雷帕霉素哺乳动物靶点对低氧诱导因子1α表达和功能的调节

摘要

肿瘤发展的特征是初始阶段快速扩张，随后随着恶性细胞的增殖超过了局部氧气和营养物质的供应，生长缓慢。在缺乏专用血液供应的情况下，早期肿瘤的稳态体积只有几立方毫米，此时由于氧气和营养物质的消耗，细胞死亡的速度等于细胞分裂的速度(19). 为了恢复生长，这些微肿瘤必须通过改变细胞代谢和刺激新生血管来适应缺氧应激，新生血管提供维持细胞增殖所需的额外血液。因此，缺氧应激期间细胞对生长的适应性有助于恶性进展，并与几种癌症的不良临床结局相关(三,4,18). 缺氧适应的两个特征是厌氧糖酵解速率增加和促血管生成因子（如血管内皮生长因子）的分泌增加(28,39). 因此，细胞对缺氧应激反应的分子机制与癌症生物学和治疗有着相当大的相关性。

细胞对缺氧反应的一个关键调节因子是转录因子，即缺氧诱导因子1（HIF-1）。HIF-1最初被鉴定为促红细胞生成素基因转录的氧反应激活剂，现在已知其在几乎所有身体组织的氧稳态维持中发挥中心作用(42,43). HIF-1的主要形式是由HIF-1α和HIF-1β亚单位组成的异二聚体，这两个亚单位都是转录因子的基本螺旋-环-螺旋家族的成员。虽然HIF-1β是一种组成性表达的核蛋白，但HIF-1α亚单位的表达与环境氧张力紧密耦合。在常压条件下HIF-1α基因被连续转录和翻译；然而，由于泛素蛋白酶体途径的快速破坏，HIF-1α蛋白的表达水平很低。除了其DNA结合和反式激活基序外，HIF-1α还包含约200个氨基酸，称为氧依赖降解（ODD）域。顾名思义，ODD结构域介导HIF-1α和E3泛素连接酶复合物之间的相互作用，E3泛素连接酶复合物介导常氧细胞中HIF-1α的连续多泛素化。

HIF-1α的氧依赖性转换受一个新的脯氨酸4-羟化酶家族（PHD）控制，该家族在两个保守脯氨酸残基（Pro-402和Pro-564）处特异性地修饰HIF-1(5,15,27,41). 脯氨酸羟基化触发HIF-1α的识别VHL（甚高频）肿瘤抑制基因，作为E3泛素连接酶复合物的靶向亚单位(20). 虽然确切的机制尚不清楚，但环境氧张力的降低导致HIF-1α脯氨酰羟基化的相关降低，进而导致HIF-α多泛素化和蛋白水解的速率降低。除了调节HIF-1α的丰度外，缺氧还通过抑制一种独特的氨基酸羟化酶来刺激该蛋白的反式激活功能，该酶修饰位于HIF-1β羧基末端反式激活域的保守Asn(25).

VHL的抑癌功能提供了一个早期线索，即HIF-1α的放松表达促进了肿瘤的发展(47). 随后的免疫组织化学研究显示HIF-1α在各种肿瘤中高表达，特别定位于标记无血管和缺氧区域的分泌周围区(28,45,49,51). 尽管氧张力在HIF-1激活过程中起决定作用，但这种反应的幅度受到生长因子依赖性信号通路的调节，包括Ras-Erk和磷酸肌醇3-激酶（PI3-激酶）/AKT级联(23,50,52). PI 3-激酶途径对肿瘤发生的贡献引起了相当大的兴趣，部分原因是发现了一个主要的肿瘤抑制基因，PTEN公司，在人类癌症中经常被灭活(12). 最近的一项研究表明，PTEN缺陷细胞对缺氧表现出过度的HIF-1激活反应，这一发现可能部分解释了这些肿瘤的侵袭性生长和转移特征(52).

上述观察结果引发了人们的猜测，即通过PI3-激酶/AKT途径的信号传导抑制剂可能对广泛的人类癌症具有治疗效果，尤其是对传统化疗方案反应不佳的晚期肿瘤。其中一种药物雷帕霉素衍生物CCI-779已经进入临床癌症试验(30,34). 雷帕霉素是一种被称为“哺乳动物雷帕霉素靶点”（mTOR）的高分子量蛋白激酶的特异性抑制剂(1,16). 虽然PI 3-激酶和mTOR之间的关系还没有明确定义，但两组研究表明，在有丝分裂原刺激和PTEN缺乏的细胞中，mTOR被AKT磷酸化(32,38). PTEN缺乏的细胞对雷帕霉素的抗增殖和抗癌活性表现出更高的敏感性，这一观察结果支持了PI 3-激酶和mTOR之间的功能联系(2,24,30,33,35). 一个有趣的可能性是，肿瘤对雷帕霉素的敏感性部分归因于HIF-1功能的抑制以及随后对缺氧的适应性反应。

