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EMBO J。2006年8月9日；25(15): 3605–3617.
2006年8月3日在线发布。 数字对象标识：10.1038/sj.emboj.7601243
预防性维修识别码：项目经理1538563
PMID：16888629

Keap1:Nrf2接口的结构提供了对Nrf2信号的机械洞察力

Shih-Ching Lo公司,1,2,* 李旭初,1,2,* 迈克尔·T·亨兹尔,1 莱萨·J·比默,1,一和马克·汉宁克1,2,b条
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摘要

Keap1是一种BTB-Kelch底物适配器蛋白，调节Nrf2（一种bZIP转录因子）的稳态水平，以应对氧化应激。我们已经确定了Keap1的Kelch结构域的结构，该结构域与Nrf2中包含高度保守DxETGE基序的16肽结合。Nrf2肽包含两条短的反平行β链，由两个重叠的I型β-圈连接，由天冬氨酸和苏氨酸残基稳定。β-回转区位于Kelch结构域顶面上的结合囊中，谷氨酸残基与Keap1中高度保守的残基形成多重氢键。突变实验证实了单个氨基酸在Nrf2与Keap1结合以及Keap1介导的Nrf2依赖基因表达抑制中的作用。我们的结果提供了BTB-Kelch底物适配器蛋白如何与其同源底物结合的详细图片，并将有助于合理设计新型化学预防剂。

关键词：BTB-Kelch蛋白、化学预防、cullin依赖性泛素连接酶、氧化应激、底物适配器蛋白

介绍

真核细胞经常暴露于内源性和外源性的反应分子中(芬克尔和霍尔布鲁克，2000年;Jackson和Loeb，2001年). 这些分子，包括活性氧、亲电化学物质和重金属，破坏生物大分子并损害正常的细胞功能(戴维斯，2000;Imlay，2003年). 氧化损伤与多种病理生理过程有关，包括癌症、心血管疾病、糖尿病和神经变性(艾姆斯和希格纳加，1993年;Jackson和Loeb，2001年;Bonnefont-Rousselot，2002年;切科尼等, 2003;甘巴里等, 2004;姆哈特雷等, 2004). 防止反应性分子造成损害的治疗方法将对改善人类健康产生广泛影响(现金等, 2002;汉密尔顿等, 2004).

真核细胞已经进化出多种防御反应分子的机制。一个主要机制是协同诱导酶，中和反应性分子，消除受损的大分子，恢复细胞氧化还原稳态。在后生动物有机体中，这种细胞保护反应在很大程度上由N’领帽（CNC）转录因子控制，该转录因子构成bZIP转录因子家族中的一个独特子集(马瑟斯等, 2004). 在哺乳动物中，CNC转录因子包括Nrf1、Nrf2、Nrf3、Bach1和Bach2(Motohashi公司等, 2002). 对含有单个或多个CNC家族成员靶向缺失的小鼠的表型分析表明，Nrf1和Nrf2是细胞保护基因表达的主要调节器(梁等, 2003;Yu和Kensler，2005年). Nrf1和Nrf2共享一个共同的结构域，包括一个称为Neh2的保守的N末端调控域、一个中央转录激活域和一个C末端bZIP域，该域是与小Maf蛋白家族成员形成异二聚体所必需的，用于DNA结合和核进出口(陈等, 1993;莫伊等, 1994;加藤等, 2001;布鲁姆等, 2002;Motohashi公司等, 2002;锂等, 2005).

Keap1蛋白是细胞保护基因表达的主要负调控因子(伊藤等, 1999;Dhakshinamoorthy和Jaiswal，2001年). Keap1是BTB-Kelch蛋白，是Cul3依赖性泛素连接酶复合物的底物衔接蛋白(库利南等, 2004;小林寺等, 2004;张等, 2004). 在基础条件下，Keap1靶向Nrf2进行泛素依赖性降解并抑制Nrf2依赖性基因表达(若林等, 2003;Zhang和Hannink，2003年). 在暴露于反应性化学物质或氧化应激的细胞中，Nrf2不再针对泛素依赖性降解(Zhang和Hannink，2003年;张等, 2004;小林寺等, 2006). 相反，Nrf2的稳态水平增加，导致Nrf2依赖基因表达的激活。

Keap1作为底物适配器，使用其N端BTB和中心连接域桥接Cul3和Nrf2，以结合Cul3及其C端Kelch域，从而结合Nrf2的Neh2域(库利南等, 2004;小林寺等, 2004;张等, 2004). Nrf2的Neh2结构域内的赖氨酸残基被Cul3-associated Rbx1蛋白和泛素充电E2蛋白介导的泛素转移靶向(张等, 2004). 该E3泛素连接酶复合物的周期性结合和解离，由CAND1和Cul3奈德化的相反作用介导，可实现Nrf2的高效泛素化和Nrf2依赖基因表达的抑制(Lo和Hannink，2006年). 这种泛素连接酶复合物受到反应性化学物质和氧化应激的干扰，这些反应性化学物和氧化应激修饰了位于Keap1的BTB和连接子结构域中的许多反应性半胱氨酸残基(丁科瓦·科斯托娃等, 2002;Zhang和Hannink，2003年;若林等, 2004;艾格勒等, 2005;商行等，2005年a,2005年b).

