小鼠多瘤病毒样颗粒在活细胞和人工膜上的单克隆追踪

摘要

在用单个荧光团、胶体金或荧光珠标记特定膜成分后，通常使用光学显微镜和单粒子追踪（SPT）研究活细胞质膜的动态事件(1–三). 对由此获得的轨迹进行的彻底分析提供了有关膜组件的横向运动以及细胞骨架元素对其施加的约束的信息(4–6)，富含胆固醇的微域(7,8)以及在质膜中施加异质性的其他结构。

在这项研究中，我们利用这项技术分析了附着在细胞表面受体上的传入病毒样颗粒（VLP）的横向运动。动物病毒进入宿主细胞始于颗粒与作为细胞表面受体的脂类、蛋白质或碳水化合物的结合。在许多情况下，结合之后是受体介导的病毒内吞作用，随后病毒衣壳和附属蛋白从细胞内细胞器渗入胞浆(9). 尽管SPT已用于病毒输入(10,11)病毒颗粒在内化前在细胞表面的运动尚未详细分析。

我们的研究集中在小鼠多瘤病毒（Py）上，这是一种小型（直径45 nm）、简单、无包膜的DNA肿瘤病毒(12)使用神经节苷脂GD1a和GT1b作为受体(13)并且依赖于不依赖于氯氰菊酯、依赖于胆固醇的内吞作用将其基因组传递到细胞中进行复制（参考文献。14以及A.E.S.、H.E.和A.H.未发表的观察结果）。我们使用了结构类似于病毒但不包含DNA基因组的VLP，而不是传染性病毒(15). 组装这些VLP在体外重组病毒蛋白1，在大肠杆菌与完整病毒一样，VLP通过病毒蛋白1与神经节苷脂的低聚糖部分结合，并将其用作进入受体(16). 与完整的Py一样，表面结合的VLP激活酪氨酸激酶和其他信号因子，诱导颗粒内吞（参考文献。17以及A.E.S.、H.E.和A.H.未发表的观察结果）。

在这里，用全内反射荧光显微镜（TIRF）记录了组织培养细胞表面和人工脂质双层中荧光标记的单个VLP的轨迹，用于SPT。为了定量分析轨迹，矩标度谱（MSS）(18)作为一种计算方法引入，并用于对各种横向运动模式进行分类。通常情况下，颗粒与细胞表面结合后，会经历几秒钟自由的、依赖胆固醇的侧向扩散，然后通过肌动蛋白-细胞骨架依赖机制快速限制一段时间。

材料和方法

细胞培养和试剂。缺乏小窝蛋白-1表达的3T6瑞士白化成纤维细胞和小鼠肺成纤维细胞(19)在37°C、5%CO、添加10%FCS（瑞士纽宁根LabForce）、4 mM谷氨酸MAX和50 mM Hepes（GIBCO）的无酚无红DMEM（GIBCO）中生长₂。对于活细胞显微镜，在18-mm玻璃盖玻片上进行实验前24小时将细胞电镀。使用Nucleofector（Amaxa，Gaithersburg，MD）瞬时转染细胞。已描述编码小窝蛋白-1–GFP和网格蛋白轻链–GFP的质粒(20,21). VLP净化、组装(15)、和标签(16)详细描述见支持材料和方法，发布为支持信息在PNAS网站上。

药物治疗。细胞在添加VLP之前与相应药物进行培养，如下所示。分别在0.2μM和0.25μM的条件下，添加Latruculin A和jasplakinolide（分子探针）15分钟。为了从细胞中提取胆固醇，使用补充有10 mM甲基-β-环糊精（MCD；Sigma）的无血清培养基1小时。为了进行胆固醇的制备，使用10 mM MCD-胆固醇复合物（Sigma，实验过程中出现了药物。使用Amplex红胆固醇测定试剂盒（分子探针）评估细胞胆固醇含量。

电子显微镜。对于阴性染色，0.4μm网格铜网格涂有4-nm碳膜。添加含有1 mg/ml VLP的10μl样品30 s，排出多余液体，并在蒸馏水中用2%乙酸铀酰再染色30 s。在透射电子显微镜（EM 91显微镜、蔡司）之后，图像被导出为8位TIFF文件，并在photoshop7.0（加利福尼亚州圣何塞Adobe Systems）。

标准贯入试验。显微镜是在定制的改良奥林巴斯IX71倒置显微镜上进行的，详见支持材料和方法.将18-mm盖玻片上的3T6活细胞安装在定制的腔室中。为了避免细胞膜或细胞骨架发生变化，在安装细胞时不交换培养基。将0.1μg/ml的VLP添加到0.5 ml培养基中。在TIRF模式下，1000或2000帧以每秒20帧的速度录制电影。每次实验后，用微分干涉对比显微镜对记录的细胞进行成像，以检查其活性。轨迹是通过使用我们开发的跟踪程序采集和分析的（见参考文献。22和支持材料和方法). 该程序允许的粒子位置精度平均为26 nm。