在本研究中，我们检测了mTOR在PTEN缺乏前列腺癌（PC-3）细胞缺氧诱导HIF-1激活中的作用。我们的结果表明，雷帕霉素对PC-3细胞HIF-1依赖性转录的抑制作用是通过抑制mTOR功能介导的。此外，我们提供证据表明，雷帕霉素通过增加HIF-1α降解速率干扰缺氧细胞中HIF-1的激活。这些发现表明，雷帕霉素在体内的抗癌活性可能部分归因于抑制肿瘤发展中的缺氧反应程序。

材料和方法

结果

药物抑制HIF-1激活。

作为确定mTOR信号通路在HIF-1功能中作用的第一步，我们检测了PI3-激酶和mTOR的药理学抑制剂对缺氧或缺氧模拟剂CoCl激活HIF-1的影响₂，在PC-3前列腺癌细胞中。用pHRE-Luc报告质粒瞬时转染细胞，该报告质粒包含四个级联HIF-1结合位点（称为缺氧反应元件[HREs]）。转染细胞暴露于缺氧或氯化钴₂在含有2%或0.1%血清的培养基中。缺氧诱导的HIF-1依赖性转录反应的大小受到缺氧刺激期间血清浓度的强烈影响（图。​（图1A）。1安培). 相反，CoCl₂在含有2%或0.1%血清的情况下，治疗引起HRE依赖性荧光素酶表达的类似增加。在缺氧细胞中观察到HIF-1依赖性报告基因转录的增加被细胞预处理LY294002（PI 3-激酶和mTOR激酶的抑制剂）完全阻断(9,36)或雷帕霉素，哺乳动物细胞中mTOR依赖性信号事件的特异性抑制剂。相比之下，CoCl引发的报告基因表达大幅增加₂在LY294002或雷帕霉素处理的细胞中，暴露量减少了约50%。为了排除雷帕霉素对荧光素酶报告基因mRNA翻译的潜在非特异性抑制作用，我们重复了CoCl₂猴病毒40调节荧光素酶报告质粒的诱导实验。雷帕霉素治疗未导致转染PC-3细胞中猴病毒40荧光素酶活性显著降低（结果未显示），这一发现与图。​图1A1安培雷帕霉素对mRNA翻译的全面抑制。

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图1。

缺氧或氯化钴刺激HIF-1转录活性和HIF-1α蛋白稳定₂（A）用pHRE-Luc报告质粒转染PC-3细胞。24小时后，细胞在2%或0.1%FBS中培养6小时，然后用溶剂载体、50μM LY294002或100 nM雷帕霉素预处理30分钟。然后将细胞暴露于常压条件、缺氧或150μM CoCl中19小时₂荧光素酶活性用光度计测量，并以相对光单位（RLU）表示。误差条表示重复样本的方差。（B） 雷帕霉素对GLUT1公司mRNA表达。PC-3细胞在含有2%血清的培养基中培养以获得低氧样本（上图），或在含有0.1%血清的培养液中培养以获取CoCl₂刺激（下面板）。将细胞暴露于缺氧或150μM CoCl中8小时₂采集细胞总RNA进行半定量RT-PCR分析之前。

为了证实上述报告基因检测的结果，我们检测了雷帕霉素对GLUT1公司，一种已知的HIF-1靶基因(14). PC-3细胞暴露于缺氧或CoCl中16 h₂和总细胞mRNA用作半定量RT-PCR分析的模板。结果如图所示。​图1B1B年证明雷帕霉素治疗显著抑制了缺氧或氯化钴诱导的谷氨酸1 mRNA的增加₂相反，控制基因β的表达-肌动蛋白这些药物既没有增加，也没有被雷帕霉素抑制。