我们已经确定了Keap1的Kelch结构域的结构，该结构域与一个肽结合，该肽包含一个位于Nrf2的Neh2结构域中的保守DxETGE基序。Keap1中的结合囊含有多个带电和疏水残基，这些残基与两个谷氨酸残基的侧链和肽骨架接触。DxETGE基序包含由天冬氨酸和苏氨酸残基稳定的β-转区。苏氨酸磷酸化阻止Nrf2衍生肽与Keap1的结合，并且拟磷酸突变使Nrf2能够逃脱Keap1介导的抑制。Keap1通过其BTB结构域二聚化，Keap1二聚体中的两个Kelch结构域能够独立结合Nrf2。我们的研究结果深入了解了Keap1如何靶向Nrf2进行泛素依赖性降解，并将有助于合理设计阻断Nrf2与Keap1结合的新型治疗化合物。

结果

Keap1的Kelch结构域和Nrf2衍生肽之间的复合物结构揭示了Nrf2如何融入Keap1底物结合囊中

Keap1的Kelch域是一个六叶β螺旋桨，其中螺旋桨（I–VI）的每个叶片由四条β链（a–D）组成(图1A) (锂等, 2004). β-绞合线通过从β-螺旋桨中心伸出的不同长度的环连接。按惯例(墙壁等, 1995)连接β-股A和B（A–B）或β-股C和D（C–D）的短环定义了β-螺旋桨的底面，而连接β-线D和A（D–A）或者β-股B和C（B–C）的长环则定义了β螺旋桨的顶面。

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(一)五种不同物种（人类、小鼠、斑马鱼、，黑腹果蝇、和冈比亚按蚊)图中显示了三种人类BTB-Kelch蛋白、mayven、gigaxonin和ENC1的序列。β螺旋桨结构的六个叶片显示在对准上方，组成每个叶片的四条β链（A–D）以灰色突出显示。叶片I的A链位于蛋白质的C末端。Keap1、神经轴突蛋白和ENC1蛋白的疾病相关突变以粗体下划线(博蒙特等, 2000,2003;布鲁诺等, 2004;库伦巴默等, 2002;梁等, 2004;帕德马纳班等, 2006). 定义Kelch重复序列的高度保守残基用星号表示。Keap1中侧链与晶体结构中的Nrf2衍生肽接触的氨基酸以蓝色突出显示，而仅使范德瓦尔斯与Nrf2派生肽接触的那些氨基酸以绿色突出显示。(B类)图中显示了人类Nrf1和Nrf2蛋白的Neh2结构域，以及斑马鱼和D.黑腹果蝇显示了与Keap1结合的两个保守基序。DxETGE基序的谷氨酸残基以蓝色突出显示。显示了我们实验中使用的三个Nrf2衍生肽的序列。

Neh2域包含两个从人类到苍蝇高度保守的区域(图1B). 人类Nrf2蛋白中的一个氨基酸区域17–32包含LxxxDxDLG基序(麦克马洪等, 2004;加藤等, 2005). 第二个区域是人类Nrf2蛋白中的氨基酸77-82，包含DxETGE基序(小林寺等, 2002). Nrf2中的这两个基序都与Keap1中的相同位点结合，但Keap1对DxETGE基序的亲和力约为LxxxDxDLG基序的100倍(用钳子钳起等, 2006).

为了确定高亲和力DxETGE基序是否足以与Keap1结合，我们测定了几种不同的含DxETGE-肽破坏Keap1-Nrf2复合物的能力。通过在几丁质珠上进行亲和纯化，分离出含有C末端几丁质结合结构域的Keap1蛋白（Keap1-CBD）和HA标记的Nrf2蛋白之间的复合物。将珠子与不断增加的肽量和测定的结合HA-Nrf2水平一起孵育。在与含有氨基酸69–84的16-mer Nrf2衍生肽（AFFAQLDEETGEFL）孵育后，观察到与Keap1-CBD蛋白结合的HA-Nrf2数量显著减少(图2A，11–14车道）。一种含有Nrf2氨基酸74–87的14聚体肽（LQLDEETGEFLPIQ）能够像16聚体一样有效地将Nrf2从Keap1中置换出来(图2A，7–10车道）。一种含有76–85氨基酸的10聚体Nrf2衍生肽（LDEETGEFLP）也能够从Keap1中取代Nrf2，尽管不如两种较长的肽有效(图2A，车道3–6）。这种10肽缺乏一个或多个稳定较长肽的骨架相互作用（参见图4C). 等温滴定量热法显示，16肽与Keap1的Kelch结构域结合K（K）d日20 nM的值(图2B)，与出版的K（K）d日Neh2结构域与全长Keap1蛋白结合的值范围为5到9 nM(艾格勒等, 2005;用钳子钳起等, 2006).

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(一)将Keap1-CBD和HA-Nrf2表达载体以及甲壳素珠分离的Keap1:Nrf2复合物转染COS1细胞。将珠与所示肽孵育，清洗，并用抗HA和抗CBD抗体进行免疫印迹分析与珠结合的蛋白质。添加到每个样品中的肽量为10 ng（3、7、11道）、100 ng（4、8、12道）、1μg（5、9、13道）和10μg（6、10、14道）。(B类)（上面板）显示了代表性等温量热实验的热像图，其中用50μM肽滴定Kelch结构域的5μM溶液。（下面板）显示了四个实验的拟合结合等温线。通过将50μM肽溶液滴定到5μM Kelch结构域溶液中，进行了三个实验（圆形、方形和三角形）。第四个实验（钻石）是通过将88μM的肽溶液滴定为6.25μM的Kelch结构域溶液来进行的。

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(一)Nrf2肽侧链原子与Kelch结构域残基之间的接触。(B类)肽的主链原子和Kelch结构域残基之间的接触。(C类)Nrf2肽的棒状模型，突出显示分子内氢键。安F类o个−F类c（c）肽附近2.5σ处的电子密度省略图以蓝色显示。在将肽纳入模型之前，在分子替换后立即确定图的相。E78的侧链在电子密度图中排列不整齐，显示为半透明。(D类)示意图显示了Kelch结构域中相互作用残基与Nrf2肽（黄色/蓝色）的主链和侧链接触。

