超氧化物的选择性荧光成像体内使用基于乙二醇的探针

摘要

线粒体功能障碍导致的氧化应激与神经退化、衰老、癌症和糖尿病有关(1,2). 线粒体电子传递复合物和DNA的氧化损伤可导致线粒体DNA突变、电子传递异常、钙稳态破坏和细胞凋亡激活(三). 线粒体消耗呼吸过程中吸入氧气的≈85–95%(1)，其中大部分被还原为水，但一小部分（估计范围从<0.1%到高达4%）电子从呼吸链泄漏，以将氧气还原为超氧化物（O₂^•−) (4,5). 复合物I和III是O的主要位置₂^•−形成(三,4). 呼吸链载体的膜电位和还原状态均影响O₂^•−生产(三).

评估O的生成₂^•−线粒体中缺乏敏感和特异的检测(6). 一些O₂^•−传感器实际上产生O₂^•−通过解偶联呼吸链（如鲁米诺）或与氧气反应（如鲁米诺和硝基蓝四氮唑；参考文献。7和8). 许多O₂^•−传感器与细胞内氧化还原酶反应，可以人工产生“超氧化物”信号[例如，氢乙硫胺（HE）、细胞色素c（c）硝基蓝四氮唑、肾上腺素、荧光素和鲁米诺；裁判。8]. 为了避免这些技术问题，我们报告了一种检测O的技术₂^•−使用HE和最近开发的探针MitoSOX red，一种线粒体超氧化物指示剂（Invitrogen，Mito-HE）。Mito-HE由HE组成，HE是O的常用探针₂^•−，由己基碳链连接到三苯基鏻（TPP⁺)组。第三方程序⁺阳离子将分子靶向线粒体，因为鏻上的正电荷被三个亲脂性苯基包围，这有助于磷脂双层的运动和响应负膜电位而积累到线粒体基质中(9).

HE是乙炔（Etd）的双电子还原形式⁺; 3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲）。1984年，盖洛普等。(10)据报道，HE很容易被活细胞吸收和内化，在那里HE可以被氧化为Etd⁺，嵌入核酸，当使用535-nm激发波长和610-nm发射波长时，大大增强其荧光(11). 氧化成Etd⁺最初归因于细胞的代谢状态和细胞脱氢HE的能力(11). 然而，在1990年，Rothe和Valet(12)显示在体外HE被超氧化物钾氧化为红色荧光产物。此后，HE被广泛用于检测吞噬细胞呼吸爆发期间的活性氧物种(12,13)用于检测细胞内O₂^•−(6,14). 然而，Rothe和Valet也表明，HE不仅被O氧化₂^•−也可以通过H₂O（运行）₂加过氧化物酶(12). HE也可能被其他细胞内过程氧化，包括氧化酶或细胞色素，从而产生Etd⁺(11,15–18). 因此，增加了Etd⁺荧光不一定是O的证据₂^•−生产。斯旺内尔等。(19)提出HE可以被氧化成一种以上的红色荧光产物。2003年，赵等。(20)据报道HE被O氧化₂^•−生成羟基化产物（HO-Etd⁺). HE的初始氧化被认为涉及自由基的形成(15)，意味着HE被O氧化₂^•−包含两步机制(方案1).

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方案1。

HO-Etd公司⁺可以与Etd分开⁺通过HPLC，提供特定的O₂^•−化验，化验(20). 然而，HO Etd的检测⁺荧光显微镜的结果令人困惑，因为它的发射光谱与Etd的发射光谱强烈重叠⁺(20,21).