HIF-1依赖性转录活性的水平受到HIF-1α亚基表达的限制，HIF-1α亚基在常氧细胞中会快速降解蛋白酶体(40). 为了检测mTOR信号通路对低氧诱导的HIF-1α稳定的作用，我们用LY294002或雷帕霉素预处理PC-3细胞，然后将细胞暴露于低氧或氯化钴中₂在含有2%或0.1%血清的培养基中。在血清中以任一浓度培养的缺氧细胞中，HIF-1α蛋白的稳态水平增加了3.5到4倍，在用LY294002或雷帕霉素预处理的细胞中，该蛋白的积累减少了约50%（图。​（图2A）。2安培). CoCl也获得了类似的结果₂作为HIF-1α积累的刺激物（图。​（图2B）。2B型). 尽管CoCl对HIF-1α表达的折叠诱导₂当血清浓度从2%降至0.1%时，HIF-1α的表达量明显增加，这在很大程度上是由于在0.1%血清中培养的细胞基础水平较低所致。作为对照，免疫印迹用PLCγ1特异性抗体进行复制。我们观察到这两种药物对细胞提取物中PLCγ1蛋白水平没有一致的影响，这表明这些药物不会引起PC-3细胞中蛋白质周转的整体变化。

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图2。

（A） PC-3细胞在含有2或0.1%FBS的培养基中预培养，用指定的药物处理，然后暴露于常氧（Co）或缺氧，如图所示。​图1A1安培图例。细胞被裂解，洗涤剂可溶性蛋白被SDS-PAGE溶解。依次用α-HIF-1αMAb和α-PLCγ1抗体对膜进行免疫印迹。对免疫印迹进行密度分析，并将数值归一化为正常毒性对照样品中获得的数值。（B） PC-3细胞按照上述方法处理，但细胞受到150μM CoCl的刺激₂（C）在不存在雷帕霉素的情况下，将细胞暴露于缺氧中2或6小时，并按照面板A中的描述处理样品。通过密度测定法对条带强度进行量化，底部面板下方的数字表示每个时间点非药物治疗对照的百分比。

雷帕霉素治疗减缓包括PC-3细胞在内的多种细胞的增殖(1,13; 结果也未显示）。雷帕霉素的抗增殖作用增加了以下可能性：抑制HIF-1α的表达是上述研究中使用的相对较长的药物暴露时间（16 h）时细胞周期进展受到干扰的间接结果。为了解决这个问题，我们重复了图。​图2A2安培并在缺氧暴露4或6小时后检查雷帕霉素对HIF-1α蛋白水平的影响（图。​（图2C）。2厘米). 结果表明，雷帕霉素治疗还抑制了由短期低氧应激触发的HIF-1α的积累，这与G₁雷帕霉素引起的进展非特异性地干扰事件，导致缺氧细胞中HIF-1α积聚。

在随后的研究中，我们检测了雷帕霉素对HIF-1α表达的抑制作用与该药物诱导的HIF-1依赖性转录减少之间的相关性。用pHRE-Luc报告基因转染PC-3细胞的试验群体，然后将其分成平行样本。在不含或含有100 nM雷帕霉素的情况下，将样品置于含2%血清的培养基中缺氧。在培养16小时后，采集并处理一组样品进行HIF-1α免疫印迹，另一组样品用于荧光素酶分析（图。​（图3）。三). 结果表明，雷帕霉素对HIF-1α蛋白表达的抑制作用与HIF-1反式激活功能密切相关。此外，我们在这项和许多其他实验中注意到，雷帕霉素处理抑制了缺氧细胞中HIF-1α的基础表达，以及缺氧诱导的该蛋白的积累。后一结果表明，mTOR活性增加了常氧和缺氧细胞中HIF-1α的稳态水平。

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图3。

雷帕霉素对HIF-1活性和HIF-1α表达的相关抑制作用。用pHRE-Luc报告质粒转染PC-3细胞，24小时后，将细胞置于含2%血清的培养基中。8小时后，用100 nM雷帕霉素处理指示样品，并在常氧或缺氧条件下再培养16小时。（上面板）采集样本以测定荧光素酶活性。条形图和误差标志表示三份样品的平均值±标准偏差。（下图）采集平行样品，用α-HIF-1αMAb免疫印迹洗涤剂可溶性蛋白。去除印迹，并用PLCγ1特异性抗体进行重复，以控制样品装载。

雷帕霉素对HIF-1α转换的影响。

HIF-1α的稳态水平是HIF-1β合成和降解相对速率的函数。我们推断，用蛋白酶体抑制剂LLnV处理常氧PC-3细胞应该阻断HIF-1α的主要降解途径，从而使HIF-1α的积累速率在很大程度上是HIF-1α合成速率的函数。为了进一步探讨HIF-1α合成改变与蛋白水解改变在雷帕霉素抑制机制中的相对作用，我们将细胞暴露于缺氧16 h（左面板）或CoCl中₂在LLnV不存在或存在的情况下持续6小时（右侧面板）。缺氧诱导HIF-1α表达增加5.4倍，而CoCl₂治疗使这种蛋白质的水平增加了3.7倍（图。​（图4A）。4A级). 在这些条件下，在雷帕霉素处理的细胞中，由每种刺激激发的HIF-1α的积累减少了30%至50%。单独用LLnV（即不含雷帕霉素）预处理细胞可增强缺氧和CoCl的刺激作用₂HIF-1α表达约为两倍。值得注意的是，向培养物中添加LLnV明显减弱了雷帕霉素对缺氧或氯化钴的抑制作用₂-诱导HIF-1α积累。

