脊椎动物视紫红质和绿藻通道视紫红素对神经和网络活性的快速无创激活和抑制

摘要

一理解神经活动和发育之间的关系以及神经回路活动和特定行为之间的关系的主要挑战是能够同时控制大量神经元或单个神经细胞区域的活动。最近，有研究表明，神经元回路可以通过表达突变离子通道或G蛋白偶联受体（GPCR）进行调控。例如，转基因K的区域表达⁺通道输入果蝇能够降低靶细胞（即肌肉、神经元、感光细胞）的兴奋性(1). 通过将肽别构抑素与其外源性表达的受体结合，可以实现皮层神经元的沉默(2). 最近，Zemelman等。(三)优雅地证明了由果蝇感光基因（即arrestin-2、视紫红质和G蛋白α亚单位）可诱导海马神经元动作电位放电。当配体门控离子通道，如辣椒素受体、薄荷醇受体、嘌呤能受体或光可控K⁺通道阻滞剂用于控制海马神经元的放电(4,5). 然而，这些技术在控制神经元功能方面的应用，尤其是在神经回路和活体动物中，由于其相对较慢的时间进程、要表达的结构的复杂性或应用和清除配体的要求，受到了限制。为了克服这些局限性，我们开发了分子探针，可以在毫秒时间尺度上使细胞超极化或去极化，并用于完整的脊椎动物系统中检测行为。

为了使体树突状膜超极化或抑制突触递质释放，GPCR大鼠视紫红质4（RO4），脊椎动物视紫红素家族的一员(6)，通过Gi/o途径通过增加体树突状K调节兴奋性⁺和降低突触前钙²⁺使用神经元的电导。为了使细胞膜去极化，从绿藻中导入视紫红质（ChR2）莱茵衣藻，光直接选通的阳离子选择性通道(7)，表达为产生高钠⁺电导。这些光激活开关的特性得到了广泛的表征，并表明其在调节培养海马神经元的神经元兴奋性和突触传递方面是有用的。然后将它们引入胚胎鸡脊髓，并证明能够控制分离脊髓和活胚胎的自发节律活动。

材料和方法

质粒构建。用于构建ChR2（1-315）-GFP、RO4和毒蕈碱乙酰胆碱受体（mAChR）-M2表达结构和SinRep（nsP2S⁷²⁶)携带RO4和ChR2（1-315）病毒结构的dSP-EGFP参见支持文本，发布为支持信息在PNAS网站上。Sindbis病毒载体SinRep（nsP2S⁷²⁶)和助手DH-BB由P.Osten（海德堡马克斯普朗克医学研究所）亲切提供(8)A.Huber（德国卡尔斯鲁厄卡尔斯鲁赫大学）编写的RO4（GenBank登录号：Z46957）(9).

细胞培养。培养、维持和转染人胚胎肾（HEK）293细胞（tsA201细胞）和低密度和自适应海马神经元(10,11). 为了检测RO4和ChR2的分布，采用磷酸钙法转染神经元(12).

病毒的产生和感染。根据Invitrogen的指示（Sindbis表达系统）制备Sindbis伪病毒。病毒滴度≈1×10⁸单位每毫升储存在-80°C。对于神经元感染，将病毒溶液添加到24孔板盖玻片上培养的海马神经元中。10小时后检测到表达，24小时后达到最大表达。

免疫细胞化学和图像采集。海马神经元和脊髓整体支架的转染、免疫染色和图像采集见支持文本.

视网膜对RO4-或ChR2-E表达细胞的应用。实验前2分钟，全视网膜[100 nM（Sigma）]浴敷足以光激活所有受试制剂中的两种蛋白质，即HEK293细胞、培养的海马神经元和分离的鸡脊髓。鸡胚中RO4和ChR2的光介导活化不需要外源性应用视网膜化合物在ovo中。请参阅支持文本检测其他视网膜化合物。

电生理学和数据分析。所有的全细胞补丁灯记录均按所述进行(7,11,13). 记录解决方案和条件见支持文本.