我们研究了O对Mito-HE的氧化作用₂^•−发现Mito HE被O氧化₂^•−以类似于HE的方式(方案1). 在这些调查过程中，我们发现O₂^•−-Mito-HE的衍生产物在396 nm处具有独特的激发波长，这对于其他氧化产物来说是不存在的。HO-Etd公司⁺在这种波长下也被选择性激发。分离O荧光的能力₂^•−-来自其他低特异性氧化产物的衍生产物可以改善细胞内O的检测和成像₂^•−生产。

结果

Mito-HE的选择性氧化。

黄嘌呤氧化酶产生的超氧化物氧化了Mito-HE，通过反相HPLC得到两个紧密洗脱峰（图8，作为PNAS网站上的支持信息发布）。后一个峰被确定为双电子氧化形式的Mito-HE（3,8-二氨基-5-己基三苯基膦-6-苯基菲啶，Mito-Etd⁺)通过与标准溶液和质谱仪的共溶。第一个峰含有一个额外的氧，被鉴定为羟基化产物HO-Mito-Etd⁺过氧化氢、过氧亚硝酸盐、次氯酸或羟基自由基生成系统对Mito-HE的氧化仅产生O氧化产生的荧光的一小部分₂^•−（表1，作为支持信息发布在PNAS网站上）。HO-Mito-Etd的荧光发射最大值⁺相对于Mito-Etd，蓝移≈20 nm⁺(图1一)类似于HE超氧化物产品HO-Etd的报告⁺(20). 有趣的是，纯化HO-Mito-Etd的激发光谱⁺揭示了396nm处的激发最大值，而Mito-Etd不存在该最大值⁺(图1b条). 396 nm激发(图1c（c）)增强HO-Mito-Etd的荧光发射⁺减少了70%，减少了Mito-Etd的光谱重叠⁺从40%到10%。HO-Etd的激发谱⁺在396 nm处也有明显的激发，这对于Etd来说是不存在的⁺（图9，作为支持信息发布在PNAS网站上）。因此，在396 nm处激发可以作为检测O的更具选择性的手段₂^•−使用HE或Mito HE。

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图1。

HO-Mito-Etd公司⁺具有396nm的选择性激发波长。(一)等摩尔浓度的Mito-Etd的荧光发射⁺（-）与HO-Mito-Etd荧光发射的40%重叠⁺（−−）在510 nm激发。(b条)激发光谱（579nm发射）显示HO-Mito-Etd⁺（−−）在396 nm处具有明显的激发，这对于Mito-Etd来说是不存在的⁺(—). (c（c）)396 nm激发增强了HO-Mito-Etd的荧光发射⁺（−−）减少70%，减少了Mito-Etd的光谱重叠⁺（-）至10%，与510-nm激励相比。

线粒体超氧化物的检测。

线粒体HE以依赖线粒体膜电位的方式在分离的线粒体中积累，并通过吸附到膜上(图2). 测试Mito-HE检测O的相对能力₂^•−使用激发波长（λ_前任)=396 nm，用Mito-HE孵育状态III下呼吸的大鼠心脏线粒体(图3). 当氧气浓度接近缓冲液的饱和极限（≈230μM）时，线粒体以0.23 nmol O的速率氧化了线粒体HE₂^•−·最小值⁻¹·mg蛋白质⁻¹，同时消耗190 nmol O atm·min⁻¹·mg蛋白质⁻¹这相当于产生O的总电子通量的0.1%₂^•−形成。由于线粒体消耗的氧气浓度小于100μM，内源性超氧物的形成不再可见。抗霉素刺激O₂^•−综合体III生产至0.81 nmol O₂^•−·最小值⁻¹·mg蛋白质⁻¹在λ处测量_前任=396纳米(图3d日). 在λ处，抗霉素刺激荧光的速率加快了31%_前任=510纳米(图3e（电子）)，与λ相比_前任=396纳米(图3d日). 因为HO-Mito-Etd⁺λ处荧光较少_前任=510nm，31%的速率加快表明抗霉素一定增加了Mito-Etd的形成⁺除了HO-Mito-Etd⁺两个激发波长的荧光发射比率可用于评估非特异性氧化与O介导的氧化₂^•−.