内化分析。将标记有Alexa Fluor 568（AF568）和FITC（分子探针）的VLP添加到显微镜台上37°C的活细胞中。添加VLP后，以每秒5帧的速率在不同的时间间隔记录两种染料的荧光信号。在记录期间，将培养基酸化至pH 4.5，导致暴露在细胞表面的颗粒的FITC发射光谱发生剧烈变化，505-530 nm通道中的可检测荧光消失。荧光图像导出为12位TIFF文件，并在中进行处理图像j（美国国立卫生研究院，贝塞斯达）。

人工油脂双层的制备。采用囊泡滴注法制备人工脂类双层膜(23). 简言之，将二油酰磷脂酰胆碱、氟代荧光素二棕榈酰磷脂酰乙醇胺（Fl-DPPE）（Avanti-Polar Lipids）和GD1a（Hytest，Turku，Finland）溶解于氯仿：甲醇（4:1）中，在氮气流下干燥，并在真空下保持至少2 h。将干燥的脂质混合物再次悬浮在50 mM Tris/0.2 M NaCl/2 mM CaCl中₂pH值7.4。通过挤压形成囊泡，并添加到等离子清洁的玻璃盖玻片中。将所得双层冲洗五次，以去除剩余的囊泡。在对人工双层进行每次SPT实验之前，使用蔡司LSM 510共焦显微镜对Fl-DPPE进行光漂白实验后，通过荧光恢复来确保双层的流动性和连续性，详见支持材料和方法.

结果

Py VLP与细胞表面结合的SPT。本研究中使用的VLP由重组病毒蛋白1五聚体组装而成(15). 蔗糖梯度分馏产生了相对均匀的粒子群，负染后的电子显微镜显示其具有Py样外观，直径为43±5 nm(图1一). 和感染性病毒一样，它们与GD1a结合，被内吞，与感染性病毒一起添加到3T6细胞中时抑制感染（参考文献。13,16、和17以及A.E.S.、H.E.和A.H.未发表的观察结果）。为了可视化，将FITC和/或AF568共价偶联到隔离的VLP。平均每粒子182个荧光团，VLP的受体-配体相互作用和内吞作用保持不变（参考文献。13和16以及A.E.S.、H.E.和A.H.未发表的观察结果）。

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图1。

活3T6细胞底面Py VLP的SPT。(一)通过负染色观察VLP的电子显微照片。（比例尺，0.1μm）(b条)AF568标记的VLP与3T6活细胞结合的荧光显微照片（比例尺，10μm）(c（c）)时间序列（20 Hz，1000帧）的TIRF显微镜图像显示单个AF568标记的VLP与3T6细胞结合。箭头指向绑定前一帧检测到的模糊粒子荧光。（比例尺，1μm）(d日)VLP添加到盖玻片45分钟后，VLP的TIRF显微镜图像与FITC和AF568结合，并结合到活3T6细胞的底部表面。细胞处于pH值为7.0的培养基中(左侧)或pH 4.5(赖特). 请注意，酸化后FITC发射光谱发生变化，使得酸暴露VLP的FITC荧光无法检测到。(e（电子）)(左侧)所示电池的差分干涉对比度（DIC）图像d日培养基酸化后获得。（比例尺，10μm）(赖特)酸化前通过检测AF568获得表面结合VLP的轨迹（20 Hz，1000帧）。（比例尺，2μm）

当荧光标记的VLP被添加到37°C显微镜台上的活3T6细胞中时，可以立即通过外荧光显微镜观察到与上表面的结合(图1b条和电影1，发布为支持信息在PNAS网站上）。大约15分钟后，溶液中的VLP漂移到细胞底面和盖玻璃之间的狭窄空间，TIRF显微镜可以将其视为快速移动、模糊的荧光物体。然而，一旦绑定到细胞的底部表面，它们就会呈现出均匀的亮点，要么是静止的，要么是横向移动的。图1c（c）和电影2，发布为支持信息在PNAS网站上显示了以高速（20Hz）记录的单个VLP的结合和随后的横向扩散。首先在介质中可见(图1c（c），箭头），可以看到VLP绑定到单元格并开始横向移动。

因为我们对内吞前细胞表面的VLP感兴趣，所以确定TIRF显微镜记录的颗粒为细胞外颗粒的时间窗口非常重要。为了测试颗粒是否暴露在外部介质中，我们使用了AF568（不受pH值影响）和FITC（对酸敏感）双重标记的VLP。在向细胞中添加VLP后60分钟内，以不同的间隔将培养基酸化至pH 4.5，以熄灭细胞外VLP的FITC荧光。如所示图1d日当pH降低时，添加VLP后45分钟TIRF显微镜记录的所有颗粒的FITC荧光信号消失，表明VLP仍然是细胞外的。在稍后时间点的记录中，偶尔可以看到颗粒发生内吞作用；它们从消逝场中消失，但在酸化后通过两个通道的外荧光仍然可见（数据未显示）。我们的结论是，在病毒添加后的15–45分钟内，TIRF显微镜记录的细胞相关VLP是细胞外的。

