简单地说，将HUVEC逐渐冷却，并在含有肽拮抗剂和0.005%皂苷的渗透缓冲液（20 mM HEPES[pH7.4]、10 mM EGTA、140 mM KCl、5 mM草酸二钾盐）中在冰上培养10分钟。随后，将细胞冲洗数次并逐渐加热。更换原始培养基，让细胞在刺激前恢复30分钟。
siRNA介导的AMPK、CaMKKβ和LKB1的敲除。
本研究中使用的小干扰RNA（siRNA）双链寡核苷酸基于编码AMPKα1、CaMKKβ和LKB1的人类cDNA。AMPKα1特异性siRNA双工体购自Sigma-Poligo（德国汉堡）。CaMKKβ和LKB1 siRNA以及非沉默对照siRNA来自QIAGEN GmbH（德国希尔顿）。应用于靶向AMPKα1的siRNA序列为5′-UCCUCACCAUCUAUAdTdT-3′（有义）和5′-UAUAUGAGAUGGUAGCAdT-3′（反义）。对于CaMKKβ，使用了5′-CGAUCAUCUGGGGUUAdTdT-3′（正义）和5′-UAACCAGAGAGAGAUGGGG-3′（反义）；对于LKB1，使用了5'-GGCUCUACGGCAAGGGGAdTdT-3′（正态）和5'-UCACCGUAGAGCCdTdT3′（反意义）。作为阴性对照的siRNA序列为5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3′（正义）和5′-ACGUGCACGUUCAGAAdTdT′（反义）。HUVEC（1.8×105)在转染前24小时将其置于直径为30 mm的培养皿上，当加入siRNA时，其融合率为50%。对于CaMKKβ或LKB1，siRNA双工体的用量为1μg/皿，对于AMPKα1，为2μg/碟。根据制造商的说明，使用两亲递送系统SAINT-RED（Synvolux Therapeutics B.V.，Groningen，the Netherlands）进行转染。简单地说，siRNA与15 nmol转染试剂络合，用M199-HSA稀释至1 ml，并添加到细胞中4 h。随后，添加2 ml培养基并进行72 h的培养。
蛋白质印迹分析。
在含有1%Triton X-100、0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）、50 mM NaF、10 mM Na的冰镇Tris缓冲液（50 mM Tris[pH7.4]、2 mM EDTA、1 mM EGTA）中溶解HUVEC4P（P）2O（运行）7，1 mM钠三VO（旁白）4，1mM二硫苏糖醇，1mM苯甲基磺酰氟和10μl/ml蛋白酶抑制剂混合物储备溶液。为了检测CaMKKβ细胞裂解物，使用多克隆抗CaMKKβ抗体（4μg/mg蛋白质，过夜）和蛋白g-Sepharose（1 h）进行免疫沉淀。裂解蛋白和免疫复合物在Laemmli缓冲液中溶解，并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（50μg/lane，7.5%凝胶）分离。用过夜的一级抗体和过氧化物酶结合的二级抗体对印迹进行免疫染色1小时，并使用ECL技术对蛋白质进行可视化。使用生物素化二级抗体和过氧化物酶标记的链霉亲和素实现ACC染色。蛋白质条带通过密度测定法进行评估，磷特异性信号根据总蛋白量进行标准化。通过比较特定处理样品及其各自对照的基础值和刺激值之间的差异来计算磷酸化的变化。
AMPK、CaMKKβ和LKB1分析的样品制备。
在实验处理后，用HEPES缓冲液（50 mM HEPES[pH7.4]，包括50 mM NaF、1 mM EDTA、1 mM二硫苏糖醇、5 mM Na）冲洗HUVEC4P（P）2O（运行）7)并在含有0.1 mM苯甲基磺酰氟、0.157 mg/ml苯甲脒、4 mg/ml胰蛋白酶抑制剂、1%Triton X-100和10%甘油的HEPES缓冲液中溶解。
AMPK免疫沉淀和分析。
使用兔抗泛β抗体从50至100μg细胞裂解物蛋白免疫沉淀AMPK(44)和蛋白A-Sepharose或羊抗α1抗体(47)和蛋白G-Sepharose。AMPK活性通过合成底物HMRSAMSGLVKRR（SAMS）肽的磷酸化测定(11)在5 mM MgCl存在下2，0.2 mM[γ-32P] ATP（比活度约为200 cpm/pmol）和0.2 mM AMP。
CaMKKβ免疫沉淀和测定。
使用2μl兔血清从100μg细胞裂解物蛋白中免疫沉淀CaMKKβ，将其培养成与蛋白A-Sepharose结合的细菌表达CaMKK-β。通过在2mM CaCl存在下活化纯化的重组AMPK复合物来测量活性2、2μM牛脑钙调素和0.2 mM AMP(45).