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图4。

雷帕霉素对HIF-1α转换的影响。（A） 蛋白酶体抑制可拮抗雷帕霉素对低氧诱导的HIF-1α表达的抑制作用。（左面板）PC-3细胞在2%FBS中培养6小时，然后用溶剂载体、雷帕霉素（Rap）或LLnV预处理45分钟。细胞在常氧（−）或缺氧（H）条件下培养。16小时后收集细胞，通过SDS-PAGE解析可溶性蛋白。（右侧面板）PC-3细胞在所示药物治疗前在0.1%FBS中预培养16小时，然后用150μM CoCl刺激6小时₂（C） ●●●●。用α-HIF-1αMAb和α-PLCγ1抗体依次检测印迹蛋白。通过密度计定量HIF-1α蛋白的表达，并将其归一化为相应的常氧对照样品中获得的值。（B） LLnV诱导的HIF-1α积累。在无或存在100 nM雷帕霉素的情况下，在常压条件下，用10μM LLnV处理PC-3细胞指定的时间。通过免疫印迹法测定HIF-1α的表达，剥离印迹，并用α-PLCγ1抗体进行重复，以控制样品装载。所示结果代表了在三个独立试验中获得的结果。（C） 雷帕霉素对HIF-1α降解的影响。细胞在含有2%血清的培养基中培养，并暴露于缺氧过夜。然后用CHX处理细胞以阻断新的蛋白质合成，并将指示的样品同时暴露于100nM雷帕霉素。细胞在缺氧条件下维持指定的时间，HIF-1α水平通过免疫印迹法测定，如面板A所述。PLCγ1用作上述样品装载控制。

为了更具体地关注雷帕霉素对HIF-1α合成的影响，我们用LLnV处理细胞，并在常压条件下监测HIF-1的时间依赖性积累。单用蛋白酶体抑制剂治疗导致HIF-1α水平逐渐升高，可能是由于泛素化中间产物的备份，而泛素化中间体是由介导其消除的下游机制受到阻碍所致（图。​（图4B）。4B类). 再次，雷帕霉素对LLnV处理的PC-3细胞中HIF-1α的积累几乎没有抑制作用，这表明雷帕霉素抑制HIF-1HIF-1α基因转录和/或翻译并不是雷帕霉素治疗后缺氧细胞中HIF-1α积累减少的基础。

为了更直接地确定雷帕霉素对HIF-1α降解速率的影响，我们首先通过将PC-3细胞暴露于缺氧条件下诱导该蛋白的表达。然后用蛋白质合成抑制剂CHX处理细胞，以阻断HIF-1αmRNA和mRNA在低氧条件下维持4h。在CHX单独存在的情况下，HIF-1α表达在2小时后下降约50%（图。​（图4C）。4摄氏度). 在本研究中检测的所有四个时间点，这些细胞同时暴露于雷帕霉素可使HIF-1α水平降低40%至50%。总之，这些结果表明，雷帕霉素对缺氧细胞中HIF-1α表达的抑制作用主要反映了负责在氧张力降低时稳定该蛋白的机制功能受损。

mTOR转染PC-3细胞系中HIF-1激活。

通过将野生型mTOR（AmTOR）或雷帕霉素耐药mTOR突变体（AmTOR-SI）引入PC-3细胞，通过遗传方法进一步探讨了mTOR信号与HIF-1功能之间的相互作用。AmTOR-SI多肽含有²⁰³⁵→Ile取代降低突变蛋白对抑制性FKBP12-雷帕霉素复合物的亲和力(8,11). 在AmTOR-SI表达细胞中，雷帕霉素治疗抑制内源性mTOR功能；然而，这些功能应该由耐药的AmTOR-SI突变体挽救。AmTOR-WT和AmTOR-SI构建物的氨基末端都含有AU1表位标签，以便于检测重组蛋白。在初步研究中，我们证实，已知mTOR靶蛋白p70S6激酶的激活在表达AmTOR-SI-的PC-3亚克隆中对雷帕霉素具有耐药性，但在稳定表达雷帕霉素敏感AmTOR-WT蛋白的PC-3子克隆中没有（结果未显示）。

