TRAIL诱导的凋亡需要Bax依赖的线粒体释放Smac/DIABLO

摘要

导致凋亡的信号事件可分为两种不同的途径，涉及线粒体或死亡受体（有关综述，请参阅Ashkenazi和Dixit 1998;格林和里德1998). 在线粒体途径中，死亡信号导致线粒体膜通透性的变化，并随后释放参与细胞凋亡各个方面的促凋亡因子（综述见格林和里德1998). 释放的因子包括细胞色素c（c）（细胞）c（c）;Liu等人，1996年)凋亡诱导因子（AIF）；Susin等人，1999年)第二个线粒体衍生的半胱氨酸天冬氨酸酶激活物（Smac/DIABLO；Du等人，2000年;Verhagen等人，2000年)和核酸内切酶G(Li等人，2001年). 细胞质细胞c（c）形成凋亡复合体“凋亡小体”的重要组成部分，由细胞c（c）、Apaf-1和procaspase-9。凋亡体的形成导致胱天蛋白酶-9的激活，然后胱天蛋白酶处理并激活其他胱天蛋白酶，以协调细胞的生化执行。Smac/DIABLO也与细胞因子一起从线粒体释放c（c）在凋亡期间，它通过抑制IAP（凋亡抑制因子）家族蛋白促进caspase激活(Du等人，2000年;Verhagen等人，2000年).

IAP家族蛋白通过直接抑制caspase活性来负调控细胞凋亡。已发现六个人类IAP。它们通过直接抑制效应物caspase-3和/或caspase-7来阻止凋亡中央执行阶段的活动，从而调节凋亡(Deveraux等人，1997年,1998). 此外，它们通过直接抑制顶端caspase-9来阻止内源性caspase激活级联的启动。广泛表达的IAP成员XIAP的结构和生物化学分析表明，XIAP的保守BIR结构域介导其对胱天蛋白酶的抑制活性以及与Smac/DIABLO的蛋白-蛋白相互作用。Smac/DIABLO与XIAP的结合可拮抗caspase–XIAP相互作用，从而促进细胞凋亡（有关综述，请参阅Goyal 2001年). 最近的研究表明，XIAP在大多数人类癌细胞中高度表达，高水平的XIAP使肿瘤对化疗或放疗产生耐药性(Holcik等人，2000年;Sasaki等人，2000年).

线粒体介导的凋亡的关键调节蛋白是Bcl-2蛋白家族，它既可以像Bcl-2和Bcl-xl那样促进细胞存活，也可以像Bax和Bak那样诱导细胞死亡c（c）释放和线粒体介导的细胞死亡启动，而促凋亡蛋白Bax和Bak促进细胞凋亡c（c）线粒体释放(Shimizu等人，1999年). Bax与多种细胞类型在不同条件下的凋亡有关。最近，使用Bax缺陷的人结肠癌细胞的研究提供了直接证据，证明Bax在介导某些抗癌药物诱导的凋亡中起着关键作用(Zhang等人，2000年). Bax蛋白通过触发细胞发挥其至少部分活性c（c）从线粒体释放。Bax在健康细胞中以细胞溶质为主的潜伏形式存在，并在死亡信号刺激后转移到线粒体(Hsu等人，1997年). 越来越多的证据表明Bax易位是其促凋亡功能所必需的，调控Bax与线粒体膜的结合是凋亡信号转导的关键步骤(邓和吴2000).

在死亡受体途径中，凋亡事件由肿瘤坏死因子（TNF）家族受体启动，包括TNFR1、Fas、DR-3、DR-4和DR-5。当配体结合或在细胞中过度表达时，TNF受体家族成员聚集，导致一种称为FADD的适配器蛋白的招募。受体-FADD复合物随后招募procasase-8。这允许蛋白水解酶处理和激活受体相关的蛋白酶-8，从而启动后续级联的额外处理和下游效应半胱天冬酶的激活（有关综述，请参阅Nagata 1997年;Ashkenazi和Dixit 1998).

拖车/Apo2L(T型NF公司-第页兴高采烈的一爆裂-我舞蹈我配体TRAIL或Apo2配体）是TNF公司基因超家族(Wiley等人，1995年;Pitti等人，1996年). 与TNF-α和FasL不同，TRAIL似乎可以特异性杀伤转化细胞和癌细胞，同时保持正常细胞的完整性(法语和Tschopp 1999). 小鼠和非人类灵长类动物的临床前实验表明，给予TRAIL可抑制肿瘤生长，但无明显的系统性细胞毒性(Ashkenazi等人，1999年;Walczak等人，1999年). 因此，TRAIL是一种有前途的抗癌药物。TRAIL与四种细胞受体相互作用，在TNFR超家族中形成一个不同的亚群(Pan等人，1997年a,b条;Sheridan等人，1997年). 最近的实验表明，FADD和procaspase-8与内源性TRAIL受体DR4和DR5相关(Kischkel等人，2000年;Sprick等人，2000年;宫崎骏和里德2001). TRAIL诱导的细胞凋亡需要FADD和caspase-8(Bodmer等人，2000年). 因此，TRAIL/Apo2L和FasL似乎参与了类似的凋亡途径。