LKB1免疫沉淀和测定。
使用2μl兔血清从100μg细胞裂解物蛋白中免疫沉淀LKB1，将其培养成细菌表达的LKB1结合蛋白A-Sepharose。LKB1活性与CaMKK活性通过激活AMPK进行测量，但在没有CaCl的情况下2和钙调蛋白。
腺嘌呤核苷酸测量。
用凝血酶（1 U/ml）刺激HUVEC单层，用磷酸盐缓冲盐水冲洗细胞，并添加最终浓度为5%（wt/vol）的高氯酸，停止反应。通过离心去除不溶于酸的物质，并通过三次洗涤从上清液中提取高氯酸，其中10%过量（按体积计）的三-n个-辛胺和1,1,2-三氯三氟乙烷。如其他地方所述，在SMART系统（Amersham Biosciences）上运行的Mono Q PC1.6/5柱上通过离子交换色谱分离核苷酸(14). 通过在254nm处的吸光度检测核苷酸，并与标准品的洗脱位置进行比较。使用SMART系统软件通过积分量化AMP和ATP峰值下的面积，并用于计算AMP/ATP比值。
cGMP的测定。
将HUVEC单层在含有0.5 mM异丁基甲基黄嘌呤的M199-HSA中培养30 min，并用凝血酶刺激15 min。用96%乙醇停止反应，蒸发后添加50 mM Tris-4 mM EDTA（pH 7.5）。如前所述，用放射免疫分析法测定细胞提取物的cGMP含量(22). 用100 mM NaOH和2%Na溶解平行培养皿中的细胞2一氧化碳三和1%SDS，并根据Lowry方法测定蛋白质含量。细胞内cGMP浓度以pmol/mg细胞蛋白表达。
统计分析。
所有数据均以三到四个独立实验的平均值±平均值标准误差（SEM）的形式给出。为了确定所述结果的统计显著性，使用Bonferroni的多重比较校正进行方差分析或t吨进行了测试。一P（P）<0.05的值被认为具有统计学意义。
结果
凝血酶激活内皮细胞中的AMPK。
用凝血酶治疗HUVEC（0.05至2 U/ml，0.25至15分钟）导致苏氨酸残基172处AMPK的磷酸化呈剂量和时间依赖性（图。). 这种磷酸化对AMPK活性至关重要，反映了AMPK的激活。当AMPK被免疫沉淀，其活性通过32P并入AMPK-特异性SAMS肽（图。). AMPK激活是短暂的，在15秒时可检测到，在1分钟时达到峰值，在15分钟时恢复到控制水平。
凝血酶对内皮细胞AMPK激活的影响。用不同凝血酶浓度刺激HUVEC 1分钟（A）或用1 U/ml凝血酶刺激指定时间（B和C）。使用苏氨酸172磷酸化的AMPKα抗体或反AMPK抗体对A和B细胞裂解物进行Western blot分析以进行反染色。显示了代表性的斑点和密度分析（平均值±SEM，n个= 3). 使用抗AMPKβ抗体从100μg总蛋白中免疫沉淀C.AMPK，并使用SAMS肽分析测定免疫复合物的活性。AMPK活性以U/mg裂解蛋白表示（平均值±SEM，n个=3），其中1个单位等于1 nmol32人事军官4每分钟并入SAMS肽中。
,P（P）与未经治疗的对照组相比，<0.05。
AMPK的凝血酶激活与细胞AMP/ATP比率无关。
因为细胞AMP/ATP比率是AMPK活性的主要决定因素之一，所以凝血酶对该比率的影响是在凝血酶最大程度刺激AMPK的时间点进行测量的。凝血酶刺激HUVEC 0（对照组）、0.5、1和2分钟后，AMP/ATP比值分别为0.037±0.003、0.034±0.002、0.037±.003，和0.041±0.002（数据为三个实验的平均值±SEM）。如图所示，凝血酶刺激后AMP/ATP比率没有显著变化，表明AMPK激活独立于腺嘌呤核苷酸水平的变化。相反，二硝基酚（500μM，15分钟），一种已知激活AMPK的线粒体电子传递解偶联剂，明显将AMP/ATP比率从0.033±0.001增加到0.119±0.006(n个= 2).