贴片照明是通过TILL Photonics（德国普莱格）Polychrome II单色仪实现的，该单色仪包含一个输出为250-690 nm和475 nm的75瓦氙气短弧灯，用于激发ChR2或RO4。光强为1×10^-6W由功率计测量（加利福尼亚州圣克拉拉市科伦特），光源由EPC9控制。光线和灌注痕迹在脉冲软件。

脊髓的准备和测量。 在ovo中Hanson和Landmesser描述了电穿孔、运动轴突成像、孤立脊髓标本中自发爆发事件的记录以及单位活动的量化(14).

使用ANOVA测试整个实验的统计显著性伊戈尔软件。标准误差以平均值±SEM表示。

结果

脊椎动物视紫红质可用于抑制神经元兴奋性和突触传递。脊椎动物视紫红质与G蛋白转导蛋白偶联，其α亚基属于Gi亚家族(15)从而提高了哺乳动物视紫红质与其他Gi/o家族成员结合的可能性。在神经元中，百日咳毒素（PTX）敏感的Gi/o通路激活G蛋白内向整流钾通道（GIRKs）并抑制突触前电压门控钙²⁺通道(16). GIRK通道主要表达在树突上，可以使神经元超极化(17). 突触前钙²⁺通道控制递质释放，并通过Gi/o耦合受体抑制钙²⁺流入和变送器释放(18).

为了确定脊椎动物视紫红质是否可以作为光激活开关来降低突触后神经元兴奋性和突触前递质释放，RO4与GIRK通道亚基1和2或P/Q型Ca共表达²⁺由α组成的通道₁2.1, β_1亿、和α₂δ亚基。mAChR M2（mAChR-M2）也被表达，作为GIRK和突触前钙的G蛋白调节的阳性对照²⁺通道通过Gi/o-PTX敏感GPCR，因为它同时调节GIRK和P/Q型Ca²⁺通道体内在异源表达系统中(17,19). 我们首先在HEK细胞中证明，这两种通道都是通过RO4的光激活来调节的，其方式与它们通过mAChR-M2的调节非常相似。

通过光或AChR激动剂卡巴胆碱（Carb）激活GPCR增加GIRK介导的K⁺按可比数量计算的电流(图1一和B类)具有类似的活化和失活动力学(图1C类和D类). 重要的是，先前使用PTX阻止了RO4的光激活，这表明脊椎动物视紫红质激活GIRK通道是通过PTX敏感途径介导的(图1B类). 长时间光照或配体暴露期间的脱敏量适中，两者之间具有可比性[8.7±0.8%(n个=4）mAChR-M2和8.7±1.1%(n个=4）对于RO4]，表示R04可以在长时间内被光激活。当RO4和mAChR-M2与P/Q型Ca共存时²⁺通道，光导致钙的可逆抑制²⁺电流(图1E类和G公司和图5，发布为支持信息在PNAS网站上）。光或碳化物导致激活的电压依赖性向更去极化电位的类似转变(图1F类). 此外，在-10到+65 mV（数据未显示）的电压范围内，在测试脉冲（图5）前不久施加高阳性预脉冲，类似于Carb引起的抑制，从而逆转了光对G蛋白的抑制作用。此外，PTX抑制了光介导的通道抑制（图5）。RO4和mAChR-M2之间抑制开始和抑制逆转的时间常数也具有可比性（τ_在=3-7秒，τ_远离的≈20-60秒，图1G公司和H（H）). 因此，脊椎动物视紫红质调节GIRK和P/Q型钙²⁺通过与mAChR具有类似功效和活化与失活动力学的PTX敏感途径的通道。