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图2。

线粒体HE被分离的线粒体吸收，吸收方式取决于线粒体膜电位，也取决于线粒体对膜的吸附。使用离子选择电极测量线粒体悬浮液中的Mito-HE浓度。将线粒体HE（连续五次添加1μM；箭头）添加到通电的线粒体中，并测量线粒体对线粒体HE的摄取，作为游离线粒体HE含量的减少。添加解偶联剂三氟甲氧基苯腙（0.5μM）以诱导线粒体解偶联和线粒体HE释放（测量为游离线粒体HE的增加）。在一，将线粒体前的线粒体HE添加到小室中，以评估非潜在依赖性线粒体关联的程度。在b条，线粒体在添加Mito-HE之前存在于培养箱中。

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图3。

线粒体与线粒体HE孵育后的荧光发射。为了清晰起见，每条迹线都均匀地绘制在前一条迹线的上方，并且根据前60秒的近似线性斜率计算Mito-HE氧化速率(一)无线粒体培养的线粒体HE（0.8μM）在λ_前任=396 nm，即使添加15μM抗霉素（箭头所示）。(b条)荧光使用λ_前任=396 nm线粒体在状态III下呼吸，含0.8μM Mito-HE。(c（c）)荧光使用λ_前任=510 nm线粒体在状态III下用0.8μM Mito-HE呼吸。(d日)与相同b条带有λ_前任=396 nm，添加15μM抗霉素（箭头所示）。(e（电子）)与相同d日，λ除外_前任=510纳米。(（f）)没有线粒体的线粒体HE（0.8μM）被黄嘌呤/黄嘌呤-氧化酶氧化（产生7.2 nM O）₂^•−每秒）。绘制的曲线表示每个实验的3到10个重复。乙醇本身没有影响。

这两个激发波长可以适应更具选择性的成像O₂^•−在活细胞中。共焦显微镜上可用的标准激光器可以激发405和514 nm的荧光团，这两个波长足够近，可以代替396和510 nm。培养的少突胶质细胞经Mito-HE孵育后，405-nm激发时荧光更强烈，但与514-nm激发时的荧光性质相似(图4a–d). 荧光与线粒体共定位，如MitoTracker深红色所示（Invitrogen；数据未显示）。抗霉素治疗增加了两个激发波长的荧光，支持对超氧化物的依赖性(图4 e–h). 我们用共焦显微镜观察了在五种不同类型的原代细胞培养物中添加超氧化物产生剂，如抗霉素、百草枯和甲萘醌（未显示）后，两种激发物的线粒体局部荧光增强。这种方法也可以适用于宽视野显微镜，也可以使用自定义滤波器组（图10，作为PNAS网站上的支持信息发布）。

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图4。

使用两种不同的激发波长405（蓝色）和514 nm（红色），用Mito-HE培养的少突胶质细胞的荧光。设置仪器参数并保持恒定，以最小化405nm处的自荧光，这通常大于514nm处的自动荧光。使用λ与0.1μM Mito-HE孵育15分钟后的少突胶质细胞_前任=405纳米(一)然后40分钟后(b条). 使用λ的相同少突胶质细胞_前任=514纳米(c（c）和d日). 15μM抗霉素在λ处增强少突胶质细胞的荧光_前任=405纳米(e（电子）)40分钟后(（f）). 使用λ也观察到抗霉素刺激的荧光增强_前任=514纳米(克和小时).

氧化机理。

当线粒体HE被黄嘌呤氧化酶氧化时，396/580 nm（λ_前任/λ_{相对长度单位})被铜、锌超氧化物歧化酶（SOD）抑制，但不被过氧化氢酶抑制（数据未显示）。氧氧化Mito-HE的速率常数₂^•−计算为3.9±0.3×10⁶M（M）⁻¹·秒⁻¹并且与是否在396/580 nm的激发/发射波长对处测量荧光无关（HO-Mito-Etd选择性⁺)，300/598 nm（选择性用于Mito-Etd⁺)，或510/580nm（这激发了两种产物）。这与O竞争中的速率限制步骤一致₂^•−是Mito-HE最初氧化成自由基。