虽然凋亡的外源途径（通过死亡受体）和内源途径（通过线粒体）能够独立运行，但越来越多的证据表明，细胞中存在这两条途径之间的相互作用（有关综述，请参阅绿色1998). 死亡受体信号与线粒体途径之间的联系来自于一个BH3域亚家族蛋白Bid被活性半胱天冬酶-8裂解的发现。截短的Bid（tBid）易位到线粒体并触发细胞c（c）释放(Li等人，1998年;Luo等人，1998年). 有人建议tBid调节细胞c（c）通过诱导促凋亡家族成员Bak或Bax的同源异构化释放。缺乏Bax和Bak的细胞，但不是只缺乏其中一种成分的细胞，对tBid诱导的细胞完全耐药c（c）释放与凋亡(Wei等人，2001年).

Bid似乎将内在途径与细胞死亡受体介导的凋亡联系起来。然而，这种串话所需的确切线粒体事件尚不清楚。TRAIL诱导细胞凋亡的机制以及线粒体在细胞死亡受体途径中的作用也需要进一步研究。利用Bax功能缺陷的人结肠癌细胞，我们证明线粒体事件是TRAIL诱导凋亡所必需的。我们发现，这种需求的原因是XIAP对caspase级联的负调控。线粒体途径的激活导致Smac/DIABLO的释放，从而消除半胱氨酸蛋白酶激活的XIAP阻断。我们的结果进一步表明，Smac/DIABLO的释放，而不是细胞c（c）是介导线粒体途径对死亡受体介导的凋亡的贡献的关键事件。通过系统地研究单个遗传系统中线粒体和死亡受体途径中涉及的各种分子事件和分子，我们能够提出一种遗传途径，表明线粒体途径是死亡受体诱导凋亡所必需的。

结果

Bax的表达是TRAIL诱导人结肠癌细胞凋亡所必需的

作为探索线粒体事件参与TRAIL诱导凋亡的第一步，一个稳定的过度表达Bcl-xl（Bax）的细胞系^+/−/Bcl-xl）是通过将Bcl-x1表达质粒转染到Bax中而建立的^+/−细胞。Bax酒店^+/−细胞是HCT116人结肠癌细胞的衍生物，仅包含一个野生型等位基因行李基因。与对照组Bax比较^+/−/新细胞，Bax^+/−/Bcl-xl细胞表达的Bcl-xl水平大约高出五倍（图。​（图1A）。1A） ●●●●。TRAIL治疗诱导95%的对照Bax细胞凋亡^+/−/neo细胞，但TRAIL诱导的凋亡在Bax中被完全抑制^+/−/Bcl-xl电池（图。​（图1B）。1B） ●●●●。Bax暴露后未观察到细胞死亡^+/−/Bcl-xl细胞接受TRAIL治疗24小时（数据未显示）。凋亡的特征是DNA断裂、procaspase-3的裂解和caspase底物PARP（数据未显示）。Bcl-xl抑制TRAIL诱导的凋亡的能力表明，通过线粒体的死亡信号级联是TRAIL诱导癌细胞凋亡的重要组成部分。

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图1

Bax在TRAIL诱导细胞凋亡中的需求。(一)Bax中Bcl-xl表达的西方分析^+/−/Bcl-xl稳定细胞系与对照Bax^+/−/neo细胞系。使用全细胞提取物。以微管蛋白的表达作为对照。(B类)抑制TRAIL诱导Bax细胞凋亡^+/−/Bcl-xl细胞。用TRAIL处理细胞6h，用台盼蓝排除法测定细胞凋亡，用标准差绘制三个独立实验的数据。(C类)Bax表达的西方分析^+/−和Bax^−/−细胞。(D类)TRAIL处理Bax的形态学^+/−和Bax^−/−细胞。这张照片是在TRAIL治疗6小时后拍摄的。(E类)比较GFP–Bax稳定细胞系中GFP–Bax蛋白的表达^−/−Bax中Bax表达的细胞^+/−细胞。仅表达GFP的细胞作为阴性对照。对全细胞提取物进行分析。(F类)TRAIL诱导Bax细胞凋亡^−/−，巴克斯^+/−、GFP和GFP–Bax细胞。用TRAIL（100ng/mL）处理细胞6小时，通过台盼蓝排斥法测量细胞凋亡，并用标准偏差绘制来自三个独立实验的数据。

为了进一步研究线粒体在TRAIL诱导的凋亡中的作用，我们利用Bax敲除细胞系（Bax^−/−)源自Bax^+/−单元格依据Zhang等人（2000）Bax缺乏Bax表达^−/−细胞首先通过Western blot分析确认（图。​（图1C）。1C） ●●●●。Bax最多^+/−TRAIL处理6小时后，细胞发生凋亡，具有特征性的形态学变化，而在Bax中观察到很少的凋亡^−/−电池（图。​（图1D、F）。1D、 F）。Bax的处理^−/−TRAIL浓度高10倍的细胞在48小时内未导致显著的细胞死亡（数据未显示），这表明Bax是TRAIL诱导人结肠癌细胞凋亡所必需的。