用X射线晶体学测定了与16肽结合的人Kelch结构域的结构为1.5μl(图3). 正如我们之前的工作所预测的那样(锂等, 2004)，并与最近对小鼠Kelch结构域与含DxETGE肽结合的结构分析相一致(帕德马纳班等, 2006)，Nrf2衍生的肽结合在由Kelch结构域顶面上的D–A和B–C环定义的浅口袋中(图3). 该肽有两条反平行的β-链，由一个具有两个重叠I型β-圈的圈区域连接（残基77-80和78-81；图4C). 回转区由涉及D77和T80侧链以及肽骨架的氢键稳定(图4C). 复杂地层埋藏420º2Kelchβ-螺旋桨的表面积。

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(一)Kelchβ螺旋桨（红色）和结合Nrf2肽（黄色管）的带状图。肽的末端标记为N-ter和C-ter；Kelch域的叶片标记为N和C。β螺旋桨的六个叶片标记为I–VI，每个叶片中的四条β链标记为A–D（白色字体）叶片VI(B类)Kelch域侧视图，带有β螺旋桨的表面表示。(C类)Kelch螺旋桨（灰色）和肽（黄色管）的表面表示。选定的残留物显示为蓝色（基本）、橙色（极性）和绿色（非极性）。

谷氨酸残基E79和E82是侧链与Kelch结构域发生特定相互作用的唯一肽残基(图4A和表一). E79的羧酸氧原子与Arg415、Arg483和Ser508的侧链接触，而E82的羧酸氢原子与Ser363、Asn382和Arg380的侧链形成氢键。肽主链与Kelch结构域有五个接触，四个来自E78、E79、T80和F83的羰基氧原子，一个来自F83的主链酰胺基团(图4B).

表1

Keap1的突变分析

刀片一循环b条氨基酸c（c）突变表型d日Nrf2触点e（电子）
六/一D–A型S公司602+T80磅
我B–C（N）YFR公司334–336− 
我B–C（C）QSL公司337–339− 
我B–C类Y（Y）334−F83磅
我B–C类F类335+ 
我B–C类R（右）336+ 
我B–C类问337+ 
      
一/二D–A型S公司363+E82秒
二B–C（N）NNSP公司381–384− 
二B–C（C）DGNT公司385–388+ 
二B–C类R（右）380−E82供应
二B–C类N个382−F83 bb；E82秒
二B–C类P（P）384+ 
二B–C类N个387+ 
      
二/三D–A型R（右）415−E79 sc；E79 vw；T80伏
三B–C（N）上海通用汽车431–433+ 
三B–C（C）CIH公司434–436− 
三B–C类C类434+ 
三B–C类H（H）436− 
      
三/四D–A型R（右）459+ 
四B–C（N）FDG公司478–480− 
四B–C（C）TNR公司481–483− 
四B–C类F类478− 
四B–C类R（右）483−E79秒
      
静脉/静脉D–A型S公司508+E79秒
V（V）B–C（N）YDG公司525–527− 
V（V）B–C（C）ADQ公司528–530+ 
V（V）B–C类Y（Y）525−E79大众
V（V）B–C类问530+E78 bb型
      
第五版/第六版D–AK（K）551+ 
第五版/第六版D–A型R（右）553+ 
第五版/第六版D–A型S公司555+E79磅
不及物动词B–C（N）YDG公司572–574− 
不及物动词B–C（C）HTF公司575–577+ 
不及物动词B–C类Y（Y）572−L76 vw；G81 vw
不及物动词B–C类F类577+G81 vw
一Kelchβ螺旋桨的六个叶片标记为I–VI。
b条Kelchβ螺旋桨每个叶片的四条β链标记为A–D。
c（c）人类Keap1蛋白中指示残基的氨基酸数。
d日含有丙氨酸替代指定氨基酸的突变Keap1蛋白抑制Nrf2依赖性转录的能力。A‘+’表示突变Keap1蛋白等同于野生型Keap1蛋白质，而A‘−’表示突变的Keap1在抑制Nrf2依赖性转录方面显著受损。
e（电子）人类Keap1蛋白中指示残基与Nrf2中的氨基酸接触。“bb”表示Keap1残基的侧链与Nrf2肽的主链接触；“sc”表示Keap1残基的侧链与Nrf2残基的侧链接触；“vw”表示Keap1残基的侧链参与了与Nrf2残基的疏水范德瓦尔斯相互作用。

溶剂分子介导肽和Kelch结构域之间的额外接触(表二)，实现E79和Arg415之间的额外接触，并允许E82与Asn414和Ser602交互。D77的羧酸氧原子与两个水分子接触，从而与Arg415和Arg380形成桥接氢键。T80的羟基利用水分子与Arg380相互作用。

表2

复合物中的氨基酸接触

肽残基/原子Kelch残留物/原子距离（Ω）桥接水距离（Ω）Kelch残留物/原子距离（Ω）
D77外径2  HOH 110型2.57精氨酸415 NH12.76
   HOH 125型2.80精氨酸380 NH12.90
E78欧Gln530 NE2公司2.98    
E79欧Ser555 OG系列2.59    
E79 OE1型508系列OG2.63    
 Arg415氨气2.72    
 Arg415 NH1型3.04    
E79 OE2型Arg483 NH23.17    
 Arg483东北2.70    
   HOH霍华德1762.98Arg415 NH1型3.14
T80Ω602系列OG2.77    
T80 OG1型  HOH 45型2.75Arg380 NH1型3.04
E82 OE1型Asn382 ND2型2.98    
 Arg380 NH1型2.82    
 Arg380东北2.82    
E82 OE2型Ser363 OG系列2.63    
   HOH 33号机组2.97Asn414 OD1型2.80
   HOH 4型2.75602系列OG2.94
F83欧Asn382 ND2型2.99    
功能83 NTry334俄亥俄州3.34    

Kelchβ螺旋桨的所有六个叶片都有助于形成复杂的形状(表一). 与肽侧链接触的Kelch结构域残基集中在叶片II、III、IV和V中结合囊的一侧，而与肽主链原子接触或参与范德瓦尔斯相互作用的残基则位于叶片V、VI、I和II的结合囊的另一侧(表一和​和II二).