纯化O的核磁共振谱₂^•−氧化的Mito-HE（图11，作为PNAS网站上的支持信息发布）表明O₂^•−产品失去了两个质子，H11和H2或H9，这与HO-Mito-Etd的拟议结构一致⁺O的质谱分析₂^•−-氧化的Mito-HE样品在米/z（z）=316.0和630.5(图5)被鉴定为Mito-Etd⁺与Mito-Etd的质谱进行比较⁺标准（图12，作为PNAS网站上的支持信息发布）。Mito-Etd公司⁺可以污染Mito-HE溶液，以及少量的Mito-Etd⁺也可以通过黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶氧化生成（图8）。质谱支持HO-Mito-Etd结构⁺揭示了一个双电荷物种米/z（z）= 324.0 (图5)与HO-Mito-Etd的计算质量一致⁺，647.79个原子质量单位。因为HO-Mito-Etd⁺是双电荷的，在米/z（z）= 646.4 (图5). 通过将米/z（z）646.4至脱质子化形式的HO-Mito-Etd⁺，O=Mito-Etd⁺(图5). 碰撞诱导的母离子碎裂米/z（z）646.4支持O=Mito-Etd的拟议结构⁺（图13，作为支持信息发布在PNAS网站上）。

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图5。

采用电喷雾离子化和离子阱质谱法对黄嘌呤/黄嘌呤·氧化酶氧化的线粒体HE进行了分析。离子位于米/z（z）=316.0和630.5被确定为Mito-Etd⁺.双电荷离子米/z（z）=324.0对应于HO Mito-Etd的假设结构的分子量⁺.单电荷离子米/z（z）=646.0导致羰基结构的提出，O=Mito-Etd⁺.

确定脱质子化可能发生的程度体内，我们确定了pK_一HO-Mito-Etd的⁺用396/579nm（λ_前任/λ_{相对长度单位})pH值在1到12之间。使用Henderson–Hasselbalch方程对数据进行拟合，得出两个pK_一2.1和10.4秒(图6). 第三个pK_一使用λ处的荧光测定为0.65_前任=396 nm和λ_{相对长度单位}=795 nm，在酸性pH下最大（数据未显示）。pK_一0.65和2.1的s分别分配给菲咯啶环的8-和3-铵基团，这与之前测定的pK一致_一Etd的s⁺、0.8和2.0(22). pK_一对于芳香羟基，在10.4处是一致的。此外，HO-Mito-Etd的荧光发射⁺在生理范围内最大且与pH无关(图6).

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图6。

HO-Mito-Etd的荧光发射⁺存在0.17μg DNA作为pH（λ）的函数_前任=396纳米；λ_{相对长度单位}=579 nm）。拟合此曲线以找到两个pK_一第2.1和10.5秒，第三pK_一用λ绘制795nm处的荧光发射，确定为0.65_前任=396 nm（未显示）。HO-Mito-Etd的荧光⁺最大值，在生理范围内与pH无关。

讨论

细胞内O的测量₂^•−由于缺乏一种足以与内源性SOD竞争且对O有选择性的检测方法，这一代受到了阻碍₂^•−.赵等。(20)已经表明检测O的特异性₂^•−如果将羟基化产物与Etd区分开来，HE可以大大提高⁺采用高效液相色谱法。然而，发射光谱的重叠使得荧光显微镜很难分离这两种产物(20,21). 在本研究中，我们发现了一种验证O选择性的简单方法₂^•−通过比较两种不同激发波长下的荧光，用HE或Mito-HE进行检测。396 nm的激发允许对O产生的羟基化产物进行更选择性的成像₂^•−并且比当前510纳米激发的实践具有更高的灵敏度(图1). HO-Mito-Etd公司⁺在分离的线粒体和培养的细胞中使用396-nm激发检测到，并且荧光随着增加O₂^•−形成，如抗霉素。然而，在510 nm与396 nm激发下，抗霉素刺激的线粒体产生荧光的速率比396 nm高31%，这表明Mito-Etd⁺由非过氧化依赖性途径形成，O₂^•−510-nm激发过高估计了形成。因此，使用两种激发波长监测荧光可以提高区分O的选择性₂^•−来自其他细胞氧化过程。