测试是否恢复Bax在Bax中的表达^−/−细胞可以挽救TRAIL诱导的凋亡反应，Bax被重新导入Bax^−/−细胞。将在框架中表达与绿色荧光蛋白（GFP）融合的Bax蛋白的质粒转染到Bax中^−/−建立了表达GFP–Bax蛋白的稳定细胞系（GFP–Bax）。GFP–Bax融合蛋白保留野生型Bax功能(邓和吴2000). GFP–Bax在Bax中的异位表达^−/−细胞将Bax的表达恢复到与Bax相似的水平^+/−电池（图。​（图1E）。1E） ●●●●。就像父母的Bax^−/−细胞，表达GFP的对照Bax^−/−TRAIL治疗后，细胞（GFP）未出现细胞死亡（图。​（图1F）。1F） ●●●●。然而，Bax重组GFP–Bax细胞在TRAIL刺激后显示出明显的凋亡（图。​（图1F）。1F） ●●●●。这些结果有力地支持了Bax诱导的线粒体事件是TRAIL诱导人结肠癌细胞凋亡所必需的假说。

Bax的缺失对TRAIL诱导的caspase-8活化和Bid裂解没有影响，但抑制Smac/DIABLO和细胞c的线粒体释放

为了研究Bax缺乏是否影响TRAIL刺激后TRAIL介导的caspase激活，检测了procaspase-8裂解和随后的下游Bid裂解。首先通过Western blot分析Bax中的Caspase-8和Bid蛋白水平^+/−和Bax^−/−TRAIL刺激后的细胞。早在TRAIL治疗后1小时，就观察到procaspase-8的减少和相应的加工caspase-8的出现，并且几乎所有的procaspase 8在治疗4小时后都被裂解（图。​（图2A）。2A） ●●●●。观察到全长Bid蛋白水平相应降低，表明全长Bid蛋白质被激活的caspase-8裂解。更重要的是，两个Bax^+/−和Bax^−/−细胞显示出几乎相同的模式（图。​（图2A），2A） 这表明Bax的丢失并没有阻止TRAIL介导的caspase-8激活和随后的Bid裂解。

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图2

TRAIL治疗后Bax依赖性线粒体改变。(一)TRAIL激活caspase-8和caspase-9。如图所示，在TRAIL刺激后的不同时间制备全细胞提取物。采用Western blotting分析procasase-8、procasase-9和Bid的裂解情况。以Tubulin作为负荷对照。(B类)细胞色素免疫染色c（c）和Smac/DIABLO。培养箱载玻片上生长的细胞经TRAIL处理2 h，并用抗细胞因子染色c（c）或固定后的Smac抗体。Hoechst 3342对DNA进行了可视化。(C类)细胞亚细胞部分c（c）和Smac/DIABLO。在TRAIL处理前后对细胞进行亚细胞组分。细胞溶质部分接受西方分析。以胞浆β-肌动蛋白作为负载对照。(D类)细胞分布c（c）和Smac/DIABLO，激活Bax重建细胞中的caspase-9。TRAIL处理和未处理GFP-和GFP-Bax表达Bax的细胞溶胶提取物^−/−对细胞进行细胞分析c（c）Smac/DIABLO和caspase-9的裂解。Actin是加载控件。

Bax介导的事件之一是细胞释放c（c）从线粒体，然后是procaspase-9激活。在线粒体引发的凋亡过程中，Smac/DIABLO蛋白也从线粒体重新分布到细胞液中，与细胞凋亡同时发生c（c）重新定标(Du等人，2000年;Verhagen等人，2000年). 因此，我们研究Bax的丢失是否会阻断Smac/DIABLO和细胞c（c）TRAIL信号通路中的释放和procaspase-9激活。Smac/DIABLO和细胞免疫染色c（c）在细胞核周围显示出明亮的染色模式，代表Bax中典型的线粒体定位^+/−和Bax^−/−TRAIL治疗前的细胞（图。​（图2B）。2B） ●●●●。TRAIL刺激诱导细胞明显重新分布c（c）Bax中的Smac/DIABLO^+/−细胞。染色模式在大多数细胞中扩散，表明蛋白质被释放到胞浆中（图。​（图2B）。2B） ●●●●。相反，细胞c（c）Bax中的Smac/DIABLO染色^−/−TRAIL处理后细胞保持不变（图。​（图2B）。2B） ●●●●。细胞亚细胞组分分析c（c）Smac/DIABLO蛋白进一步支持免疫染色结果。细胞c（c）和Smac/DIABLO蛋白在Bax中的可溶性细胞溶质部分被检测到，以响应TRAIL处理^+/−Bax中未观察到细胞和蛋白质重定位^−/−电池（图。​（图2C），2C） 表明Bax的丢失抑制了细胞线粒体的释放c（c）和Smac/DIALO响应TRAIL。