凝血酶通过PAR-1和G激活AMPKq个-蛋白介导磷脂酶C活化。
凝血酶通过栓系配体机制通过G蛋白偶联的PAR对内皮细胞发挥作用。这包括受体氨基末端的蛋白水解裂解和新暴露的栓系配体与受体活化位点的分子内结合(9). 我们使用PAR-1新N末端的肽类似物TFLLR来检测PAR-1（主要凝血酶受体）是否在HUVEC中表达(34)参与AMPK激活。TFLLR（10μM，0.25至15分钟）模拟凝血酶的作用，并诱导苏氨酸172处AMPK磷酸化的时间依赖性增加（图。).
凝血酶诱导的AMPK激活是通过PAR-1，G介导的q个偶联和磷脂酶C活化。A.用PAR-1激动肽TFLLR（10μM）刺激HUVEC指定时间。B.HUVEC用百日咳毒素（PTX）（500 ng/ml，3 h）或Gq个-蛋白拮抗剂2A（GPA-2A）（5μM，在瞬时渗透细胞中预培养10分钟），然后用凝血酶刺激（1 U/ml，1分钟）。C.HUVEC用U-73122预处理（10μM，30 min）并用凝血酶刺激（1 U/ml，1 min）或用磷脂酶C激活剂交替处理米-3M3FBS（100μM，2分钟）。对于面板A至C，使用磷酸化AMPKα（苏氨酸172）抗体和总AMPKβ抗体对细胞进行裂解和免疫印迹，以进行反染色。显示了每个治疗的三个独立实验的代表性数字和密度测定数据（平均值±SEM）。比较了TFLLR刺激和非刺激细胞（A）或在没有或存在抑制剂（B和C）的情况下用凝血酶刺激的细胞发出的磷脂酶特异性信号。,P（P）< 0.05.
已知PAR-1通过Gα的伴随激活对内皮细胞产生影响输入/输出，Gαq个和Gα12/13G蛋白家族(9). 为了确定哪些G蛋白介导AMPK激活，在用G蛋白抑制剂预处理的细胞中测量凝血酶诱导的AMPK磷酸化。图显示百日咳毒素（500 ng/ml，3 h）抑制Gα输入/输出ADP核糖基化的亚基对AMPK的活化没有影响。相反，当用G预处理细胞时，凝血酶刺激的AMPK磷酸化被消除q个-蛋白拮抗剂2A（5μM，10分钟）。验证Gq个磷脂酶C的激活是凝血酶诱导AMPK激活的必要条件，我们用磷脂酶C抑制剂U-73122进行了实验。用U-73122预处理细胞（10μM，30分钟）可显著阻止凝血酶引起的AMPK磷酸化（抑制78%），相反，通过米-3M3FBS（100μM，2分钟）模拟凝血酶对AMPK的影响（图。).
凝血酶诱导钙2+动员触发AMPK激活。
当HUVEC被钙刺激时2+离子载体离子霉素（2μM，0.25至15分钟）AMPK磷酸化与凝血酶刺激后的磷酸化相似（图。)表明Ca2+可能是内皮细胞AMPK激活的信号。此外，已知凝血酶可诱导细胞内钙的增加2+通过Gαq个-磷脂酶C-β的耦合刺激(43). 因此，我们调查了Ca2+该信号可能参与凝血酶诱导的AMPK激活。我们的数据表明细胞内钙的螯合作用2+通过BAPTA（20μM，30分钟）导致凝血酶刺激的AMPK磷酸化的完全抑制（图。).