束缚VLP的移动性。对于粒子跟踪，如中所示的单元图1d日和e（电子）选择几个已经绑定的VLP，并在TIRF模式下以每秒20帧的速度记录，总共50或100秒。通过使用SPT算法将粒子位置从一帧链接到另一帧，从数字图像中提取粒子轨迹(22). 如中八个VLP的轨迹所示图1e（电子）束缚粒子的运动是不均匀的。一些VLP几乎固定到位，而其他VLP则显示出覆盖数微米见方区域的横向运动。为了解释结果，有必要通过计算分析对轨迹进行分类。

在收集了45个细胞的309条轨迹后，线性扩散系数(D类)通过与平均平方位移（MSD，〈第页²〉）中规定的绘图支持材料和方法结果表明，许多VLP表现出非线性扩散。非线性的度量可以用参数α表示，表示MSD与时间的非线性关系，〈第页²〉 = 4深度^α(24). 法拉利等。(18)通过引入一个额外的非负整数参数ν来增强此度量，从而〈第页^ν〉～t^γν当ν=2时，MSD是γ的特例^ν= α. γ曲线图^νvs.ν称为MSS，其斜率(S公司_毫秒)生成一个值，该值可以与描述粒子运动特性的运动模式相关联。它有两个主要优点S公司_MSS公司方法优于〈第页²〉 = 4深度^α分类：由于MSS的良好线性和运动模式之间的清晰区分，误差较小(18) (支持材料和方法; 另请参见图6，其发布为支持信息在PNAS网站上）。安S公司_毫秒值0.5定义了随机的布朗运动，而小于0.5和大于0.5的值分别是受限运动和定向运动的特征S公司_MSS公司值0表示静止。

通过绘图D类与。S公司_MSS公司对于309个VLP，我们可以在一个图中比较所有轨迹，而无需任意选择。中的情节图2一显示了所有309条轨迹的组合数据。三种主要的运动模式可以通过在D类/S公司_MSS公司绘图：(我)快速随机运动(D类> 3 × 10^–3微米²/第页，S公司_MSS公司∼ 0.5), (ii（ii）)限制在直径为30至60nm的区域(D类< 2 × 10^–3微米²/s中，S公司_MSS公司<0.1），以及(三)缓慢漂移限制(D类< 10^–3微米²/第页，S公司_MSS公司= 0.15–0.35). 当以0.05-s帧速率获得的漂移粒子的轨迹平均为0.5-s间隔时，它们显示出宏观的D类0.5–1.5×10^–4微米²/s和宏观S公司_MSS公司0.5±0.1，表示自由但非常缓慢的扩散。为了便于评估三种主要运动模式，我们用方框突出显示了图中的区域(图2一). 这些方框中包括在整个轨迹中表现出均匀流动性的粒子，并排除了表现出复合流动模式的粒子和一些局限于大面积（高流动性）的异常值D类，低S公司_MSS公司)或自由扩散但缓慢（低D、 S公司_MSS公司∼ 0.5). VLP的定向移动(S公司_MSS公司≫0.5）未观察到。

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图2。

活细胞VLP轨迹分析。(一)扩散系数与MSS斜率的散点图(D类/S公司_MSS公司)活细胞底面的VLP轨迹。不管记录的长度如何，也不管粒子在记录开始时是束缚还是自由的，都会绘制所有捕获的轨迹。每个点代表一条轨迹，每条轨迹至少有100步（5秒）长。最长轨迹为2000步（100秒）长。这三个方框突出显示了图形上VLP运动快速且随机（方框1）、受限（方框2）或受限于缓慢漂移（方框3）的区域。(b条)三个方框中的每个方框和一个典型异常值（轨迹4）的代表轨迹（编号为1、2和3）。轨迹表示快速和随机运动（轨迹1）、限制（轨迹2）和限制缓慢漂移（轨迹3）。轨迹4表示在采集期间改变其运动模式的VLP。在这些轨迹的下方是各自的分析图：绝对位移（μm）x个和年方向与时间、MSD和MSS。(c（c）)D类/S公司_MSS公司将VLP绑定到玻璃盖玻片上进行的控制实验的轨迹散点图(左侧)或细胞顶面(赖特).