细胞c（c）是Apaf-1依赖性caspase-9激活的辅因子(Li等人，1997年). 为了研究Bax的丢失是否导致TRAIL信号通路中caspase-9激活的抑制^+/−和Bax^−/−用TRAIL处理细胞，用抗caspase-9抗体免疫印迹细胞裂解物。Bax中出现裂解的胱天蛋白酶-9^+/−TRAIL处理2h后细胞数量减少，而procaspase-9在TRAIL暴露4h后消失。相反，Bax中不存在procaspase-9裂解^−/−电池（图。​（图2A）。2A） ●●●●。Bax中未观察到procaspase-9裂解^−/−即使在TRAIL治疗24小时后，细胞仍然存在（数据未显示）。与该细胞的发现一致c（c）这些细胞中没有释放，数据表明，对TRAIL反应的procaspase-9激活被Bax的丢失所抑制。在GFP–Bax细胞中也获得了类似的结果，其中GFP–Bax的表达恢复了细胞释放c（c）以及来自线粒体的Smac/DIABLO和TRAIL处理后的procaspase-9激活（图。​（图2D），2D） ，但对caspase-8处理和Bid裂解没有影响（数据未显示）。这些结果表明，TRAIL以Bax依赖的方式激活线粒体途径。

Bax易位是TRAIL介导的细胞凋亡所必需的

为了探讨Bax易位是否参与TRAIL介导的细胞凋亡^+/−用TRAIL处理细胞，用亚细胞组分和Western blots检测Bax定位。Bax蛋白在TRAIL治疗前位于细胞液中，在TRAIL处理后重新分布到线粒体（图。​（图3A），三A） 表明TRAIL诱导Bax易位。在GFP–Bax细胞中也观察到Bax的重新分布。GFP荧光表明，在TRAIL治疗后，GFP–Bax从弥漫的细胞溶质模式变为代表典型线粒体染色的点状染色模式，而对照GFP细胞中的GFP荧光没有这种变化（图。​（图3C）。三C） ●●●●。为了进一步研究Bax易位在TRAIL诱导的细胞死亡中的需求，一个突变的Bax在其C端缺失21个氨基酸(BaxΔC21)作为GFP融合蛋白生成。含有线粒体跨膜结构域的C末端21氨基酸是凋亡期间Bax移位所必需的，并且BaxΔC21据报道保留的凋亡潜能(Jurgensmeier等人，1998年). 建立了表达GFP–BaxΔC21蛋白的细胞系（图。​（图3B）。三B） ●●●●。与GFP–Bax细胞相比，向GFP–BaxΔC21表达细胞中添加TRAIL既不会导致Bax重新分布，也不会导致细胞死亡，正如缺乏caspase底物PARP裂解所示（图。​（图3C、D），三C、 D），而GFP–BaxΔC21细胞中的caspase-8处理和Bid裂解保持不变（数据未显示）。这些结果表明，TRAIL诱导的细胞凋亡需要Bax从胞质溶胶转移到线粒体。

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图3

在TRAIL诱导的细胞凋亡中Bax易位的需要。(一)TRAIL治疗后Bax分布的变化。Bax公司^+/−用TRAIL处理细胞，从细胞液和线粒体提取物中检测Bax蛋白。细胞溶胶特异性β-肌动蛋白和线粒体特异性细胞色素c（c）氧化酶亚基IV（coxIV）被用作负荷对照。(B类)GFP–BaxΔC21蛋白在GFP–BaxΔC2 1稳定细胞系中的表达。使用全细胞提取物。(C类)TRAIL刺激后Bax分布发生变化。(D类)GFP–BaxΔC21细胞对TRAIL诱导的凋亡的抵抗。通过Western blots检测C-PARP检测细胞凋亡。

随后检测caspase-8和tBid在TRAIL诱导的Bax易位中的作用。添加caspase-8抑制剂强烈抑制TRAIL诱导的GFP–Bax移位和细胞死亡（数据未显示），表明Bax移位依赖于TRAIL介导的细胞死亡途径中caspase-9的激活。为了探讨tBid在TRAIL诱导的癌细胞死亡途径中的作用，并测试tBid诱导的细胞死亡是否需要Bax，我们将表达tBid蛋白的质粒转染到Bax中^+/−和Bax^−/−细胞。tBid的表达仅在Bax中诱导显著的细胞凋亡^+/−细胞（数据未显示），表明Bax是tBid诱导的细胞死亡所必需的。tBid的表达导致Bax从细胞质重新分布到线粒体（数据未显示），表明tBid表达导致Bax易位。