钙的作用2+凝血酶诱导的AMPK激活。A.用离子霉素（2μM）刺激HUVEC达指定时间。B.HUVEC用BAPTA-AM预处理（20μM，30 min），然后用凝血酶刺激（1 U/ml，1 min）。对于面板A和B，使用抗磷酸特异性苏氨酸172抗体通过Western blot分析测定AMPK的苏氨酸172-磷酸化程度。用抗AMPKα抗体对AMPK进行染色。显示了每个治疗的三个独立实验的代表性数字和密度测定数据（平均值±SEM）。比较了离子粘蛋白刺激和非刺激细胞（A）或在无或存在BAPTA-AM（B）的情况下用凝血酶刺激的细胞发出的磷脂酶特异性信号。,P（P）< 0.05.
CaMKKβ通过凝血酶刺激介导AMPK激活。
LKB1和CaMKKβ均在HUVEC中表达，如图所示。由于凝血酶刺激的AMPK激活是Ca2+敏感，我们推断CaMKKβ可能是AMPK激酶参与的。作为解决这个问题的第一次尝试，我们使用STO-609进行了实验，这是一种相对选择性的CaMKKα和CaMKKβ抑制剂(20,41). STO-609（5、10和20μg/ml；30分钟）导致苏氨酸172处凝血酶诱导的AMPK磷酸化的剂量依赖性降低（图。). 相应地，SAMS肽分析监测的AMPK活性被抑制了66%（图。).
RNA干扰下调CaMKKβ和LKB1。HUVEC在以人CaMKKβ或人LKB1为靶点的合成RNA双工体存在下培养（1μg/30-mm培养皿，72小时）。仅用转染试剂（对照）或用含有无关序列的对照RNA双链体（对照siRNA）进行培养，平行进行。A.分别用抗CaMKKβ抗体或抗LKB1抗体检测抗CaMKβ免疫复合物（左面板）或细胞裂解物（右面板）中的蛋白表达。显示了每个处理的三个独立实验中的代表性Western印迹。B.从100μg细胞裂解液中分离出的抗CaMKKβ或抗LKB1免疫复合物中测定CaMKK-β或LKB1活性。结果绘制为免疫复合物刺激的AMPK活性，并使用SAMS肽（U/mg重组AMPK，其中1单位等于1 nmol32人事军官4每分钟并入SAMS肽中）。显示了三个独立实验的平均值±SEM。,P（P）与对照siRNA相比<0.05。
CaMKKβ抑制对凝血酶诱导的AMPK激活的影响。将HUVEC与STO-609在指定浓度下预培养30分钟。A.用磷酸化AMPKα（苏氨酸172）抗体和总AMPKβ抗体对细胞进行裂解和免疫印迹，以进行反染色。显示了一个典型实验和四个实验的密度分析（平均值±SEM）。通过磷酸化SAMS肽，从100μg总蛋白中分离出的抗AMPKα1免疫复合物中检测了B.AMPK活性。AMPK活性显示为U/mg裂解物蛋白（平均值±SEM，n个=3），其中1个单位等于1 nmol32人事军官4每分钟并入SAMS肽。,P（P）与未经治疗的凝血酶刺激对照组相比，<0.05。
为了进一步评估CaMKKβ或LKB1在凝血酶刺激的细胞中是否作为AMPK激酶发挥作用，我们使用siRNA方法敲低LKB1和CaMKKβ的表达。蛋白质的下调通过细胞裂解物（LKB1）或免疫沉淀物（CaMKKβ）的Western blot分析和酶活性测量证实。图通过两种方法证明了各自的特异siRNA对CaMKKβ或LKB1的选择性下调。与转染对照siRNA相比，CaMKKβ活性降低了72%±8.1%(n个=3）和LKB1活性增加71%±3.21%(n个=3），免疫印迹中的蛋白表达无法检测到。