在最初的研究中，我们在PC-3细胞中稳定表达AmTOR-WT，并检测mTOR表达增加对HIF-1依赖性转录活性的影响。用pHRE-luc报告质粒瞬时转染四个独立分离的表达AmTOR-WT的亚系，以及一个雷尼利亚荧光素酶报告质粒，允许校正不同亚系之间的转染效率差异。转染细胞用雷帕霉素预处理，然后用氯化钴刺激₂诱导HIF-1依赖性转录。有趣的是，AmTOR-WT的引入增加了基础条件下和CoCl后PC-3细胞中HIF-1调节荧光素酶的表达水平₂刺激（图。​（图5A）。5A级). 如之前的CoCl实验所观察到的₂作为刺激，HRE调节荧光素酶报告基因在雷帕霉素处理的细胞中的表达降低了30%至50%。这些发现表明，PC-3细胞中mTOR活性水平的增加导致HIF-1介导的对CoCl的转录反应相应增加₂.

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图5：。

稳定转染PC-3亚系中HIF-1的激活。用编码AU1标记的野生型AmTOR（WT）或雷帕霉素耐药（Ser²⁰³⁵→Ile）AmTOR突变体（SI）。克隆亚系与pHRE-luc报告子共转染，并与雷尼利亚荧光素酶报告子（作为转染效率的对照）。24小时后，将培养基改为补充0.1%FBS的RPMI 1640，并将细胞再培养6小时。用溶剂载体或100nM雷帕霉素预处理细胞30分钟，然后用150μM CoCl刺激16小时₂或缺氧。细胞裂解物接受双重荧光素酶分析，样本值根据转染效率的变化进行标准化雷尼利亚荧光素酶活性。误差条表示重复样本的方差。通过α-AU1免疫印迹法对等分的细胞提取物进行重组AmTOR蛋白表达分析（上面板）。（A） AmTOR-WT转染的亚克隆。（B） AmTOR-WT-和AmTOR-SI-转染亚克隆的比较。（C） 将PC-3细胞和稳定转染的WT或SI亚系在含有0.1%血清的培养基中预培养8小时，然后用载体或雷帕霉素处理。30分钟后，缺氧刺激细胞16小时。用α-HIF-1αMAb和α-PLCγ1抗体依次免疫印迹洗涤剂可溶性蛋白。通过密度分析测定HIF-1α水平，并计算雷帕霉素对每个样本集缺氧诱导HIF-1β表达的抑制百分比。在上图中，用α-AU1-MAb免疫印迹细胞提取物的单独等分试样，以检测AmTOR WT或AmTOR SI蛋白的表达。

为了获得mTOR在缺氧PC-3细胞中作为HIF-1激活的阳性调节剂的遗传证据，我们接下来测试了雷帕霉素对两个AmTOR-SI转染的PC-3亚克隆中HIF-1依赖性报告基因表达的影响。如图所示。​图5B，第5页雷帕霉素暴露仅略微抑制转染耐药mTOR突变体的细胞中低氧诱导的荧光素酶表达。这些结果证实了mTOR是前列腺癌细胞系HIF-1功能的上游调节器的假设。一个意外但一致的观察结果是，与相应的AmTOR-WT转染体相比，表达AmTOR-SI-的亚克隆与对照PC-3细胞相比，HIF-1依赖性荧光素酶活性没有升高。后一项观察表明²⁰³⁵→使AmTOR-SI突变体对FKBP12-雷帕霉素耐药的替代也改变了该蛋白在宿主细胞中过度刺激HIF-1功能的能力。

在随后的研究中，我们检测了AmTOR-WT或AmTOR-SI表达对CoCl的影响₂-诱导PC3细胞HIF-1α积累。正如预期的那样，该反应对表达AmTOR-WT的PC-3细胞中的雷帕霉素仍然敏感（图。​（图5C）。5摄氏度). 然而，有趣的是，表达AmTOR-WT的PC-3亚克隆在常氧条件下始终显示HIF-1α的基础水平升高。这一发现与HIF-1依赖性报告基因表达的基础水平在这些细胞中也升高的观察结果相关（图。5A和B). 用两个表达AmTOR-SI的亚克隆获得的HIF-1α免疫印迹结果也与HIF-1依赖性报告基因检测中发现的结果一致。虽然低氧诱导的HIF-1α蛋白表达略低于表达AmTOR-WT的细胞系中观察到的表达，但在SI5.1和SI5.2克隆中，这种反应明显对雷帕霉素耐药。因此，这些结果表明雷帕霉素抑制低氧诱导的HIF-1α积累与mTOR依赖性信号功能的破坏直接相关。