Bax缺乏可阻止caspase-3的完整加工、激活和底物裂解

Caspase-3是一种下游效应器Caspase，可被Caspase-8和Caspase-9激活(Li等人，1997年;Kuida等人，1998年;Stennicke等人，1998年). 因为Bax的丢失优先阻断了procaspase-9的裂解，并且对TRAIL介导的凋亡中caspase-8的激活没有影响（图。​（图2A），2A） ，我们继续确定caspase-3的激活是否也受到抑制。先前的研究表明，procaspase-3的加工涉及一个初始的分裂，产生一个p12小亚基和一个p24部分加工的大亚基。p24大亚基通过自动催化去除其N末端原结构域进一步处理，以生成p20或p17多肽(Martin等人，1996年). 为了评估caspase-3的加工和激活状态，Bax^+/−和Bax^−/−用TRAIL处理细胞，用抗caspase-3抗体对提取物进行免疫印迹。Bax的TRAIL处理^+/−癌细胞导致procaspase-3水平降低，并出现三种裂解产物：p24、p20和p17（所用抗体不识别p12；图。​图4A）。4A） ●●●●。尽管Bax^−/−与Bax类似，经TRAIL治疗后，癌细胞的procaspase-3水平也下降^+/−细胞，主要的分裂产物是p24片段，即使在TRAIL处理24小时后也检测到少量成熟的p20和p17形式（图。​（图4A）。4A） ●●●●。这些结果表明，Bax的丢失仅阻断了caspase-3 p24亚基的自催化过程，而对激活的caspase-8对caspase-2的初始裂解没有影响。

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图4

caspase-3、XIAP和Smac/DIABLO之间的蛋白质相互作用，以及体内caspase-2的处理。(一)Bax中蛋白酶-3的裂解^+/−和Bax^−/−TRAIL处理4 h（+）和24 h后的细胞。在Western blots上分析全细胞提取物中的procaspase-3、裂解caspase-2（p24、p20、p17）和C-PARP。(B类)XIAP免疫沉淀。用TRAIL处理细胞4h（用a+表示）或2h。细胞溶胶提取物用抗XIAP抗体免疫沉淀，并用抗caspase-3抗体印迹。随后剥离膜并进行印迹以进行XIAP。(C类)Smac/DIABLO和XIAP相互作用。用TRAIL处理4 h的细胞和全细胞提取物在Western blots（WB）上检测Smac/DIABLO和XIAP蛋白的表达。用抗XIAP和Smac/DIABLO抗体免疫沉淀细胞溶胶提取物，并分别对Smac/DAIBLO和XIAP进行印迹。

由于Bax的缺失允许半胱天冬酶-3部分加工成p24，但不加工成p20/p17，我们研究了这种部分加工对其体内活性是否足够。通过检测其内源性底物PARP在Western blots上的裂解来测定Caspase-3活性。Bax的TRAIL处理^+/−细胞4小时后出现85-kD PARP裂解产物（C-PARP），而Bax中未检测到C-PARP^−/−即使在TRAIL治疗24小时后（图。​（图4A）。4A） ●●●●。这些结果表明，p24多肽在体内没有活性，需要随后的切割事件来去除原结构域以生成p20/p17，才能使caspase-3活性。因此，Bax缺乏通过阻止半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3原结构域的移除来抑制PARP的切割。

通过Smac/DIABLO的胞浆表达拯救Bax缺乏细胞对TRAIL的敏感性

我们已经证明TRAIL诱导细胞释放c（c）从线粒体和procaspase-9的后续处理（图。​（图2）。2). 成熟的caspase-9反过来可以激活其主要下游靶点procasase-3。因此，我们使用半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9抑制剂Z-LEHD-FMK测试了在体内TRAIL刺激期间是否需要成熟的半胱氨酸蛋白酶-9来激活半胱氨酸水解酶-3。添加Z-LEHD-FMK并不能阻止Bax中caspase-3的切割和凋亡细胞的死亡^+/−TRAIL治疗后的癌细胞，但强烈抑制procaspase-9的分裂和激活（图。​（图5A）。5A） ●●●●。为了进一步排除caspase-9在TRAIL诱导的细胞凋亡中的作用，caspase-8（Casp9DN；Fearnhead等人，1998年)转染Bax^+/−细胞以及GFP标记物。Casp 9DN的表达抑制了裂解caspase-9的生成（图。​（图5B），5B） 但对TRAIL处理后caspase-3的处理和细胞死亡没有影响（图。​（图5C；5C类；数据未显示）。这些结果表明细胞c（c）TRAIL诱导的细胞凋亡并不需要释放和随后的caspase-9激活，这一过程还涉及其他因素。

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图5

抑制caspase-9对caspase-3的处理和TRAIL介导的凋亡没有影响。(一)Bax公司^+/−用TRAIL或除TRAIL外的胱天蛋白酶9抑制剂（Casp 9Ih）处理细胞4小时。通过Western印迹分析全细胞提取物的胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶3和C-PARP。(B类)casp 9DN的表达阻断了procasase-9的裂解。Bax公司^+/−细胞被转染显性阴性容器9DNDNA或载体控制以及GFP表达质粒。基于GFP荧光，90%以上的细胞被转染。转染后48小时用TRAIL处理细胞4小时。Casp 9DN蛋白由抗Flag抗体检测，处理后的caspase-9由只识别裂解的caspase 9的抗体检测。肌动蛋白被用作负载控制。(C类)Casp 9DN对TRAIL诱导的细胞凋亡无影响。将圆形凋亡的GFP阳性细胞计数在三份平板上，并绘制数据。