Keap1中六个残基的侧链（Ser363、Asn382、Arg380、Arg415、Arg483和Ser508）参与与肽中E79和E82的羧酸氧原子的氢键相互作用(图4A). 这六个残基中的一些还参与了与肽的其他相互作用。例如，Asn382的主链酰胺与F83的羰基氧相互作用，Arg415和Arg380的侧链与连接D77羧酸氧的溶剂水分子形成氢键(表二). Keap1中另外五个残基的侧链参与与肽主链的氢键结合：它们是Tyr334、Asn382、Gln530、Ser555和Ser602(图4B). 最后，Keap1中七个残基的侧链参与与肽的范德瓦尔斯相互作用，包括Tyr334、Asn387、Arg415、Ser508、Tyr525、Tyr 572和Phe577(表一).

识别Keap1结合囊中与Nrf2结合所需的氨基酸

对Keap1进行广泛的丙氨酸扫描突变，以确定Keap1中特定氨基酸对Nrf2结合的贡献。构建了12个Keap1突变体，每个B–C环中含有三个或四个相邻残基的丙氨酸替代(表一). 突变Keap1蛋白结合Nrf2的能力通过联合免疫沉淀法测定，其抑制Nrf2依赖性转录的能力通过使用ARE依赖性荧光素酶基因的报告基因分析测定。12个突变Keap1蛋白中有8个蛋白与Nrf2结合并抑制Nrf2依赖基因转录的能力受损(图5A和B).

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(一)如图所示，COS1细胞与HA-Nrf2和突变Keap1蛋白的表达载体共转染。用抗HA和抗Keap1抗体对总细胞裂解物进行免疫印迹分析（底部两个面板）。使用抗HA抗体对抗Keap1免疫沉淀物（IP）进行免疫印迹分析（顶面板）。(B类)如图所示，用HA-Nrf2（100 ng）和突变Keap1蛋白（50 ng）的表达载体转染MDA-MB-231细胞，并用ARE依赖的萤火虫荧光素酶报告基因构建物（100 ng。质粒编码雷尼利亚荧光素酶（10ng）作为转染效率的对照。所示数据表示三个独立实验结果的平均值和标准偏差。(C类)如图所示，用Keap1-CBD表达载体和突变HA-Nrf2蛋白转染HEK 293 T细胞。用抗HA和抗CBD抗体进行免疫印迹分析总细胞裂解物（底部两个面板）。将裂解产物与甲壳素珠孵育、洗涤，并用抗HA抗体进行免疫印迹分析与甲壳质珠相关的蛋白质（顶面板）。一个星号(*)表示抗体检测到的非特异性蛋白质。(D类)报告者分析如（B）所述。(E类)按（C）所述进行下拉分析。(F类)报告者分析按（B）所述进行。(G公司)如（A）所述进行共免疫沉淀测定，不同之处在于将Keap1和Nrf2表达载体分别转染到细胞中，并在输入量标准化至Nrf2水平后在免疫沉淀前混合细胞裂解物。(H（H）). 报告者分析按（B）所述进行。

丙氨酸扫描突变在第二组突变的Keap1蛋白中得到细化，其中B–C环中的13个氨基酸，每个都有一个表面暴露的侧链，分别突变为丙氨酸(表一). 将单个丙氨酸残基替换为Tyr334、Asn382、His436、Tyr525和Tyr572显著干扰了Keap1结合Nrf2和抑制Nrf2依赖性转录的能力(图5C和D). 除His436外，在晶体结构中观察到所有这些残基都参与了与Nrf2衍生肽的接触(图4和表一和​和II）。二). 尚不清楚为什么His436的丙氨酸取代会干扰Keap1结合Nrf2的能力，因为His436A-Kelch结构域的圆二色性（CD）光谱与野生型Kelch区域的CD光谱几乎相同(补充图1和2). 与Nrf2结合不需要额外的残基Phe478(图5C)，但是抑制Nrf2依赖性基因表达所必需的(图5D). 进一步分析表明，该突变体在引导Nrf2泛素化方面存在缺陷（数据未显示）。

构建了第三组突变的Keap1蛋白，其中六个精氨酸残基和一个赖氨酸残基都带有表面暴露的侧链，被丙氨酸残基取代(表一). 该分析确定了三个精氨酸残基（Arg380、Arg415、Arg483），它们是结合Nrf2和抑制Nrf2依赖基因表达所必需的(图5E和F). 如晶体结构所示，这三个精氨酸残基的侧链参与与Nrf2衍生肽的多重接触(图4和表一和​和II二).

构建了最后一组突变的Keap1蛋白，该蛋白含有分别取代D–A环、Ser363、Ser508、Ser555和Ser602中四个丝氨酸残基的丙氨酸残基(表一). 尽管这些丝氨酸残基的侧链参与了与Nrf2衍生肽的氢键相互作用(图4)，这些丝氨酸残基的单独丙氨酸替代并没有显著降低Keap1与Nrf2结合或抑制Nrf2依赖基因表达的能力(图5G和H).