ODD结构域在依赖mTOR的HIF-α稳定中的作用。

控制HIF-1α稳定性的氧调节信号收敛于ODD域(41). 为了研究ODD结构域在mTOR调节HIF-1α稳定性中的作用，我们用编码G4的DNA-结合域的表达载体瞬时转染PC-3细胞，并与HIF-1β残基498-603融合。HIF-1α片段包含ODD结构域的羧基末端一半（图。​（图6A）6A级)并含有关键的Pro-564残基，该残基用于正常氧细胞中的羟基化和随后的VHL结合(27,48). 作为对照，我们使用了G4-HIF-1α（残基700到826）融合蛋白，该融合蛋白跨越HIF-1β的羧基末端反式激活域。转染后，在存在或不存在100 nM雷帕霉素的情况下用缺氧刺激PC-3细胞，并用G4特异性单克隆抗体免疫印迹法测定G4融合蛋白的表达水平（图。​（图6B）。6亿). 正如预期的那样，G4-HIF-1α（残基700至826）融合蛋白在PC-3细胞中组成性表达，表达水平既没有因缺氧而增加，也没有因雷帕霉素而降低。转染G4-HIF-1α（残基498-603）表达质粒的细胞获得了截然不同的结果。这些细胞暴露于低氧条件下会显著增加该融合蛋白的稳态水平，并且ODD域蛋白的表达对雷帕霉素在常氧和低氧条件中的抑制敏感。这些结果表明，HIF-1α的分离ODD结构域足以在常氧条件下靶向蛋白酶体，并在细胞暴露于低氧类药物期间实现mTOR依赖性稳定。

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图6。

ODD结构域在mTOR调节HIF-1α表达中的作用。（A） HIF-1α功能域示意图。HIF-1α的结构域包括基本螺旋-环-螺旋（bHLH）和PER-ARNT-SIM（PAS）基序、羧基末端反式激活域（TAD N和C）和ODD域。监管的Pro-402和Pro-564残基（见正文）也突出显示。（B） 雷帕霉素对氯化钴的影响₂-诱导G4-HIF-1α蛋白的稳定。用空载体（模拟）或编码所示G4-HIF-1α融合蛋白的质粒瞬时转染PC-3细胞。24小时后，将转染的细胞在含2%血清的培养基中培养2小时，并将指示的样品在不存在或存在100nM雷帕霉素的情况下暴露于缺氧16小时。用SDS-PAGE分离洗涤剂可溶性蛋白，并用α-G4-MAb进行免疫印迹，然后添加PLCγ1特异性抗体作为对照。

讨论

调节HIF-1α表达的信号转导事件，以及随后的血管内皮生长因子以及其他HIF-1调节基因，目前正受到严格审查。本研究的结果证实并扩展了早期的报道，即雷帕霉素抑制缺氧癌细胞中HIF-1α的稳定和HIF-1的转录活性(50). 此外，我们提供了遗传学证据来支持以下结论：雷帕霉素靶蛋白mTOR是缺氧或低氧药物CoCl激活HIF-1的正调节因子₂.

对现有数据的综合分析表明，至少有两条综合信号通路促进哺乳动物细胞中HIF-1α的积累。第一条途径由缺氧或氯化钴触发₂并涉及一系列PHD的抑制，这些PHD修饰HIF-1α的Pro-564和Pro-402(5,21,22,27,41). 第二种途径由多肽生长因子或致癌突变（例如。，PTEN公司基因丢失）并导致PI 3-激酶及其下游靶点AKT和Rac GTPases的激活(17,23,26,29,50,52). 尽管似乎很明显，缺氧在降解水平而非合成水平上调节HIF-1α的转换(26,44)PI3-激酶依赖信号似乎调节缺氧肿瘤细胞中HIF-1α的合成和稳定(26,52).

这里的发现大大加强了先前的观察，即mTOR依赖信号刺激缺氧或低氧药物暴露细胞中HIF-1α的积累和HIF-1介导的转录(50). 正如PI 3-激酶的情况一样，我们的结果表明，mTOR的雷帕霉素敏感性功能对于HIF-1α的积累并不重要，但对于该蛋白的最大表达以及缺氧条件下HIF-1依赖性基因的最佳表达是必需的。PI3-激酶和mTOR都是HIF-1激活的放大器，而不是必要的触发物，这与这两种信号激酶位于同一信号通路的模型是一致的(33,35,38). 然而，支持PI 3-激酶和mTOR之间功能联系的证据尚不明确，在现阶段，我们不能排除PI 3-激酶与mTOR通过平行途径在HIF-1调节机制上聚合的另一种可能性。mTOR作为营养传感器的拟议功能(16,37)可能与HIF-1功能特别相关，因为氧张力降低几乎不可避免地伴随着哺乳动物组织中葡萄糖和氨基酸的有限供应。