在平行实验中，我们研究了LKB1或CaMKKβ下调对凝血酶（1 U/ml，1 min）诱导的AMPK激活的影响。如图所示。用LKB1 siRNA预处理细胞时，AMPK磷酸化与凝血酶没有显著变化。然而，CaMKKβ的下调导致凝血酶诱导的AMPK磷酸化显著降低（66%±15.5%，n个=4），表明在这些条件下，CaMKKβ是主要的AMPK激酶。相反，AICAR（2 mM，2 h）诱导的AMPK磷酸化在LKB1表达降低的细胞中被完全抑制，但不受CaMKKβ下调的影响。AMPK的基础磷酸化水平很低，并且似乎随着LKB1或CaMKKβ的缺失而降低。有趣的是，当用siRNA双工体组合处理细胞以靶向CaMKKβ和LKB1时，单个siRNA对凝血酶或AICAR诱导的AMPK激活的影响没有被放大。
CaMKKβ和LKB1下调对凝血酶诱导的AMPK激活的影响。将靶向人CaMKKβ或人LKB1的合成RNA双链体（1μg/30mm培养皿）单独或联合添加到HUVEC中，孵育72小时。仅用转染试剂（对照）或用含有不相关序列的对照RNA双链体（对照siRNA，1或2μg）并行处理。siRNA处理后，用凝血酶（1 U/ml，1 min）或AICAR（2 mM，2 h）刺激细胞，并用磷酸特异性抗体磷酸化苏氨酸172来监测AMPK的激活。用抗AMPKα抗体对AMPK进行染色。给出了四个实验（B）的典型印迹（A）和密度分析结果（平均值±SEM）。,P（P）与用对照siRNA预处理并用凝血酶或AICAR刺激的样品相比，<0.05。
综上所述，来自两种独立方法的数据，即药理学酶抑制和蛋白质下调，揭示了CaMKK，尤其是CaMKK-β作为凝血酶激活的AMPK激酶的作用，而LKB1似乎对凝血酶诱导的AMPK活化没有贡献。
凝血酶刺激的AMPK磷酸化ACC，但不磷酸化eNOS。
为了了解凝血酶对AMPK的激活是否具有功能相关性，我们研究了ACC的磷酸化，ACC是AMPK的一种表征良好的底物(16)eNOS被认为是内皮细胞AMPK的潜在下游靶点(7,31,33,35,40,49,50). 图证明凝血酶（1 U/ml，0.25至15分钟）以时间依赖性的方式刺激ACC和eNOS磷酸化，其动力学与AMPK激活的动力学相当。当用TFLLR刺激HUVEC（10μM，0.25至15分钟）时，也获得了类似的结果（图。). 为了确定AMPK在凝血酶诱导的ACC或eNOS磷酸化中的作用，我们使用了几种方法。首先，如上文所述，我们通过靶向其上游激酶CaMKKβ来阻止AMPK激活。其次，我们使用化合物C（AMPK的药理抑制剂）直接抑制AMPK活性(48)最后，我们下调了AMPKα1，据报道，它是内皮细胞中主要的AMPK亚型（参考文献31和我们的数据[未显示]）。后一种处理导致AMPK表达降低66%±7.0%，如Western blotting所示(n个= 3,P（P）<0.05）（图。).