Keap1形成能够结合两个Nrf2分子的同型二聚体

与16-mer Nrf2衍生肽结合的人类Kelch结构域的结构和与较短Nrf2派生肽结合的小鼠Kelch域的最近发表的结构(帕德马纳班等, 2006)表明Keap1的Kelch结构域包含Nrf2中DxETGE基序的单一结合位点。Keap1通过其N末端BTB结构域二聚化(Zipper和Mulcahy，2002年)，结构数据与Keap1和Nrf2以2:2的化学计量比形成络合物的概念一致。然而，最近的一些报告表明Keap1二聚体结合一个Nrf2多肽，导致化学计量比为2:1(艾格勒等, 2005;用钳子钳起等, 2006). 作为这些在体外生化实验使用从原核表达系统获得的高浓度纯化蛋白，Keap1:Nrf2复合物在真核细胞更复杂的环境中的化学计量学仍然是一个悬而未决的问题。

为了证实Keap1在真核细胞中以二聚体的形式存在，一个CBD标记的Keap1蛋白与一个未标记的Keap1蛋白在HEK 293 T细胞中共表达。只有在CBD标记的Keap1存在的情况下，才能用几丁质珠将未标记的Keapp1蛋白拉下(图6A，从顶部开始的第二个面板，比较13号车道和14号车道）。这一结果与先前的报告一致，即涉及N末端BTB结构域的蛋白质-蛋白质相互作用使Keap1形成同二聚体(Zipper和Mulcahy，2002年)尽管不能排除Keap1在细胞中形成高阶低聚物结构的可能性。不出所料，在CBD标记的野生型Keap1蛋白存在的情况下，用几丁质珠将Nrf2拉下(图6A，顶面板，11和12道）。

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(一)用所示Keap1和Nrf2蛋白的表达载体转染HEK 293 T细胞。用抗Keap1抗体和抗HA抗体对总细胞裂解物进行免疫印迹分析（底部两个面板）。将等量的细胞裂解物与甲壳素珠孵育、洗涤，并使用抗HA和抗Keap1抗体进行免疫印迹分析与甲壳质珠相关的蛋白质（顶部两个面板）。(B类)用Keap1和Nrf2蛋白的表达载体转染HEK 293 T细胞。用抗HA、抗Keap1和抗Gal4抗体进行免疫印迹分析总细胞裂解物（底部三个面板）。使用抗Gal4和抗Keap1抗体通过免疫印迹法分析抗-HA免疫沉淀物（前两个面板）。

接下来，我们生成了包含一个野生型Kelch结构域和一个突变Kelch域的异二聚体Keap1复合物，以确定Keap1二聚体中是否存在单功能Kelch区域足以结合Nrf2。将CBD标记附加到突变Keap1蛋白上，以便在几丁质珠上分离出两种类型的Keap1二聚体：一种Keap1同型二聚体包含两个突变Kelch结构域，另一种Keap1异二聚体则包含一个野生型和一个突变Kelich结构域。三个突变的Keap1蛋白用于此分析，其中两个蛋白不能单独结合Nrf2（Y334A和R415A），另一个蛋白（Q337A）能够结合Nrf1和野生型Keap1蛋白质。通过甲壳素下拉和免疫印迹分析评估同二聚体和异二聚体复合物结合Nrf2的能力。正如预期的那样，在Keap1-Y334A和Keap1-R415A蛋白存在的情况下，没有用几丁质珠拖出Nrf2(图6A，上部面板，通道2和8）。然而，野生型未标记Keap1蛋白与这两个突变Keap1蛋白质中的任何一个共同表达都部分恢复了Nrf2的下拉(图6A，上部面板，比较通道3、9和12）。由于甲壳素珠分离的二聚体Keap1复合体中只有一部分具有一个野生型Kelch结构域，其余Keap1复合物包含两个非功能Kelch域，因此预计Nrf2下拉部分会恢复。这些结果表明，Keap1二聚体上下文中的单个功能Kelch结构域足以结合Nrf2。

最后，我们询问Keap1二聚体是否能够结合两种不同的Nrf2蛋白。将Nrf2的Neh2结构域融合到Gal4 DNA结合结构域上，并在没有或存在共表达Keap1的情况下与HA-标记的全长Nrf2蛋白共表达。用抗HA抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀，并用抗Gal4抗体检测所得免疫沉淀中是否存在Gal4-Neh2蛋白。Gal4-Neh2蛋白仅存在于共表达Keap1的抗HA免疫沉淀物中(图6B，上部面板，比较通道2和3）。因此，Keap1蛋白充当HA-Nrf2蛋白和Gal4-Neh2蛋白之间的桥梁。HA-Nrf2的DxETGE基序内T80的单一丙氨酸替代可消除Gal4-Neh2蛋白的免疫共沉淀(图6B，上部面板，通道4）。Keap1-Y334A蛋白不能结合HA-Nrf2或Gal4-Neh2，不能桥接两个Nrf2蛋白(图6B，上部面板，通道5）。同样，不能形成同二聚体的分离Kelch结构域也不能桥接两个Nrf2蛋白，尽管它很容易与HA-Nrf2蛋白结合(图6B，上部面板，通道6）。这些结果表明，Keap1二聚体能够桥接两种不同的含DxETGE的蛋白质，这与Keap1和Nrf2可以形成2:2化学计量复合物的概念一致。

Nrf2中DxETGE基序内保守苏氨酸的磷酸化破坏了与Keap1的结合

结合到Kelch结构域的Nrf2衍生肽的晶体结构显示存在两个重叠的I型β-圈，残基77-80和78-81，其中D77和T80的侧链分别与肽骨架形成氢键。苏氨酸残基T80特别令人感兴趣，因为该残基的磷酸化可能会干扰β-转角的形成并阻止Nrf2与Keap1的结合。

使用含有丙氨酸或磷酸苏氨酸代替T80的14聚体肽进行肽竞争实验。与Nrf2的74–87氨基酸相对应的14肽含有丙氨酸代替T80，即使输入肽水平比野生型肽取代Keap1中的Nrf2所需的水平高100倍，也无法取代Keap1-CBD中的HA-Nrf2(图7A，将车道3–6与车道7–10进行比较）。同样，含有磷酸苏氨酸残基取代T80的14肽也无法取代Keap1中的Nrf2(图7A，车道11-14）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为7601243f7.jpg