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图1。

脊椎动物视紫红质调节GIRK和P/Q型钙²⁺通过Gi/o-PTX敏感途径的通道。(一)K（K）⁺光刺激前后HEK293细胞中GIRK1/2通道与RO4或mAChR-M2共表达的电流痕迹(左侧)或10μM Carb应用(赖特). 电流由从-100到+50 mV的500 ms电压斜坡引起(B类)比较有无5 nmol PTX时GPCR诱导的电流增加。(C类)GPCR介导的GIRK电流激活的时间进程轨迹。GIRK电流记录为-60 mV(D类)GPCR激活前后GPCR诱导GIRK电流变化的时间常数比较。(E类)巴²⁺P/Q型钙的电流迹线²⁺通道（α₁2.1, β_1亿、和α₂光刺激前后HEK293细胞中δ亚单位）与RO4或mAChR-M2共表达(左侧)或10μM Carb应用(赖特). (F类)GPCR诱导P/Q型Ca活化曲线电压依赖性的去极化位移²⁺电流。通过从-10到+65 mV的5毫秒长的5毫伏电压阶跃，从-60 mV的保持电位引出电流。绘制相对尾电流与电压脉冲的关系图。(G公司)GPCR介导的P/Q型Ca抑制的时间进程轨迹²⁺电流。文学士²⁺电流由-60至+20 mV的电压脉冲激发，每秒钟测量一次(H（H）)GPCR激活前后GPCR诱导P/Q型通道电流变化的时间常数比较。在所有实验中，括号中的数字表示实验数量和统计显著性(^*,P（P）< 0.05;^**,P（P）<0.01，方差分析）。

因为RO4激活GIRK，GIRK控制突触后的兴奋性，并抑制Ca²⁺钙通道_v（v）我们接下来研究了在培养的海马神经元中，RO4的光激活是否能使神经元体树突超极化，从而减少神经元放电并抑制突触前钙离子释放²⁺流入调节短期突触可塑性，如配对脉冲促进。外源性表达的RO4定位于体树突，并运输到70-80%的突触位点，与突触前神经元标记物synaptobrevin II共定位(图2一). RO4的光激活在ms内诱导9-mV超极化，与内源性GABA激活诱导的超极化相当_B类50μM巴氯芬受体(图2B类和C类). 超极化在光照期间是稳定的（测量时间长达30秒），但在关闭光照时迅速逆转(图2B类和D类). 超极化和复极的时间常数比HEK293细胞快得多（比较图。​图2D类2D类和​和1C类)1C类)可能是由于内源性蛋白质的影响，例如RGS蛋白质，加速G蛋白的GTPase活性。这些观察结果与所描述的Gi/o偶联受体对神经元膜变化的作用类似(20). 更重要的是，光诱导的超极化能够减少去极化电流脉冲期间产生的动作电位数量(图2E类和F类).

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图2。

脊椎动物视紫红质在培养海马神经元中的功能表达和表征。(一)培养海马神经元中RO4和突触素的克隆化。(左侧)转染RO4的低密度海马培养物神经元的荧光模式显示点状染色。用抗RO4抗体检测RO4，用Alexa 488-偶联二级抗体观察RO4。(居中)海马细胞用抗突触素II抗体染色，并用Alexa 568-偶联二级抗体观察。(赖特)RO4和synaptobrevin II染色重叠。黄色表示共同定位。(B类)长时间内RO4感应电压变化(上部)和短(下部)光脉冲。(C类)平均GPCR（RO4，GABA_B类)-诱导培养海马神经元超极化。在整个实验过程中，GABA_B类应用50μM巴氯芬（Bacl）激活受体。(D类)GPCR的时间进程（RO4，GABA_B类)-诱导超极化和关闭灯或冲洗巴氯芬后超极化恢复。(E类)RO4光激活之前和期间培养海马神经元电流诱导（30 pA）神经元放电的电压轨迹。(F类)比较RO4光激活前后神经元电流注入后测得的动作电位数量。(G公司)在表达RO4的自适应海马培养物中测量的EPSC在光照射前、期间和之后的EPSC振幅的比较。自闭性海马神经元中的EPSCs由-60到+10 mV的2 ms电压脉冲激发(H（H）)GPCR（RO4，GABA）的比较_B类)-在自闭性海马神经元中测定诱导的EPSC抑制。(我)GPCR（RO4，GABA）的时间常数_B类)-诱导EPSC抑制并从抑制中释放。如中所述，每5秒激发一次EPSCG公司. (J型)RO4光激活前后，由-60至+10 mV的2 ms电压脉冲诱发的独立EPSC轨迹，间隔50 ms（20 Hz刺激）。(K（K）)GPCR（RO4，GABA）前后配对脉冲促进的比较_B类)激活20-Hz刺激方案。将第二个EPSC的振幅与第一个EPSC进行比较。