Smac/DIABLO是作为239-氨基酸前体分子合成的。N端55个残基含有线粒体靶向序列（MTS），导入线粒体后被去除。Smac的成熟和功能形式含有184个氨基酸(Du等人，2000年). 当全长Smac/DIABLO公司cDNA转染Bax^−/−细胞，它没有恢复TRAIL诱导的凋亡，如缺乏PARP裂解所示（图。​（图6A）。6A） ●●●●。亚细胞组分分析表明，转染的Smac/DIABLO定位于线粒体，并在TRAIL处理后仍存在（图。​（图6A），6A） 与Bax的丢失在TRAIL信号传导期间抑制Smac/DIABLO释放这一事实一致。Bax公司^+/−转染Smac/DIABLO的细胞在TRAIL治疗后重新分配到细胞液中（图。​（图6A）。6A） ●●●●。

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图6

TRAIL诱导细胞凋亡的抢救。(一)全长的表达Smac/DIABLO公司cDNA。Bax公司^+/−/Smac和Bax^−/−/Smac细胞表达来源于Bax的全长Smac/DIABLO（C末端标记的Flag）^+/−和Bax^−/−单元格。用TRAIL处理4 h。制备线粒体和胞浆提取物。用抗Flag抗体检测转染Smac/DIABLO，用C-PARP检测细胞凋亡。(B类)Smac/DIABLO成熟活性形式在Bax细胞液中的表达^−/−细胞。表达GFP或GFP-Smac的稳定细胞系来源于Bax^−/−用TRAIL处理细胞4h，分别用抗GFP抗体和Smac/DIABLO抗体分析细胞液提取物中GFP、GFP–Smac和Smac/DIABLO的表达。抗caspase-3和C-PARP抗体检测caspase-2的加工和激活。肌动蛋白作为负荷控制。(C类)GFP和GFP-Smac细胞凋亡的定量。用台盼蓝排斥法检测细胞凋亡；数据代表三个独立的实验。(D类)GFP–Smac表达细胞中Smac/DIABLO–XIAP复合物的检测。中所述的细胞质提取物B类用抗XIAP或抗Smac/DIABLO抗体进行免疫沉淀，并分别对Smac/DAIBLO或XIAP进行印迹。

研究表明，修饰成熟Smac/DIALO的N末端导致XIAP结合功能缺陷(Chai等人，2000年;Srinivasula等人，2001年). 为了生成功能活跃的细胞溶质Smac/DIABLO蛋白，我们构建了Smac/DAIBLO表达构建物，其中细胞溶质成熟的Smac/DIA BLO（缺失的MTS）与GFP蛋白融合。在GFP和成熟Smac/DIABLO之间引入了一个caspase-8裂解位点（IETD），在TRAIL治疗期间，在caspase-8裂解后，可以在胞浆中产生真正成熟的Smac/DAIBLO。一种类似的结构被证明可以增强不同系统中的细胞凋亡(Srinivasula等人，2000年). 该质粒转染Bax^−/−建立了稳定表达GFP–Smac的细胞系。正如预期的那样，Western blot分析表明，在TRAIL处理后，GFP–Smac融合蛋白被激活的caspase-8生成并裂解为GFP和成熟Smac蛋白（图。​（图6B）。6B） ●●●●。更重要的是，GFP–Smac的表达完全恢复了Bax中底物PARP裂解所指示的caspase-3的处理、激活和凋亡细胞死亡^−/−TRAIL处理后的细胞（图。​（图6B、C）。6B、 C）。在TRAIL治疗后的GFP–Smac细胞中也很容易观察到Smac/DIABLO和XIAP之间的蛋白-蛋白质相互作用（图。​（图6D）。6D） ●●●●。细胞溶质Smac/DIABLO拯救TRAIL诱导Bax细胞凋亡的能力^−/−细胞进一步支持XIAP–caspase-3在Bax中的相互作用^−/−细胞阻断TRAIL诱导的细胞死亡途径，线粒体释放Smac/DIABLO是消除XIAP抑制并允许凋亡继续进行的必要条件。

讨论

众所周知，通过线粒体介导的凋亡和通过细胞死亡受体介导的细胞凋亡通过激活不同的下游靶点表现出不同的途径。虽然这两个过程都会导致共同效应器半胱天冬酶的激活，但激活步骤是通过不同的机制实现的。在细胞死亡受体途径中，效应器caspase由caspase-8激活，caspase 8通过适配器蛋白被死亡受体直接激活（有关综述，请参阅Ashkenazi和Dixit 1998). 然而，线粒体介导的细胞凋亡通过释放细胞因子激活效应胱天蛋白酶c（c）来自线粒体，随后激活caspase-9（有关综述，请参阅格林和里德1998). 因此，通过死亡受体的凋亡似乎不需要线粒体的参与，而Bcl-2/Bcl-xl应该对死亡受体诱导的凋亡没有影响。在一些研究中似乎就是这样。然而，最近的报道坚持认为Bcl-2/Bcl-xl可以抑制死亡受体触发的凋亡，这导致了有争议的观点，即存在两种不同的细胞类型。在I型细胞中，细胞死亡受体信号不被Bcl-2阻断，而在II型细胞中则被阻断(Scaffidi等人，1998年). 有人提出，在II型细胞中，死亡受体对caspase-8的激活不足以诱导细胞凋亡，但线粒体介导的caspase激活需要增强caspase-8裂解和细胞死亡。