我们的初步研究表明，用雷帕霉素预处理PC-3细胞可以强烈抑制缺氧和氯化钴引起的HIF-1依赖性报告基因表达的增加₂这些结果与Zhong等人报告的结果基本一致，他们观察到雷帕霉素暴露抑制了表皮生长因子和佛波酯-肉豆蔻酸醋酸酯诱导的TSU前列腺癌细胞VEGF分泌，VEGF是一种HIF-1调节的基因产物(50). 另一方面，我们发现雷帕霉素抑制PC-3细胞中HIF-1介导的基因转录似乎与早期的研究不一致，该研究表明雷帕霉素暴露对缺氧诱导的血管内皮生长因子启动子活性没有影响-Ras公司-转化NIH 3T3细胞(29). 后一研究结果表明，mTOR不是向HIF-1传递激活信号的专性中间产物，宿主细胞类型以及特定的致癌背景在细胞对雷帕霉素抑制mTOR的反应中起决定性作用。如果雷帕霉素或其他PI 3-激酶/mTOR抑制剂被批准作为实体瘤患者的细胞抑制剂和/或细胞毒剂临床使用，那么进一步了解控制HIF-1α转换的信号输入将至关重要。这些信息可能有助于选择最有可能从雷帕霉素或相关药物治疗中获益的患者。

如前所述，我们观察到缺氧或氯化钴₂-PI3-激酶抑制剂LY294002的细胞治疗强烈抑制了诱导的HIF-1活化(50). LY294002对HIF-1α积累的抑制作用(50)和HIF-1依赖性转录（图。​（图11在本研究中）与PI3-激酶参与缺氧诱导的HIF-1信号传导的观点一致(10,23,29,52). 然而，LY294002不是PI 3-激酶的特异性抑制剂；事实上，该药物抑制mTOR激酶活性的浓度与抑制PI3-激酶所需的浓度相似(9). 因此，尽管PI 3-激酶活性与生长因子对HIF-1α的刺激密切相关(26)，其在低氧诱导的HIF-1α稳定中的作用需要进一步研究。

雷帕霉素对HIF-1α积累的抑制作用表明，该药物要么降低了缺氧细胞中HIF-1β的合成速率，要么增加了HIF-1γ的降解速率。通过使用蛋白酶体抑制剂阻断HIF-1α降解的主要途径，我们发现雷帕霉素处理对降低血清（2%或0.1%FBS）条件下培养的PC-3细胞中HIF-1 a的积累几乎没有影响。另一方面，当CHX阻止HIF-1α蛋白的持续合成时，雷帕霉素暴露显著降低缺氧PC-3细胞中HIF-1β的稳定性。总之，这些结果表明，雷帕霉素主要通过干扰缺氧条件下促进HIF-1α稳定的机制，降低PC-3细胞中HIF-1α的稳态水平。

根据Semenza及其同事最近的报告，雷帕霉素对HIF-1α稳定性的负面影响有些出乎意料(26). 这些研究人员证明，刺激正常氧细胞中的HER2受体可通过涉及PI 3-激酶、AKT和mTOR的途径增加HIF-1α的表达。然而，与目前在缺氧PC-3细胞中的发现相反，HER2受体介导的HIF-1α积累主要是通过HIF-1β合成的上调发生的，这主要是由于HIF-1γmRNA翻译的刺激。这些作者进一步证明，HIF-1αmRNA的5′-非翻译区含有一个翻译控制元件，该元件被HER2受体占据上调，并且对雷帕霉素的抑制敏感。后一结果强烈暗示mTOR是HIF-1α翻译的阳性调节物，这一情况很容易让人联想到mTOR在有丝分裂原刺激细胞中核糖体和其他多嘧啶束相关蛋白的合成中的刺激作用(16). 因为缺氧在降解水平而非合成水平影响HIF-1α的周转(26,44)mTOR的翻译效应可能支持但不应驱动缺氧细胞中HIF-1α表达的增加，尤其是在限制生长因子和营养物质可用性的条件下。因此，我们发现雷帕霉素干扰缺氧条件下HIF-1α的稳定具有特别重要的意义，并强烈表明mTOR依赖性信号在合成和蛋白降解水平上促进HIF-1的表达。刺激的性质（即多肽激素刺激与缺氧）以及细胞背景可能决定了mTOR的这些信号输入中的哪一个对不同肿瘤中HIF-1α蛋白的增加起主导控制作用。