1934年，鲍林和诺伊曼基于KO的特殊化学键提出了超氧物的名称₂(23,24). 然而，在生理条件下，超氧物通常表现为温和的还原剂，而不是“超级”氧化剂。O对菲咯烷部分的初始氧化₂^•−被认为会生成一个自由基中间体(14,19,20,25)是O反应最快的物质之一₂^•−有机分子；HE的速率常数在此估计为2×10⁶M（M）⁻¹·秒⁻¹Mito-HE的氧化速度是前者的两倍。该速率比O速率慢≈500倍₂^•−通过SOD清除。然而，Mito-HE自由基与O的第二次反应₂^•−将涉及自由基-自由基耦合以生成过氧化氢中间体，并应接近扩散极限（>10⁹M（M）⁻¹·秒⁻¹). 因此，Mito HE自由基可以有效地竞争O₂^•−带SOD体内生产HO-Mito-Etd⁺过氧化氢中间体可以自发重排，失去水分子，生成羟基化产物(图7). 羟基化似乎对O相对特定₂^•−因为其他常见的生物氧化剂只产生O产生的荧光信号的一小部分₂^•−（表1）。尽管理论上羟基自由基可以添加到自由基中产生羟基化产物，但羟基自由基是一种混杂的氧化剂，更可能与细胞中的许多其他有机分子反应(26).

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图7。

Mito-HE氧化的拟议方案[R=（CH₂)₆P（P）⁺（哲学博士）_三]或HE（R=CH₂中国_三)按O₂^•−自由基中间体显示为阳离子（HE·⁺)，但也可以是中性根（Etd·）。

大多数荧光探针用于成像细胞中的氧化剂，包括还原形式的荧光素、罗丹明和Etd⁺，发光时容易通过自由基中间体自动氧化(19). 这些探针还可以被多种细胞内过氧化物酶、氧化酶或细胞色素氧化，生成自由基中间体，使其歧化，产生荧光产物(12,16–18). 因此，双电子荧光产物的检测提供了一种相当非选择性的氧化应激检测，但通常用作超氧化物指示剂。矛盾的是，通过这些替代氧化机制氧化HE可以增强O₂^•−通过产生更多的HE自由基进行检测，这增加了捕获O的概率₂^•−形成HO-Etd⁺.

HO-Etd的检测⁺通常是细胞内O的半定量分析₂^•−，因为O的相对分数₂^•−与SOD反应未知。第二个令人困惑的变量可能是内源性一氧化氮生成与O竞争₂^•−可能需要通过一氧化氮合酶抑制剂来抑制O₂^•−以便可检测。另一方面，我们发现添加外源性一氧化氮供体可以抑制Mito-HE的氧化（未显示），并可用于控制O的选择性₂^•−.

线粒体HE的积累取决于线粒体膜电位，膜电位每增加60-mV，摄取量增加约10倍(9). 线粒体膜电位通常在−140至−170 mV的范围内，线粒体中的线粒体HE浓度可能是培养基的1000倍。如此高的线粒体内浓度应能使Mito-HE与锰SOD竞争O₂^•−然而，过多的线粒体HE积累可能会对线粒体产生压力，并增强其对抑制剂或其他线粒体靶向分子的敏感性。可在与Mito-HE孵育结束时添加电位探针，以评估线粒体的整体完整性。

使用Etd时需要仔细优化条件⁺-基于探测，并且必须考虑几个注意事项。线粒体去极化可能降低O的效率₂^•−由于Mito-HE摄取减少导致的检测。线粒体HE本身，即使在低浓度（1至10μM）下，也可能破坏膜电位或增加线粒体通透性。我们观察到线粒体的荧光迅速消失，然后在与低至2μM的线粒体HE孵育后重新分布到细胞核。Mito-HE的最佳浓度应根据经验确定每种细胞类型，并根据我们的经验从0.1μM到2.5μM不等。因为DNA是增强HO-Mito-Etd荧光所必需的⁺，荧光可能受到线粒体DNA数量的限制，特别是在rho-无细胞或线粒体DNA已被删除的其他病理条件下。荧光强度可能因光氧化而人为增加。通过使用尽可能低的Mito-HE浓度和减少整个实验过程中的光照，可以将光氧化降至最低。使用405-nm激发时，细胞的自体荧光也会更高，因此应在显微镜实验中加以控制。