因为RO4似乎定位于突触并抑制P/Q型Ca²⁺我们研究了RO4的光激活是否可以用于控制突触前功能。我们分析了光照前后的促进特性，并将其与激活GABA的效果进行了比较_B类巴氯芬受体(图2G-K公司). RO4的光激活使兴奋性突触后电流（EPSC）振幅降低40%，而GABA的激活使EPSC振幅降低60%_B类受体被激活(图2G公司和H（H）)大概是因为量子含量的减少(21). 这两种受体的这些效应的时间常数是可比较的[τ_在=0.3-0.6秒，τ_远离的≈4-6秒(图2我)]. 正如预期的那样，如果这种EPSC振幅的降低是由量子含量的减少引起的，那么两种受体类型的配对脉冲促进作用都会增加(图2J型和K（K）). 综上所述，这些结果表明，RO4的光激活可以通过体树突状膜的超极化以及通过减少递质释放来控制突触前细胞的兴奋性。

绿藻ChR2可用于在快速（ms）时间尺度上精确驱动神经元放电。ChR是一种微生物型视紫红质，具有固有的光控阳离子电导。ChR1来自莱因哈迪是质子特有的(22)而ChR2是一个对H具有电导的选择性较低的阳离子通道⁺≫纳⁺>K（K）⁺>钙²⁺由于ChR2的电导高于ChR1的电导，并且C末端截短型ChR2（1-315）与全长蛋白一样活跃，因此所有实验都是在ChR2（1-3）的C末端融合到GFP的ChR2（1-315）片段进行的(7). 为了测试ChR2在被光激活时是否能起到去极化细胞的作用，ChR2（1-315）首先在HEK293细胞中表达并广泛表征（图6，发表于支持信息在PNAS网站上）。发现ChR2的光激活可在10 ms内引起10-25 mV的去极化，在200 ms内发生复极。因此，ChR2应能充分去极化神经元以激发动作电位。

当ChR2在海马神经元中外源性表达时，它似乎同时定位于体树突和突触素2免疫染色所定义的50-70%的突触部位(图3一). 在90%以上的实验中，5毫秒的光激活足以引发动作电位，而较长的光暴露会导致神经元持续的阈下去极化(图3B类). 当以5 Hz的频率刺激时，大多数刺激都会诱发动作电位，但随着刺激频率的增加，触发阈下EPSP的比例增加(图3C类和D类). 我们接下来测试突触前表达的ChR2是否能够触发突触后神经元的突触传递。分析了成对的海马神经元，其中一个表达GFP-ChR2的神经元与一个在自身躯体上形成自闭症的ChR2阴性神经元突触(图3E、 E类₇图表）。我们发现突触前神经元的光激活可以成功触发抑制性突触后电流（IPSC）和EPSC(图3E类). 光激活电流的振幅不同于电刺激突触后神经元所产生的自闭电流(图3E类)表明它们是通过不同的神经元接触介导的。在七个实验中的三个实验中，光激活的突触后EPSC足以触发高达20 Hz的体-树突状放电。在剩下的四个实验中，观察到阈下EPSP(图3E、 E类_三). 光诱导突触后IPSC引起体树突状超极化(图3E、 E类₆). 正如预期的那样，IPSC/EPSC振幅和超极化或去极化程度在所分析的神经元对之间有所不同，因为它们取决于突触前和突触后神经元之间形成的突触接触数量(图3F类和G公司).

