图3。PDK1中与磷酸化疏水基序相互作用所需的精氨酸/赖氨酸残基的鉴定。(A类)将表达野生型或突变型myc-PDK1的质粒与HA-RSK2、GST-PRK2或空载体（Vec）共同转染COS7细胞。在48小时和最后3小时的血清饥饿期后，对表达RSK的细胞进行35分钟EGF处理，然后对细胞进行裂解。分别使用抗HA抗体或谷胱甘肽珠从细胞裂解液中沉淀HA-RSK2和GST-PRK2。沉淀物经过SDS-PAGE和抗myc抗体免疫印迹检测共沉淀物myc-PDK1（上面板）或抗-HA免疫染色或蛋白质染色，以评估HA-RSK2和GST-PRK2的数量（下面板）。对沉淀前裂解物进行myc标记免疫印迹（中间板）。(B类)在BiaCore3000系统中，使用表面等离子体共振测量分析了PDK1与RSK2疏水基序的相互作用。磷酸化基序的生物素化肽（pHM^RSK公司)或非磷酸化（HM^RSK公司)使用Ser386对传感器芯片SA进行涂层（10个响应单元）。（1） 将不同浓度（0.013–3.33µM）的GST–PDK1注射到pHM涂层芯片上。在插图中，根据PDK1的不同浓度绘制了稳态结合曲线。使用Kaleidabrograph软件将数据拟合为双曲线，从而获得动力学常数。（2和3）将GST–PDK1野生型、–R131A或–R131M以400 nM注入涂有pHM的芯片^RSK公司和HM^RSK公司分别是。（A）和（B）中的所有实验进行了三次，结果相似。