凝血酶和TFLLR对ACC和eNOS磷酸化的影响。用1 U/ml凝血酶（A）或10μM TFLLR（B）刺激HUVEC达指定时间。ACC和eNOS磷酸化是使用针对磷酸化ACC或在丝氨酸1177磷酸化eNOS的特异性抗体来测定的。抗-ACC和抗eNOS抗体分别用于相应的反染色。显示了每个处理的三个独立实验的代表性实验和密度测定数据（平均值±SEM）。,P（P）与未经治疗的对照组相比，<0.05。
AMPK抑制或下调对凝血酶诱导的ACC和eNOS磷酸化的影响。将HUVEC与靶向CaμK Kβ或AMPKα1的合成siRNA双工体孵育72 h，或用任何一种酶抑制剂预处理（针对Caμk Kβ的STO-609和针对AMPK的化合物C）。随后，用凝血酶刺激细胞（1 U/ml，1 min）并进行免疫印迹处理。使用磷酸化AMPK（苏氨酸172）、ACC或eNOS（丝氨酸1177）的特异性抗体测定AMPK、ACC和eNOS的磷酸化。用抗AMPKα、抗ACC或抗eNOS抗体监测蛋白质的表达。显示了每个治疗的三个（C）或四个（A、B和D）独立实验的代表性数字和密度测定数据（平均值±SEM）。A.细胞在靶向人类CaMKKβ的合成siRNA或非沉默对照siRNA（1μg/30-mm培养皿）中培养72小时。Β. 用STO-609预处理HUVEC（20μg/ml，30分钟）。用靶向人AMPKα1的siRNA或非靶向对照siRNA（2μg/30mm培养皿）转染C.HUVEC。D.用化合物C（20μM，30 min）预处理细胞。,P（P）与用对照siRNA（A和C）或溶剂（B和D）预处理的凝血酶刺激样品相比，<0.05。
siRNA去除CaMKKβ以及STO-609（20μg/ml，30分钟）抑制CaMKKK分别导致ACC磷酸化显著抑制76%和98%（图。). 此外，化合物C（20μM，30 min）下调AMPK表达或直接抑制AMPK，导致凝血酶诱导的ACC磷酸化分别显著降低69或86%（图。). 这些数据证实ACC在凝血酶刺激的内皮细胞中被AMPK磷酸化。然而，与ACC相反，在这些条件下，eNOS不能被确定为AMPK下游靶点。所有旨在抑制AMPK激活或降低AMPK表达的应用治疗均不能影响凝血酶诱导的丝氨酸1177处的eNOS磷酸化（图。).
为了检测AMPK是否独立于eNOS磷酸化影响eNOS激活，我们通过测量cGMP评估凝血酶刺激的HUVEC中NO的形成。用凝血酶刺激细胞后，细胞cGMP的增加反映了细胞内生成的NO对可溶性鸟苷酸环化酶的激活，并可通过抑制eNOS而完全阻止我-硝基精氨酸甲酯（1 mM，30 min；数据未显示）。我们的结果表明，化合物C和AMPK的下调均未显著影响凝血酶刺激的cGMP形成（表)这表明凝血酶诱导的AMPK激活和eNOS激活并不相关。
表1。
AMPK抑制或下调对凝血酶诱导cGMP生成的影响一
| 呼气和治疗 | cGMP（pmol/mg蛋白质） |
|---|
| 一 | |
| 控制 | 1.03 ± 0.69 |
| 化合物C | 1.03 ± 0.39 |
| 对照+凝血酶 | 12.99 ± 4.51 |
| 复合C+凝血酶 | 13.62 ± 4.20 |
| B类 | |
| 控制siRNA | 0.85 ± 1.44 |
| AMPKα1 siRNA | 0.60 ± 0.25 |
| 控制siRNA+凝血酶 | 10.06 ± 5.76 |
| AMPKα1 siRNA+凝血酶 | 10.95 ± 2.74 |
讨论
我们的结果表明，凝血酶能够通过钙激活内皮细胞中的AMPK2+-并将CaMKKβ确定为负责的上游激酶。钙2+动员似乎通过凝血酶与其受体PAR-1的结合介导，活化Gq个蛋白质和磷脂酶C的后续刺激。这里的数据支持钙的作用2+作为AMPK激活的信号，提示内皮细胞中CaMKKβ/AMPK途径的生理功能。