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图3。

绿藻ChR2在培养海马神经元中的功能表达和特征。(一)培养海马神经元中ChR2和突触素的克隆化。(左侧)转染GFP-ChR2的低密度海马培养物神经元的荧光模式显示点状染色。(居中)海马细胞用抗突触素II抗体染色，并用Alexa 568-偶联二级抗体观察。(赖特)GFP-ChR2和synaptobrevin II染色重叠。黄色表示同位化。(B类)随着持续时间的增加，ChR2诱导培养海马神经元对光刺激的神经元放电的电压轨迹。(C类)不同频率光刺激下培养海马神经元ChR2诱导神经元放电的电压轨迹。(D类)在表达ChR2的神经元中测量的动作电位数量。动作电位由一系列10个不同光刺激频率的刺激激发，光持续时间为5ms(E类)ChR2的光激活在兴奋性(上部)或抑制(下部)突触前神经元诱导成对突触后神经元的激活或抑制。(E1级和E4类)EPSC公司(上部)或IPSC(下部)由突触后自闭神经元中-60至+10 mV的2 ms电压脉冲引发。(E2级和E5型)表达ChR2的兴奋性和抑制性突触前细胞的光激活诱导EPSC(上部)或IPSC(下部)突触后自闭神经元。(E3公司)突触前（兴奋性）光致尖峰或阈下去极化(插入)单个5毫秒光脉冲后突触后神经元的(左侧)或10-Hz/5-ms光刺激协议(赖特). 施加了五个光脉冲。(电子6)单次5ms光脉冲后，突触前（抑制）光诱导突触后神经元超极化。(第7页)分析的神经元电路示意图。灰色表示突触前神经元表达ChR2。(F类)光诱导EPSC或IPSC的平均振幅。(G公司)当去极化不足以触发动作电位时，光诱导超极化（IPSP）或去极化（EPSP）的平均振幅。

RO4和ChR2的激活可用于控制分离的完整脊髓和活胚胎的自发活动。我们的下一个目标是证明这些光敏蛋白可以用于控制整个动物制剂中的回路行为。早期胚胎雏鸡脊髓表现出有节奏的自发爆发活动，这是由运动神经元与GABA能和甘氨酸能中间神经元之间的反复兴奋性连接产生的，所有这些神经元在发育的这个阶段都具有兴奋性(23-25). 最近，有研究表明，这种早期自发活动的正常模式和频率是雏鸡适当寻找运动轴突路径所必需的(14)以及开发能够在小鼠类似运动的活动中实现适当的屈肌-伸肌和左右相位的脊髓电路(26).

为了评估这种网络活动，特别是自发爆发的频率，是否可以通过光非侵入性地控制，在CMV启动子的控制下，将GFP-ChR2或GFP-RO4的构建物电穿孔到16期（胚胎第2-3天）鸡胚的脊髓中在ovo中在第26阶段（胚胎第4.5-5天），制备了分离的脊髓-脐肢，发现这些结构在许多神经元中表达，包括运动神经元和中间神经元（图7，发表于支持信息并可通过改变电穿孔协议在腰椎或颈髓中选择性表达。腰椎运动神经抽吸电极记录(图4一和B类)发现与对照胚胎一样，电穿孔胚胎表现出每4分钟几次爆发(图4B类和C类) (25). 因此，电穿孔方案和这些结构在几天内的表达似乎对产生这种活动的脊髓回路的发育没有任何不利影响。也可以检测到单个运动神经元在爆发之间和发作之间的异步放电(图4B类，箭头）。当暴露在连续光下时(图4C类在腰部水平用ChR2电穿孔后，该脊髓的豆状核间期缩短至<1分钟。然而，与对照组自发发作相比，其节律性较差，由单次发作组成(图4D类 上部). 相比之下，应用3s光脉冲能够在自发发作后不久引发正常的三次突发发作(图4D类 下部)在所示的例子中，重复这种脉冲可以以精确的频率驱动情节(图4C类，），间隔2分钟。扩展的时基跟踪(图4E类)研究表明，光首先导致腰椎运动单位放电增加，随后导致与非电穿孔胚胎中的自发发作非常相似的突发。然而，当ChR2的表达仅限于颈髓时，腰椎运动神经记录显示，通过产生从颈部水平传播的发作，也有可能在腰椎单位活动之前不增加的情况下通过光驱动腰椎脊髓发作(图4E类和F类). 因此，光，如之前所示的电刺激(24,25)，可通过激活局部腰椎中间神经元和运动神经元或激活多个遥远的脊髓节段的神经元来诱发发作。