(一)将Keap1-CBD和HA-Nrf2表达载体以及甲壳素珠分离的Keap1:Nrf2复合物转染COS1细胞。将珠与所示肽孵育，清洗，并用抗HA和抗CBD抗体进行免疫印迹分析与珠结合的蛋白质。添加到每个样品中的肽量为10 ng（3、7、11道）、100 ng（4、8、12道）、1μg（5、9、13道）和10μg（6、10、14道）。(B类)用Keap1和Nrf2蛋白的表达载体转染HEK 293 T细胞。用抗HA和抗CBD抗体进行免疫印迹分析总细胞裂解物（底部两个面板）。将等量的细胞裂解物与甲壳素珠孵育、洗涤，并使用抗HA和抗CBD抗体进行免疫印迹分析与甲壳质珠相关的蛋白质（顶部两个面板）。(C类)报告者分析按照图5B.

为了研究T80在Keap1介导的Nrf2依赖基因表达抑制中的重要性，我们鉴定了几个突变的Nrf1蛋白，其中T80被改变为丙氨酸、丝氨酸或磷酸模拟谷氨酸或天冬氨酸。与肽竞争实验一致，T80A Nrf2突变蛋白没有结合Keap1，并且对Keap1介导的Nrf2依赖基因表达的抑制具有抵抗力(图7B、顶面板、通道2和图7C). 含有磷酸化替代（T80D和T80E）的Nrf2蛋白与Keap1的结合也受到损害，并且不受Keap1介导的阻遏作用的影响(图7B，顶面板，通道4和5，以及图7C). 相反，T80S突变体Nrf2蛋白的行为基本上与野生型Nrf2蛋白质相似，Nrf2与Keap1的结合轻微减少，Keap1介导的抑制(图7B、顶面板、通道3和图7C). 这些结果表明，丝氨酸残基的羟基是苏氨酸残基羟基的有效替代物，可以稳定DxETGE基序的β-圈。相反，苏氨酸羟基的缺失或负电荷的存在都会破坏β-转向区，并可能阻止两侧的谷氨酸残基与其在Keap1中的同源残基相互作用。

讨论

cullin-dependent泛素连接酶复合物以高度特异和调节的方式进行蛋白质泛素化的能力来源于底物衔接蛋白以高度亲和力和特异性识别其底物的能力。Cul1和Cul2蛋白的底物衔接蛋白已被深入研究，结构分析提供了对其识别特定底物能力的详细了解(荣誉等, 2002;分钟等, 2002;奥里奇等, 2003;吴等, 2003). 最近的研究表明，BTB-Kelch蛋白由一个N端BTB结构域和一个C端Kelch结构域定义，其功能是作为Cul3的底物适配器蛋白(库利南等, 2004;小林寺等, 2004,2006;张等, 2004,2005;Furukawa和Xiong，2005年;王等, 2005). 在本报告中，我们确定了人类Keap1的Kelch结构域与来自其底物Nrf2的16肽结合的结构。连同小鼠Keap1的Kelch结构域，该结构域与一个9 mer Nrf2衍生肽结合，该原稿正在审查中(帕德马纳班等, 2006)这些结构研究提供了Keap1如何结合Nrf2的详细图片。

Kelch结构域和Nrf2衍生肽之间的氨基酸接触比较以及含有单个丙氨酸取代的突变Keap1蛋白的功能分析表明，位于Keap1结合囊中的带电残基和疏水残基是复合物稳定性的主要贡献者。特别是，Keap1中的Tyr334、Arg380、Asn382、Arg415、Arg483、Tyr525和Tyr572的侧链均与Nrf2衍生肽接触，这些残基的个别丙氨酸替代显著削弱与Nrf1的结合和Nrf2依赖基因表达的抑制。相比之下，直接接触Nrf2衍生肽的四个丝氨酸残基（Ser363、Ser508、Ser555和Ser602）的单独丙氨酸替换并没有显著损害Nrf2的结合或Nrf2依赖性转录的抑制。因此，这些丝氨酸残基和Nrf2之间的氢键接触对Keap1:Nrf2复合物的整体稳定性没有显著影响。然而，我们的结构和功能研究之间的总体一致性表明，Keap1的Kelch结构域和Nrf2衍生肽之间的复合物的晶体结构是全长Keap1和Nrf2蛋白之间氨基酸接触的准确表示。

我们的结构和功能研究为DxETGE基序是Nrf2中主要Keap1结合位点的概念提供了有力支持。靶向泛素化的Nrf2中的赖氨酸残基位于DxETGE基序N末端侧10–30个氨基酸的距离处(张等, 2004). 通过DxETGE基序将Nrf2与Keap1结合将定位这些残基以进行泛素转移。Nrf2中的第二个Keap1结合位点，包含共有序列LxxQDxDLG，位于DxETGE基序N端约50个氨基酸的距离处，最近被鉴定(用钳子钳起等, 2006). LxxQDxDLG基序在Kelch结构域的底物结合口袋中结合，尽管Keap1对LxxQDxDLG基序的亲和力比DxETGE基序低大约两个数量级。山本及其同事(用钳子钳起等, 2006)提出了一种模型，其中一个Nrf2多肽通过DxETGE和LxxxQDxDLG基序桥接Keap1同源二聚体中的两个Kelch结构域。此模型由支持在体外使用纯化蛋白质的生化实验表明Keap:Nrf2复合物的化学计量比为2:1(艾格勒等, 2005;用钳子钳起等, 2006). 相反，我们通过在真核细胞复杂的细胞内环境中异位表达Keap1和Nrf2蛋白进行的实验表明，Keap1同源二聚体的两个Kelch结构域能够独立地结合到两种不同的Nrf2多肽，这与Keap:Nrf2复合物的2:2化学计量相一致。Keap1:Cul3:Rbx1复合物的基于结构的模型表明Keap1二聚体中的两个Kelch结构域在空间上是分离的(斯托吉奥斯等, 2005)与每个Kelch结构域可以独立地向Rbx1招募到E3泛素连接酶复合物中的E2结合酶提供底物蛋白的概念一致。由于该结构模型主要基于计算模型，需要对整个泛素连接酶复合物进行详细的结构和功能分析，以进一步了解Keap1如何将Nrf2作为泛素化的底物。