我们的研究首次描述了人原代内皮细胞中CaMKKβ的表达及其在AMPK激活中的功能意义。先前的研究报道AMPK通过凝血酶、组胺或G被激活q个-蛋白质偶联途径(29,40)尽管上游信号通路尚未确定。在这里，我们描述了凝血酶激活AMPK的上游信号事件。我们通过测量AMPK在其关键残基苏氨酸172的磷酸化和通过特定底物的磷酸化测定AMPK活性，证实了凝血素激活内皮细胞中的AMPK。我们发现凝血酶激活AMPK几乎被Gq个-蛋白拮抗剂、磷脂酶C抑制剂或钙2+-螯合剂，表明Ca2+通过G介导的增加q个-活化磷脂酶C是绝对必要的。因此，两个独立的证据，即STO-609对CaMKK的药理抑制和特定靶向siRNA对CaMKβ的下调，证实了CaMKK-β2+-依赖性AMPK激酶，用凝血酶介导AMPK活化。相反，我们没有发现LKB1有任何作用的证据。我们能够将LKB1活性下调约71%，但没有观察到LKB1 siRNA单独或与CaMKKβsiRNA结合对凝血酶激活AMPK的显著影响。然而，STO-609和CaMKKβsiRNA都不能完全阻断凝血酶诱导的AMPK激活。这可能反映了对CaMKKβ的不完全抑制或下调，因为用特定siRNA处理的内皮细胞含有约28%的残余CaMKKβ活性。然而，不能排除另一种尚未确定的AMPK激酶的作用。
有趣的是，我们的结果表明内皮细胞中也存在功能性LKB1/AMPK通路。虽然LKB1对凝血酶刺激的AMPK激活没有贡献，但它能够介导AICAR诱导的AMCK激活。AICAR在细胞内磷酸化为5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸（ZMP），模拟AMP对AMPK的作用。AICAR此前已证明通过LKB1发挥作用(19,25,38). 我们的数据与这些观察结果一致。特定靶向siRNA下调LKB1能够阻止AICAR诱导的AMPK磷酸化，而单独或与LKB1 siRNA联合添加的CaMKKβsiRNA对AICAR诱发的反应没有影响。综上所述，这些发现表明AMPK可能通过两种不同的机制在内皮细胞中被激活，即钙2+/CaMKKβ依赖性和AMP/LKB1-依赖性途径。如图所示，凝血酶和AICAR可单独刺激这些通路，或当两者同时激活时，这些通路并行刺激2+在某些情况下，如缺氧，ATP会发生改变(1). 有趣的是，细胞内Ca后AMPK的激活2+凝血酶的增加似乎是非常迅速和短暂的，可能对满足细胞刺激期间的需求很重要，而对AICAR和二硝基酚诱导的ATP耗竭的反应是延迟和持久的（数据未显示）。因此，Ca2+-和AMP依赖性途径可共同作用，以确保在必要时立即和长期响应。
为了探讨凝血酶刺激的AMPK激活的功能相关性，我们进行了研究AMPK下游靶点的实验。内皮细胞中被AMPK磷酸化的底物之一是eNOS(7,31,33,35,40,49,50). 最近已经证明eNOS受到可逆磷酸化的调节，丝氨酸1177的磷酸化通过降低其对Ca的敏感性来促进eNOS的激活2+(8,12). 这一过程似乎活跃于导致NO形成的各种信号通路，以及除AMPK外的不同激酶（Akt、蛋白激酶A和G以及钙2+/钙调素依赖性激酶II）可能参与(12). AMPK已被证明在低氧、过氧亚硝酸盐和脂联素的作用下介导丝氨酸1177磷酸化(7,33,35,49,50). 此外，据报道，AICAR激活AMPK可诱导eNOS磷酸化和内皮NO生成(31). 我们的结果表明，抑制或耗竭CaMKKβ（这在很大程度上阻止了凝血酶诱导的AMPK激活），或抑制或下调AMPK本身对凝血酶刺激的eNOS磷酸化没有任何影响。因此，在凝血酶刺激内皮细胞后，eNOS似乎不是AMPK的下游靶点。
我们的发现与之前的一项研究相反，该研究表明AMPK参与凝血酶介导的eNOS磷酸化(40). 在该研究中，H89是一种相对非特异性的蛋白激酶抑制剂，可抑制AMPK，能够消除凝血酶诱导的eNOS磷酸化。与这种间接方法相反，我们的研究表明，当上游激酶的AMPK激活被阻止或AMPK蛋白被下调时，凝血酶诱导的eNOS磷酸化不受影响。我们认为凝血酶可能通过激活另一个已知靶向eNOS丝氨酸1177的激酶来刺激eNOS磷酸化。我们发现凝血酶诱导的eNOS磷酸化本质上依赖于钙2+因为BAPTA的加入完全阻止了这种情况的发生（数据未显示）。因此，Ca2+/钙调素依赖性激酶II可能与凝血酶介导的eNOS磷酸化有关。凝血酶已经被证明能激活这种激酶(4)缓激肽，另一个Gq个-蛋白偶联刺激已被证明通过钙磷酸化丝氨酸1177处的eNOS2+/钙调素依赖性激酶II(13).