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图4。

RO4和ChR2可用于调节离体鸡胚脊髓和活胚胎中自发节律活动的频率。(一)显示记录吸引电极位置的分离鸡脊髓制备图；用ChR2或RO4电穿孔的区域以灰色显示。(B类)从ChR2腰电穿孔胚胎的运动神经进行的电记录显示在缺乏光照的情况下发生了两次对照发作(上部)显示了单集的扩展时基轨迹(下部). 注意到许多运动轴突同步发射和单个运动轴突异步发射的爆发。(C类)腰椎电穿孔ChR2胚胎在长时间连续光（圆圈）或3-s光脉冲（三角形）照射下爆发发作的间隔（min）图；填充符号表示在有光的情况下引发的插曲，开圆圈表示在没有光的条件下发生的插曲。(D类)显示连续光照几分钟内发生的插曲（用括号表示）的电子录音(上部)或由星号位置的3s光脉冲引发(下部). (E类)非电穿孔胚胎自发爆发前单位活动的比较(顶部)或者当ChR2在腰椎中选择性表达时，被光诱导(中部)或颈绳(底部). 曝光时间用虚线表示。(F类)对照胚胎和一个在颈部或腰部水平电穿孔的胚胎在光照3s期间发生的运动单位活动百分比变化条形图。(G公司)25-26期胚胎轴向运动的频率在ovo中在475nM光照或不光照条件下，将ChR2电穿孔到颈髓节段后3天。(H（H）)当暴露于不同重复率（三角形）的长间隔连续光（圆圈）或3-s光脉冲时，腰椎水平上用RO4电穿孔的胚胎破裂间隔图；填充符号表示在有光的情况下发生的事件，开放符号表示在没有光的情况中发生的事件。(我)短光脉冲激活RO4会触发突发事件。(顶部)在自发发作（第1次）后，2秒的光脉冲能够触发提前发作（第2次）；两者都以扩展的时基显示中部和底部（更多详细信息请参阅文本）。(J型)自发发作或RO4光激活诱发的第一次发作之前的运动单位活动变化条形图。(K（K）)光激活RO4可以同步脊髓运动神经元的爆发行为。RO4腰椎电穿孔脊髓的左右两侧在中线手术分离时表现出独立（异步）的节律（顶部一对轨迹）。然而，光刺激停止后触发的脉冲导致同步（底部一对迹线）。LS3，腰椎节段3；脊髓神经。

评估光是否可以用于驱动完整胚胎的节律活动在ovo中，轴向运动，与电记录的活动片段精确相关(14)在没有激活颈部电穿孔ChR2的红灯下拍摄。当通过外壳中的窗口发出激活ChR2所需波长的几个光脉冲时，每个光脉冲都会引发明显的运动发作。此外，连续几分钟的光线照射可以保持轴向运动频率的显著增加(图4G公司). 这些观察结果表明，光开关可以在完整的动物制剂中发挥作用，而无需应用全视网膜（参见讨论)所用的光能够穿透羊膜和组织层，激活脊髓神经元。

由于RO4超极化海马神经元的光激活，我们接下来探索它是否可以用于抑制自发爆发活动。在持续光照期间，在腰椎RO4表达的脊髓中，自发发作之间的间隔仅略微增加(图4H（H）, •). 这一发现并非完全出乎意料，因为未经RO4电穿孔的脐带区域仍能去极化，并有助于激发引发突发事件所需的兴奋（参见参考文献。23)有关剧集生成的详细信息）。然而，令人惊讶的是，2秒的光脉冲实际上引发了过早发作（4我，2）自发发作后1分钟(图4我, 1). 然而，当给予1、1.5或2秒的光脉冲时，腰部运动单元的活动在光照期间受到抑制，只有当光关闭时才会触发发作(图4我, 2). 在光照期间，运动神经元的异步放电也被抑制(图4 I底部和J型). 因此，虽然RO4在完整的脊髓回路中的激活可能会通过激活其他G蛋白偶联通路（例如，通过激活在此阶段具有兴奋性的甘氨酸受体）影响兴奋性，但我们的结果表明，在胚胎第5天，转染神经元的鸡脊髓超极化占主导地位。我们建议电路中细胞的这种超极化(27)可能通过缓解电压门控钠的失活⁺通道，提高了当光熄灭时这些电池一起点火的可能性，从而为电路内同步突发事件提供了另一种方法。因此，RO4的光激活可以精确地驱动1、1.5或2秒间隔的发作(图4H（H）（▴）。此外，当手术切断脊髓右侧和左侧之间的连接时，两侧的发作会异步发生，但可以通过RO4的光激活实现同步(图4K（K）).