mTOR在缺氧/CoCl转导中的重要性₂-PC-3细胞中野生型或突变mTOR结构表达的遗传实验结果强调了HIF-1α的启动信号。野生型mTOR的过度表达显著增加了HIF-1依赖性报告基因的表达水平，这是由于工程细胞系暴露于低氧灭活剂CoCl引起的₂（图。​（图4A），4A级)以及缺氧本身（未公布的结果）。这些结果表明，PC-3细胞内mTOR活性的内源性水平限制了HIF-1依赖性转录反应对这些刺激的程度。此外，雷帕霉素耐药的AmTOR-SI突变体在同一细胞中的表达消除了雷帕霉素对CoCl的抑制作用₂-刺激HIF-1α积累和HIF-1依赖性转录。因此，通过AmTOR-SI-转染PC-3亚系获得的结果为雷帕霉素抑制缺氧/CoCl的结论提供了遗传学证据₂-通过抑制单个靶蛋白mTOR诱导HIF-1功能。

用一组G4-HIF-1α融合蛋白进行的转染实验表明，ODD结构域是mTOR信号通路的一个重要靶点，该通路在低氧张力下增强HIF-1β的稳定性。在正常毒性的PC-3细胞中，由于蛋白酶体介导的融合蛋白降解，G4-HIF-1α（残基498-603）结构的表达相对较低。该结构包含ODD结构域的羧基末端一半，并包含关键的Pro-564残基，该残基在缺氧细胞中经历PHD依赖性羟基化(41). 细胞暴露于缺氧或PHD抑制剂CoCl₂（未发表的结果）导致HIF-1α显著稳定，这与ODD结构域，特别是Pro-564周围区域在正常氧张力下使HIF-1β蛋白不稳定的模型一致(5,6,21,27,48). 雷帕霉素强烈抑制低氧诱导的G4-HIF-1α表达增加（残基498-603），而含有HIF-1的氨基或羧基末端片段的G4融合蛋白的表达既不可低氧诱导，也对雷帕霉素不敏感（见图。​图6B6亿和未发布的结果）。我们从这些发现中得出结论，在缺氧条件下促进HIF-1α稳定的mTOR依赖性信号主要（如果不是全部）影响ODD结构域。此外，雷帕霉素对嵌合G4-HIF-1α（残基498-603）蛋白表达的抑制作用证实了以下结论：在缺氧/CoCl环境下₂刺激后，该药物不仅仅是作为HIF-1αmRNA翻译的5′-非翻译区域依赖性抑制剂。

mTOR有助于缺氧细胞中HIF-1α稳定的确切机制尚不清楚。考虑到控制HIF-1α稳定性的氧反应机制的复杂性，该途径中潜在的mTOR底物列表非常广泛。基于上述结果，我们认为ODD域是控制HIF-1α稳定性的mTOR和氧依赖信号的潜在交叉点。ODD结构域富含丝氨酸和苏氨酸，并且包含许多代表mTOR激酶结构域潜在靶点的Ser/Thr-Pro位点(7,8). 因此，我们检测了一系列谷胱甘肽的能力S公司-在免疫复合物激酶分析中用作mTOR底物的转移酶-HIF-1α融合蛋白。结果表明，ODD结构域是HIF-1α在体外被mTOR检测到磷酸化的唯一区域（未发表的结果）。然而，mTOR测定ODD磷酸化的化学计量比很低，需要进一步研究来确定这一发现的重要性。我们也不能排除mTOR调节修饰HIF-1α的PHD的活性或干扰VHL泛素E3连接酶复合物对脯氨酸羟基化的HIF-1α的识别的可能性。

总之，本研究确定mTOR是缺氧或低氧药物作用下细胞中HIF-1依赖性基因转录的正调控因子。我们的结果表明，mTOR在信号传递中起着关键作用，这些信号导致哺乳动物细胞适应缺氧和营养不良的环境条件。值得注意的是，对芽殖酵母的研究已经确定了mTOR同源基因，即TOR1p和TOR2p，它们是协调营养物质可用性和酵母生长的途径的中央调节器(37). 对隔离在身体组织中的营养缺乏细胞的特殊需求可能为将mTOR插入后生动物的缺氧反应途径提供了进化驱动力。最后，我们的发现进一步支持了mTOR是抗癌治疗的有趣靶点的观点(30). 如果雷帕霉素或其他mTOR抑制剂被证明是发展中肿瘤低氧适应的有效抑制剂，这些药物可能会对人类癌症患者的肿瘤生长、侵袭性和转移潜能产生显著影响。

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参考文献