我们已经证明，TRAIL经历了caspase-8依赖性细胞死亡级联反应，这与TRAIL诱导的凋亡是由Fas受体（CD95）信号通路共享的共同细胞死亡受体途径介导的观点一致。然而，TRAIL诱导的癌细胞死亡似乎具有I型和II型细胞的特征。首先，我们观察到Bcl-xl可以阻断TRAIL诱导的癌细胞死亡，并进一步证明线粒体途径通过细胞死亡受体介导的凋亡参与TRAIL，这是II型细胞的特征。我们还注意到，Bax的丢失并不影响TRAIL诱导的caspase-8激活，caspase-9激活是线粒体信号通路的上游，这是I型细胞的特征。最重要的是，我们已经证明，线粒体细胞死亡事件是由TRAIL刺激以Bax依赖的方式激活的，Bax的表达使Bax缺陷细胞恢复为TRAIL诱导的凋亡。这些结果表明，Bax介导的线粒体途径是TRAIL诱导人类癌细胞凋亡所必需的。

在编写这份手稿的同时，另一组研究人员也观察到Bax在TRAIL诱导的癌细胞死亡中的重要作用；然而，这一要求的机制没有得到解决(Burns和El-Deiry 2001). 除了TRAIL，我们还发现Bax的缺失完全可以防止Fas诱导的结肠癌细胞死亡，并且Bax在Bax中的重新表达^−/−细胞可以挽救Fas诱导的细胞死亡（Deng等人，unpubl.）。这些结果表明Bax诱导的线粒体事件也是Fas介导的凋亡所必需的。TNF-α不仅激活FADD–caspase-8凋亡通路，还诱导TRAF2–NF-κB抗凋亡通路，该通路上调抗凋亡基因，如IAP(Wang等人，1998年). 因此，TNF-α诱导的细胞死亡需要通过抑制蛋白质合成等方法抑制NF-κB信号传导。我们观察到Bax^−/−细胞对TNF-α和蛋白合成抑制剂诱导的凋亡敏感（数据未显示），这可能是由IAP通过抑制NF-κB信号下调引起的，从而绕过了Bax介导的线粒体事件的要求。

已有研究表明，TNF-α和Fas通过caspase-8介导的Bid裂解激活线粒体级联(Li等人，1998年;Luo等人，1998年). 我们的结果表明，TRAIL通过相同的途径激活线粒体，表明这些分子通过caspase-8和tBid介导的共同机制激活线粒体引发的凋亡。最近的实验表明，Bak和Bax在tBid诱导的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs；Wei等人，2000年,2001). 我们通过Western blots检测了Bak的表达，发现在结肠癌细胞中Bak蛋白低于检测水平（数据未显示）。因此，Bak在tBid诱导Bax癌细胞死亡中可能具有与Bax相似的功能^−/−细胞。我们进一步证明，tBid诱导Bax从细胞质转运到线粒体，这是caspase-8–tBid介导凋亡所需的额外步骤。Bax易位突变体的数据BaxΔC21强烈支持Bax易位是Bax发挥作用所必需的观点。

对Bax在TRAIL通路中的作用的分析表明，caspase-8激活和线粒体信号传递之间的合作是体内caspase-3完整加工和激活所必需的。Bax的缺失导致胱天蛋白酶-3的不完全处理，而胱天蛋白酶-8的激活在TRAIL信号传导过程中不受影响。先前的体外研究表明，caspase-8可以通过两个不同的切割事件直接将procaspase-3加工成活性形式。第一步是通过激活的半胱天冬酶-8在IETD位点裂解前蛋白酶-3，生成中间产物p24（带原结构域的大亚基）和p12（小亚基）。需要第二个高压蒸煮过程来去除p24的原域，以生成大的亚单位p20/p17(Martin等人，1996年). 我们的体内数据似乎符合体外caspase-3激活模型。然而，与体外研究不同的是，第二次卵裂是自发进行的(Deveraux等人，1998年)，我们的结果表明，体内原结构域的去除取决于XIAP抑制的去除。最近的研究表明，在TNF-α诱导的细胞凋亡中，caspase-8和caspase-9的协同作用是caspase-3完整加工和激活的必要条件(佩雷斯和怀特2000). 然而，我们已经证明，在TRAIL处理的Bax中，抑制caspase-9并不阻止caspase-3的处理和激活^+/−提示在TRAIL信号传导过程中，caspase-9对caspase-3的完整处理和激活不是必需的。我们进一步观察到，通过XIAP和部分处理的caspase-3 p24之间的相互作用，XIAP阻断了癌细胞中caspase-8对caspase-2的激活。这些数据表明，在TRAIL介导的细胞死亡途径中，激活caspase-8是必要的，但不足以完成caspase-3的加工和激活。