在细胞生长的基本条件下，Keap1组成性地靶向Nrf2，以实现泛素依赖性降解。在细胞暴露于亲电化学物质或明显的氧化应激后，Nrf2能够逃避Keap1介导的降解，在细胞核内积聚，并激活基因表达。Nrf2激活的普遍模型是，反应性化学物质和氧化应激修饰位于BTB和连接子结构域的Keap1中的一个或多个半胱氨酸残基(丁科瓦·科斯托娃等, 2002;Zhang和Hannink，2003年;若林等, 2004;艾格勒等, 2005;商行等2005年a,2005年b). 因此，Keap1与Cul3组装成功能性E3泛素连接酶复合物的能力受到干扰，Nrf2不再有效地靶向泛素依赖性降解，尽管Nrf2仍然与Keap1相关(Zhang和Hannink，2003年;张等, 2004;小林寺等, 2006). 然而，我们目前的结果表明，DxETGE基序中苏氨酸残基T80的磷酸化显著降低了Nrf2衍生肽与Nrf2竞争Keap1结合的能力在体外此外，Nrf2的磷酸化突变体逃避了Keap1介导的细胞抑制。由于T80的侧链参与稳定β-转角的氢键，从而使DxETGE基序适合Keap1的结合囊，因此T80的磷酸化可能会干扰肽的构象，从而使其无法适合于Keap1上的结合位点。庞大的磷酰基也可能提供空间位阻。虽然T80的磷酸化尚未被证实体内一个有趣的假设是，T80的磷酸化可能在没有明显暴露于亲电化合物或氧化应激的情况下激活Nrf2。Nrf2中T80磷酸化状态的详细研究体内将对导致Nrf2依赖性基因表达激活的多种途径提供新的见解。

Keap1是由人类基因组编码的49种BTB Kelch蛋白之一。几种BTB-Kelch蛋白Kelch结构域中的点突变，包括Keap1、gigaxonin和ENC1，与人类疾病有关(图1A). 在Keap1的病例中，一个基因变异（G364C）和一个体细胞突变（G430C）与肺癌相关(帕德马纳班等, 2006). G364C突变位于叶片I的A–D环，可能破坏底物结合囊，而G430C突变与叶片III的B链相邻，可能破坏Kelch结构域的结构。正如预期的那样，这两种突变Keap1蛋白结合Nrf2的能力都受到了损害(帕德马纳班等, 2006). 已经描述了巨细胞轴突蛋白和ENC1的Kelch结构域中的一些与疾病相关的点突变(博蒙特等, 2000,2003;库伦巴默等, 2002;梁等, 2004)而且这些突变很可能会干扰神经轴突蛋白和ENC1与其各自底物蛋白的关联。此外，由于D–A环和B–C环形成的底物结合囊的总体尺寸可能与其他BTB-Kelch蛋白非常相似，其他BTB-Kelch蛋白的底物也可能利用β-转基序结合其同源底物适配器。Keap1蛋白已成为BTB-Kelch蛋白的代表性原型，对Keap1结构和功能的详细了解将继续阐明我们对这一重要的人类蛋白质大家族的理解。

材料和方法

重组DNA分子和肽

野生型Keap1、CBD标记的Keap1，HA标记的Nrf2和Gal4-Neh2蛋白的真核表达质粒，以及依赖ARE的报告质粒已经在前面描述过(张等, 2004). Keap1的His-tagged Kelch结构域的基于pET15b的表达载体已在前面描述过。利用标准重叠延伸技术通过定点突变产生突变Keap1和Nrf2 cDNA。本研究中使用的所有基因都是在实验所用表达载体的背景下测序的。多肽购自Sigma-Genosys和Cell-tek，并在HPLC纯化后以高于95%的纯度供应。

细胞培养、转染和报告基因分析

COS1、MDA-MB-231和HEK-293 T细胞购自ATCC。细胞保存在含有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle's培养基或Eagle's最小基本培养基中。使用Lipofectamine Plus（Gibco BRL）进行转染。使用Promega Dual-Light分析系统进行报告基因分析。

抗体、免疫沉淀、肽竞争和免疫印迹分析

抗Keap1抗体已被描述(Zhang和Hannink，2003年). 针对Nrf2（Santa Cruz）、几丁质结合域（New England Biolabs）和HA表位（Covance）的抗体从商业来源购买。为了进行免疫沉淀，在含有1 mM二硫苏糖醇（DTT）、1 mM苯甲基磺酰基氟化物和蛋白酶抑制剂混合物（Sigma）的RIPA缓冲液（10 mM磷酸钠（pH 7.9）、150 mM氯化钠、1%Triton X-100、1%脱氧胆酸钠、0.1%Triton SDS）中制备细胞提取物。将可溶性细胞裂解物与2μg亲和纯化抗体在4℃孵育2 h，然后与蛋白A-琼脂糖珠（Sigma）在4℃孵化2 h。用裂解缓冲液洗涤四次，去除未结合蛋白。免疫沉淀蛋白在样品缓冲液中通过煮沸5分钟洗脱，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移到硝化纤维素膜上，并进行免疫印迹分析。