由于HE和Mito-HE根据膜电位在细胞内积累到不同程度，因此不能直接比较两种探针之间荧光强度的差异来评估O₂^•−两个隔室之间的生产。可能需要更高浓度的HE才能达到与线粒体中线粒体HE浓度相似的细胞溶质浓度。此外，HE可能会被线粒体生成的O氧化₂^•−.需要选择性抑制剂来揭示O的来源₂^•−.使用荧光显微镜准确定量产品充满困难，因此HPLC方法(20,25)量化羟基化和非羟基化产物的相对数量应尽可能与荧光实验结合使用。如果Mito-HE细胞内氧化为Mito-Etd⁺应比HO-Mito-Etd大10至20倍⁺，396-nm激发的大多数荧光可能是由于Mito-Etd⁺然而，在396 nm和510 nm处监测氧化将揭示此潜在伪影。

总之，通过明智的条件选择和对这些探针局限性的认识，我们表明HE氧化为HO-Etd⁺和Mito-HE给HO-Mito-Etd⁺可以作为监测内源性O的动态变化的敏感指标₂^•−生成。

材料和方法

线粒体SOX红超氧化物指示剂（Mito-HE），Mito-Etd⁺HE和乙炔是从Invitrogen–Molecular Probes中获得的。通过HPLC（如下所述）确定Mito-HE的纯度，因为Mito-Etd⁺可能是Mito-HE中的污染物。如果Mito-Etd⁺污染≥10%，Mito-HE要么通过HPLC纯化，要么通过等摩尔量的NaBH减少₄（乙醇中50 nmol），通过添加120 nmol HCl使反应猝灭。重组人Cu，Zn SOD在大肠杆菌(27). 通过细胞色素的还原来测定黄嘌呤氧化酶的活性c（c）(Δε₅₅₀=21毫米⁻¹·厘米⁻¹) (28). 将Mito HE溶解在DMSO中至5 mM，并在−20°C的黑暗中储存最多3天。Mito-HE和所有乙炔衍生物都是致癌物质，应通过使用0.2体积的5%次磷酸和0.12体积的新鲜0.5 M亚硝酸钠稀释至≤0.5 mg/ml乙炔的反应溶液进行解毒，仔细混合并排出放出的氮气。二甲基亚砜会渗入手套和皮肤，使用时应小心。

使用C分离Mito-HE及其氧化产物₁₈反相高效液相色谱法[Supelco（Belleforte，PA）柱，15 cm×4.6 mm，5μM]和光电二极管阵列检测器。流动相为H₂O/CH公司_三CN在0.1%甲酸和0.1%三氟乙酸中，在40分钟内使用30%至35%有机物的线性梯度。1.0μM HO-Mito-Etd的荧光光谱⁺，米托·埃特⁺、HO-Etd⁺和Etd⁺在SLM Aminco（加利福尼亚州圣何塞）8100c荧光计上，通过使用样品在37°C下与1 mg/ml鲑鱼精子DNA孵育15分钟获得。HO-Mito-Etd的消光系数⁺和Mito-Etd⁺被确定为ε₄₇₈=9400万⁻¹·厘米⁻¹和ε₄₈₈=5.8亿⁻¹·厘米⁻¹，与HO-Etd报告的几乎相同⁺(29)和Etd⁺.

使用SpectraMAX（加利福尼亚州圣何塞）Gemini荧光计配备96 well平板读取器进行SOD竞争分析，并比较几种氧化剂氧化的Mito-HE的荧光发射。在100 mM磷酸钾缓冲液和100μM二乙烯三胺五乙酸（pH=7.4，37°C）中进行分析。为了确定速率常数，将荧光发射绘制为抑制分数的函数(（f）_我)通过添加SOD，如等式1.

O的速率₂^•−SOD清除(k个_秒)已确定为1.8×10⁹M（M）⁻¹·秒⁻¹(30).