Smac/DIABLO是一种线粒体因子，通过消除XIAP对半胱氨酸蛋白酶的抑制作用而参与细胞凋亡。Smac/DIABLO的功能主要由体外和过度表达研究确定(Du等人，2000年;Verhagen等人，2000年;Ekert等人，2001年). 在本研究中，我们发现Bax诱导的线粒体释放Smac/DIABLO，而不是细胞c（c）在TRAIL刺激后，需要在生理水平上在体内完成procaspase-3的加工和激活。免疫沉淀实验表明，Smac/DIABLO在胞浆中的功能似乎是分离p24–XIAP相互作用。胞浆活性Smac/DIABLO在Bax缺陷细胞中恢复TRAIL敏感性的能力有力地支持了Smac/DIABLO这一线粒体因子是死亡受体介导的凋亡途径所必需的观点。鉴于Smac/DIABLO在体内调节caspase-3的激活，这是死亡受体和线粒体介导的凋亡中的一种常见效应caspase，Smac/DAIBLO可能也是细胞凋亡的一种有效调节因子c（c）–caspase-9介导的caspase-3激活和凋亡。

尽管线粒体和细胞死亡受体介导的凋亡中涉及的许多分子和遗传途径的功能已经得到了很好的确定，但我们对这两种途径之间相互作用的理解仍然支离破碎。我们的数据首次证明了一系列信号转导事件，将两条看似独立的凋亡途径连接在一个单一的遗传系统中。基于他人之前两份报告的结果(Du等人，2000年;绿色2000;Verhagen等人，2000年)在我们目前的研究中，我们提出了死亡受体和线粒体介导的细胞死亡途径之间的相互作用模型。死亡受体的激活导致caspase-8的激活，从而导致procaspase-3的初始裂解，生成p24，即部分加工的caspase-2片段。p24蛋白直接与XIAP结合并保持非活性；因此，凋亡途径被阻断，没有发生细胞死亡（图。​（图7）。7). 为了使细胞凋亡继续进行，caspase-8需要裂解Bid以生成tBid，tBid作用于Bax或Bak以诱导线粒体将Smac/DIABLO蛋白释放到胞浆中。细胞溶胶Smac/DIABLO随后与XIAP结合，消除其对p24的抑制，并允许p24的高压冲洗形成p20/p17。与p12一起形成活性胱天蛋白酶-3，细胞凋亡可以进行（图。​（图7）。7). 细胞中XIAP（或其他IAP）的水平可能决定线粒体通路是否对死亡受体介导的凋亡至关重要。如果细胞含有低水平的XIAP，则不会抑制p24高压蒸煮，死亡受体介导的凋亡不需要线粒体释放Smac/DIABLO。另一方面，如果XIAP表达较高，则需要激活线粒体途径才能释放Smac/DIABLO并消除XIAP的抑制作用。与此模型一致，MEF在线粒体细胞死亡途径的某些因子中存在缺陷，例如细胞c（c）(Li等人，2000年)，Apaf-1(Cecconi等人，1998年;Yoshida等人，1998年)和半胱天冬酶-9(Hakem等人，1998年)，仍然对细胞死亡受体介导的凋亡敏感，因为Smac/DIABLO的功能在这些细胞中保持完整。然而，缺乏上游线粒体事件的细胞，如Bid敲除细胞，对细胞死亡受体诱导的凋亡更具抵抗力(Yin等人，1999年)可能是因为这些细胞中Smac/DIABLO的释放被阻断。最近的研究表明存在Smac/DIABLO样分子HtrA2。在细胞凋亡过程中，HtrA2也从线粒体释放出来，与XIAP相互作用(Hegde等人，2001年;Martins等人，2001年;铃木等人，2001;Verhagen等人，2001年). 因此，HtrA2可能在受体和线粒体介导的凋亡之间的相互作用中发挥类似于Smac/DIABLO的作用。

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图7

Smac/DIABLO在细胞死亡受体介导的凋亡中作用的模型。

研究表明，大多数癌细胞表达高水平的XIAP(Tamm等人，2000年). 因此，TRAIL诱导的癌细胞死亡可能需要线粒体参与。以线粒体为靶点的DNA损伤剂大大增强了TRAIL介导的癌细胞凋亡，这一事实支持了这一观点(Keane等人，1999年). 鉴于TRAIL是一种很有前景的潜在抗癌药物，可以杀死癌细胞而不影响正常细胞，因此了解线粒体对TRAIL介导的凋亡的重要作用对于人类癌症TRAIL治疗的发展具有重要意义。线粒体活化受损通常与癌症的发生有关，例如Bax基因突变(Rampino等人，1997年;Ionov等人，2000年)，贝克(Kondo等人，2000年)和Apaf-1功能丧失(Jia等人，2001年;Soengas等人，2001年). 因此，XIAP和Smac/DIABLO代表了绕过线粒体途径并改善TRAIL癌症治疗的潜在治疗靶点。

材料和方法

致谢

脚注

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