我们无法解释我们的研究与其他表明AMPK在eNOS磷酸化中与缺氧、过氧亚硝酸盐、脂联素或AICAR的作用的研究之间的差异(31,33,35,49,50). 然而，可能是在细胞内钙2+凝血酶诱导Ca快速直接磷酸化eNOS2+-依赖性激酶在AMPK途径中占主导地位。因此，显性阴性AMPK突变对离子霉素刺激的no生成没有影响，而AICAR诱导的no生成受到抑制(31). 此外，通过AMPK进行eNOS磷酸化可能需要磷酸肌醇3-激酶敏感途径，正如过氧亚硝酸盐或脂联素所建议的那样(7,49)或者可能还与缺氧细胞中AMP/ATP比率的变化有关。Nagata等人(33)例如，他们发现AMPK对eNOS的丝氨酸1177磷酸化仅在缺氧条件下发生，而在常压条件下不发生。另一方面，最近的研究报道AMPK激活和eNOS磷酸化也可能分离(32,37)或者AMPK可以通过增强eNOS和热休克蛋白90之间的相互作用而独立于丝氨酸1177磷酸化增加NO的形成(37). 然而，在我们的条件下，AMPK抑制或下调对凝血酶诱导的cGMP形成没有影响，这表明它也没有通过磷酸化诱导依赖机制影响eNOS的激活。
虽然eNOS不能被证实为AMPK的下游靶点，但我们的研究结果表明CaMKKβ/AMPK通路在内皮细胞中具有功能相关性。ACC是AMPK的著名底物，在凝血酶刺激下被磷酸化，当CaMKKβ或AMPK被药物抑制或下调时，这种磷酸化被抑制。ACC有两种亚型（ACC1和ACC2），它们都被AMPK磷酸化所抑制。我们研究中使用的磷酸特异性ACC抗体识别这两种亚型的磷酸化形式。ACC1是调节脂肪酸合成的关键酶(17)而ACC2是调节脂肪酸氧化的关键酶(16). ACC1的磷酸化将减少脂肪酸合成并降低ATP消耗，而ACC2的磷酸化则会增加脂肪酸氧化，增加ATP供应(16). AMPK激活已被证明参与内皮细胞能量代谢，如AICAR刺激后脂肪酸氧化和ATP增加所示(10). 因此，据报道，与AICAR孵育可以保护内皮细胞免受细胞内ATP的损失和高血糖诱导的脂肪酸氧化的减少(26). 已知凝血酶在内皮细胞中启动需要ATP的过程，如形状改变、粘附分子表达以及血管介质和细胞因子的合成。因此，我们的结果表明，凝血酶诱导的AMPK刺激和随后的ACC磷酸化可能对平衡细胞刺激后的能量代谢和为能量需要过程提供ATP很重要。
总之，本研究表明LKB1和CaMKKβ均存在于内皮细胞中，在不同条件下介导AMPK活化。一种可能性是，随着AMP/ATP比率的增加，LKB1依赖性途径被激活，而CaMKKβ依赖性途径在细胞内Ca增加后被激活2+凝血酶是血液凝固过程中产生的一种强有力的血管细胞刺激物，通过钙激活AMPK2+-涉及CaMKKβ的依赖性途径。凝血酶诱导的AMPK激活导致ACC的磷酸化，而凝血酶刺激的eNOS的磷酸化不是由AMPK介导的。我们的研究表明，根据应用的刺激AMP-和Ca2+-内皮AMPK激活的依赖性途径可能单独或协同作用，以维持细胞的能量平衡。
致谢
这项工作得到了Deutsche Forschungsgemeinschaft（Graduiertenkolleg 768）和Interdisziplinäres Zentrum für Klinische Forschund、Klinikum der Friedrich-Schiller-Universität Jena向r.H.提供的资助，以及欧洲委员会和医学研究理事会（英国）向哥伦比亚特区提供的综合项目（LSHM-CT-2004-005272）的支持。
我们感谢Gunda Guhr和Elke Teuscher提供的出色技术援助。
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