超氧化物是由黄嘌呤氧化酶产生的，黄嘌呤·氧化酶悬浮液的添加量被调整为产生0.2 nM O₂^•−用细胞色素测定的0.5 mM黄嘌呤每秒c（c）减少。或者，10μM Mito-HE与五种100μM添加的过氧亚硝酸盐±25 mM碳酸氢铵与立即涡流、100μM过氧化氢或100μM次氯酸反应。通过使用黄嘌呤氧化酶、0.5 mM黄嘌呤和10μM Fe产生羟基自由基³⁺-EDTA公司。所有分析至少重复三次，并报告±标准偏差。

通过使用对三苯基膦阳离子的电极选择性来测定线粒体对Mito-HE的摄取(31,32). 将大鼠肝脏在250mM蔗糖/5mM Tris·HCl（pH 7.4）/1mM EGTA中匀浆，然后进行差速离心(33). 电极的构造如所述(31)，并相对于Ag/AgCl参考电极测量电压。通过将5×1μM还原的Mito-HE连续添加到30°C的搅拌恒温室中，对电极进行校准，其中包含3 ml KCl缓冲液（120 mM KCl/10 mM Hepes，pH 7.2/1 mM EGTA）和4μg/ml鱼藤酮±大鼠肝线粒体（0.5 mg/ml蛋白质）。线粒体用琥珀酸（10 mM）激发，随后用0.5μM羰基氰化物消散膜电位-第页-三氟甲氧基苯腙。Mito-HE与线粒体的结合被测量为培养基中Mito-HE浓度的降低。

为了测试分离线粒体中Mito-HE的荧光发射，按所述分离大鼠心脏线粒体(34,35). 用氧电极测试线粒体的耦合呼吸，用SLM Aminco 8100c荧光计（λ_前任=396510纳米；λ_{相对长度单位}=579 nm）10分钟。线粒体（每毫升600μg蛋白质）与10 mM琥珀酸盐/8.25μM鱼藤酮/2.5 mM ADP/0.8μM Mito-HE孵育，并在30°C下搅拌。呼吸缓冲液为225 mM甘露醇/75 mM蔗糖/10 mM KCl/10 mM Tris·Cl/5 mM KH₂人事军官₄/0.1%不含脂肪酸的BSA，pH=7.2。1分钟后加入抗霉素（15μM）以刺激O₂^•−生成。线粒体存在时荧光增强的速率转换为O的近似速率₂^•−通过与0.8-μM Mito-HE标准品进行比较，以已知速度氧化超氧化物（7.2 nM O₂^•−在50μg鲑鱼精子DNA存在的情况下，130μM黄嘌呤和2.5μl黄嘌呤氧化酶每秒产生。

据报道，初级少突胶质细胞培养物是从1日龄Sprague-Dawley大鼠幼崽中制备的(36). 将培养的细胞转移到蔡司（德国Oberkochen）LSM510共焦显微镜的加热阶段（37°C），保持5%CO不变₂使用405 nm或514 nm激光激发，用63×油浸物镜对活细胞成像。在整个实验中使用单一视野，并在用Mito-HE标记之前收集405-nm的可激发信号，以校正自身荧光。图像采集条件保持恒定，用于±抗霉素之间的比较。细胞与0.1μM Mito-HE孵育15分钟，清洗，并在补充的L15培养基中孵育(36). 添加Mito-HE后立即获取图像，此后每隔10分钟获取一次图像。在一些实验中，在Mito-HE培养后立即添加抗霉素（15μM）。HO-Mito-Etd共焦成像后⁺细胞与3.6 nM MitoTracker Deep Red（Invitrogen，Carlsbad，CA）孵育，以观察线粒体共定位和整体完整性。

为了确定氧化产物的化学结构，样品以正离子模式直接注入LC-Q经典离子阱质谱仪的电喷雾界面。流动相为25%10 mM醋酸铵和75%乙腈，流速为5μl/min。电源电压为2.72 kV，毛细管电压为32.7 V。

补充材料

致谢

缩写

脚注

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