对于肽竞争分析，将HA-Nrf2和Keap1-CBD表达载体转染COS1细胞。在细胞裂解之前，将转染细胞暴露于蛋白酶体抑制剂MG132中4.5小时。细胞裂解物收集在ELB缓冲液（50 mM Hepes（pH 7.9）、250 mM NaCl、0.1%Triton X-100、5 mM EDTA）中，该缓冲液含有1 mM DTT、1 mM苯甲基磺酰氟、蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂（1 mM EGTA、1 mM-Na三VO（旁白）4，100 mM NaF，20 mM焦磷酸钠）。将裂解物（200μg）与几丁质珠在4°C下孵育，通过离心（3000克)，并在ELB缓冲液中清洗。与几丁质珠相关的蛋白质与肽（10 ng、100 ng、1μg或10μg）在4°C下进一步孵育，在ELB缓冲液中多次洗涤后，用抗HA和抗CBD抗体进行免疫印迹分析。

等温滴定量热法

等温滴定量热实验在MicroCal VP-ITC中于25°C下进行。对Kelch蛋白进行透析，使其与反应缓冲液（50 mM Tris，pH 8.0，100 mM NaCl，5 mM DTT）平衡。保留透析贮存器的等分试样以制备Kelch结构域和肽的稀释液。在实验之前，蛋白质和肽溶液在真空下短暂脱气。每隔4分钟向1.41 ml样品细胞中含有的Kelch结构域样品添加（10μl）肽。在三个实验中，用50μM肽滴定Kelch结构域的5μM溶液。在第四个实验中，用88μM肽滴定6.25μM的Kelch域溶液。采用单点结合模型对四个实验的综合数据进行全局分析，以提取结合常数和结合焓的估计值。

结晶和数据收集

如前所述，对Kelch结构域进行纯化(锂等, 2004). 在4°C下，通过悬挂滴蒸气扩散法从2μl摩尔比为1:3的蛋白质与肽混合物和2μl微孔缓冲液中生长晶体。衍射质量晶体在2天内从含有0.2 M MgCl的良好缓冲液中生长20.1 M Tris–HCl和30%w/v PEG 4000，蛋白质浓度为10 mg/ml。使用单晶在劳伦斯伯克利国家实验室的先进光源MBC 4.2.2光束线上收集了在−180°C下的1.55º数据集。所有数据都被编入索引并与d集成*《迷航》(Pflugrath，1999年). 数据收集和细化统计数据见表III.

表3

数据收集和细化统计

数据收集统计
 波长（Ω）1.239
 “空间”组第2页1212
 单元格（奥数）一=76.76,b条=92.07,c（c）=46.31
 每个asu的分子数c（c）1
 分辨率（Ω）36.42–1.50
 镶嵌度（deg）0.34
 观察次数321 494
 独特反射次数50 551
 冗余6.3 (3.3)
 R（右）合并(%)7.7 (45.6)
 平均值我/σ我11.1 (2.1)
 完整性（%）94.7 (64.6)
  
细化统计信息 
 分辨率范围（Ω）36.0–1.50
 R（右）晶体 一17.9
 R（右）自由的 b条19.9
 R.m.s.d.粘结距离（Ω）0.009
 R.m.s.d.粘结角（度）1.211
 asu中非H原子总数c（c）2728
 溶剂分子数量333
 平均肽B类-值（Ω2)18.1
 平均蛋白质B类-值（Ω2)16.9
 平均溶剂B类-值（Ω2)30.2
括号中的数字是指外部分辨率外壳（1.55–1.50Ω）的统计数据。
一R（右）晶体=∑∣F类o个−F类c（c）∣/∑∣F类c（c），其中F类o个和F类c（c）分别观察和计算了结构因子。
b条R（右）自由的是R（右）根据未包含在细化中的反射的5%计算的因子。未使用数据的σ截点。
c（c）asu，非对称单元。

结构解决和细化

用分子替换法测定了Kelch-肽复合物的结构(穆尔舒多夫等, 1997)以及Kelch域（1U6D）的结构作为搜索模型。使用REFMAC 5.0进行精炼(穆尔舒多夫等, 1999); 通过使用R（右）自由的5%的数据在细化之前被留作交叉验证。水分子的峰值大于3.0σinF类o个−F类c（c）在蛋白质的氮原子或氧原子或其他溶剂原子的氢键距离内。TLS改进(优胜者等, 2001)将蛋白质和肽作为单独的刚体进行。使用Coot交互式执行模型构建(埃姆斯利和考坦，2004年).

蛋白质的最终模型由Kelch结构域中的285个残基、肽中的16个残基和333个水分子组成(表III). 残留物根据完整Keap1蛋白和Nrf2蛋白的序列进行编号。肽的所有残基的主干都有清晰的电子密度；肽末端的残基参与与单位细胞中其他分子的晶体接触。Kelch结构域中的五个残基（Glu446、Arg447、Glu493、Gln528和Lys551）和肽中的两个残基（T72和E78）的侧链的密度没有很好地定义，并且表示为丙氨酸残基。共有17个残基在两种构象中建模，其中一个位于肽（Q75）中。该模型通过SFCHECK进行了评估(迷茫等, 1999)和WHAT_CHECK(发动机罩等, 1996). 用PYMOL绘制图形(德拉诺，2002年). 坐标已存放在PDB中，代码为2FLU。该模型具有良好的几何结构，91.6%的残留物位于Ramachandran图中最受欢迎的区域，0.0%位于不允许的区域(拉斯科夫斯基等, 1993).

补充材料

补充图1

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补充图2

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致谢

我们感谢Jay Nix博士和劳伦斯伯克利实验室高级光源光束线4.2.2的工作人员收集同步加速器数据。我们感谢Jack Tanner博士和Shrikesh Sachdev博士的有益讨论。这项工作得到了NIH的研究拨款（AT003899）和P50 CA103130的开发项目的支持。

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文章来自欧洲分子生物学组织由以下人员提供自然出版集团