讨论

这项研究表明，脊椎动物视紫红质RO4和绿藻ChR2在被光激活时可用于控制神经元功能。RO4通过突触后作用使神经元超极化，抑制动作电位放电，并通过突触前作用减少递质释放。我们还证明，ChR2可以在体-树突系统中发挥作用，使神经元去极化并引起动作电位放电。它是否被转运到突触前末端，在突触前终端产生的电流可以调节传递，尚待确定。然而，RO4向突触前部位的转运能够调节突触前功能（释放递质和配对脉冲促进），提示它将是研究G蛋白在ms时间范围内在脊椎动物突触前末端介导的效应的有用工具，并将为突触前G蛋白的精确时间激活和失活提供一种手段。用配体激活GPCR不可能实现如此精确的活化，因为配体的洗脱、转运或降解很慢。突触前终末G蛋白的ms激活可能有助于深入了解G蛋白的突触前功能，尤其是与短期突触可塑性和调节递质释放有关的事件。

ChR2似乎是增加神经元兴奋性和放电的首选蛋白质，最近Boyden也对神经元进行了表征等。(28). 该组也使用了ChR2的截短版本，能够控制高达30 Hz的光脉冲的发射。我们观察到，大于5 Hz的光刺激频率导致动作电位放电成功率降低，可能是因为ChR2电流的使用依赖性降低以及Na的频率依赖性增加⁺通道失活。我们发现，5-Hz刺激方案在激发动作电位序列方面的成功率很高，与从ChR2诱导的去极化恢复所需的200 ms时间一致（图6）。因此，神经元能够精确跟踪光脉冲频率的程度可能取决于不同类别神经元的膜特性。

与使用光激活开关相关的一个潜在问题是光穿透组织的程度。然而，我们在这里证明，所施加的光足以激活卵子内隔离的脊髓和完整的胚胎第5-6天鸡胚，其中光通过壳中的窗口施加。此外，在没有光的情况下，光刺激可以对小鸡的脊髓施加数小时，而不会改变自发节律活动的模式或频率，这一事实表明，光并没有破坏产生这种活动所需的复杂脊髓回路。总之，我们的实验表明，完整胚胎内的神经元回路可以通过非侵入性技术控制，而不需要任何化合物。

因此，我们开发的光开关应该为描述活体动物或组织中的细胞和网络功能提供重要工具。将这些开关置于特定启动子的控制下，将使人能够控制特定神经元亚群的活动，从而确定它们在复杂行为中的作用，例如，定义中间神经元和运动神经元亚类在运动中的作用。这些蛋白质除了用于神经元回路功能和行为的基本表征外，还将为开发外部光控分子机器提供额外的工具，以避免疾病或创伤导致的神经系统兴奋性改变，例如脊髓损伤、心脏心律失常、，帕金森氏病。

补充材料

鸣谢

笔记

作者贡献：X.L.、D.V.G.、M.D.M.、L.T.L.和S.H.设计的研究；X.L.、D.V.G.、M.G.H.、J.H.、M.D.M.、H.C.、P.H.和L.T.L.进行了研究；X.L.、D.V.G.、M.G.H.、J.H.、M.D.M.、H.C.和P.H.贡献了新的试剂/分析工具；X.L.、D.V.G.、M.G.H.和S.H.分析数据；X.L.、D.V.G.、M.G.H.、H.C.、P.H.、L.T.L.和S.H.撰写了论文。

利益冲突声明：未声明冲突。

缩写：ChR，通道视紫红质；GPCR，G蛋白偶联受体；mAChR，毒蕈碱型乙酰胆碱受体；GIRK，G蛋白内向整流钾通道；PTX、百日咳毒素、RO4、大鼠视紫红质4；HEK，人胚胎肾；碳水化合物、卡巴胆碱；兴奋性突触后电流；IPSC，抑制性突触后电流。

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