代表性的全长轨迹(图2b条，轨迹1、2和3）用于每种机动模式和一种复合轨迹(图2b条，轨迹4）如所示图2b条具有相应的xy公司位移、MSD和MSS图。根据参考文献计算了特定轨迹的误差。2注意，当MSD和MSS绘图时，可以明确区分轨迹(图2b条)一起考虑。

框外的许多点（例如图2b条，轨迹4）显示出非均匀行为，约束周期被自由扩散中断。其中一些VLP多次改变了它们的运动模式。在许多情况下，我们观察到粒子不止一次访问同一限制区，这表明区域的位置是质膜在长达1–2 s的时间内的稳定特征。此外，外荧光显微镜记录的VLP与细胞顶面结合时的轨迹显示，VLP在细胞内的分布类似D类/S公司_MSS公司按底面绘制(n个= 55) (图2c（c） 赖特). 因此，与细胞底部表面结合的VLP的流动性不受细胞和盖片之间的受限空间或顶部和底部表面之间细胞结构差异造成的限制的影响。

人工双层脂质的流动性。为了确定表面迁移率的检测极限，在没有细胞的情况下将VLP绑定到盖玻片上，并在与实验相同的条件下进行跟踪(n个= 50). 这些固定化VLP定义了最慢的可观察流动性D类1.31±0.40×10^–4微米²/第条。平均值S公司_MSS公司其中零度以下的粒子表明，它们的迁移率低于摄像机噪声设定的阈值(图2c 左侧). 具有S公司_MSS公司进一步分析中省略了<0。

为了获得有关VLP无约束扩散的信息，我们记录了37°C下VLP与人工脂质双层结合的轨迹。通过沉积小的单层脂质体在玻璃盖玻片表面形成双层(23). 脂质体由二油酸磷脂酰胆碱组成，GD1a含量为0.07摩尔%，FL-DPPE含量为1摩尔%。为了确认双层是流动的和连续的，在每次SPT实验之前，在室温下对FL-DPPE进行光漂白实验后的荧光恢复（图7一和b条和电影3，发布为支持信息在PNAS网站上）。3.96±0.82μm的扩散系数（D）²/秒(n个=7）根据已发表的观察结果确定FL-DPPE(25). VLP没有结合到缺乏GD1a的控制双层（数据未显示）。当GD1a存在时，VLP附着在双层膜上，并在膜平面内快速移动（电影4，出版为支持信息在PNAS网站上）。他们展示了D类0.032±0.023μm²/s、 和aS公司_MSS公司0.42±0.096(n个=39），表示自由扩散（图7c（c）). 很明显，VLP在这些人工膜中的流动性略高于在3T6质膜中的自由扩散。此外，VLP经常与双层分离，而细胞膜没有分离。

监禁。当从结合的那一刻开始追踪VLP时，很明显，自由扩散通常先于限制。对于以这种方式分析的18个粒子中的12个，最初的快速随机运动持续了5-10秒。这一时期之后的移动性损失是突然的；它发生在两帧之间（50ms）。流动性的巨大变化也可以通过计算D类和S公司_MSS公司在轨迹中120帧的移动窗口中(图3和电影5，发布为支持信息在PNAS网站上）。当事情发生时，逃离监禁的速度也同样快。当流动性的快速变化被用作分界点时，D类和S公司_毫秒可以分别计算轨道的移动部分和固定部分。在稳定结合后，VLP立即显示相对较高D类和S公司_MSS公司如预期的自由扩散(图3，方框1）。相比之下，VLP则低得多D类和aS公司_MSS公司突然失去活动性后小于0.2，表明有次扩散运动(图3，方框2和3）。

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图3。

结合粒子的迁移率分析。这个D类和S公司_MSS公司分别计算与活细胞结合时所成像粒子的移动部分（黑色）和受限部分（红色）轨迹(n个= 10). 上的平均位置D类/S公司_MSS公司可移动部分和受限部分的绘图以各自的颜色显示。为了说明流动性的突然变化，D类和S公司_MSS公司计算了120帧移动窗口的整个轨迹。此分析的结果用图表表示D类/S公司_MSS公司图，数据点根据时间连接，以获得更好的可见性（另请参阅电影5）。

在3T6细胞中观察到的VLP限制区的尺寸范围为500-3000 nm²为了确定限制区是否对应于氯氰菊酯涂层的凹坑或小窝，将VLP添加到瞬时表达氯氰菊酯轻链GFP或小窝蛋白-1 GFP的细胞中。已发表的GFP结构的研究和我们自己的观察表明，它们在内吞和膜转运中起作用(20,21). GFP标记蛋白和VLP的电影通过双色TIRF显微镜获得。

未发现VLP与膜上的网格蛋白轻链GFP或小窝蛋白-1 GFP阳性区域共定位或进入其中(图4一和b条; 另请参阅电影6和7，其出版为支持信息在PNAS网站上）。当我们分析来自小窝蛋白-1缺失小鼠的原代成纤维细胞上VLP的表面迁移率时(19)，与3T6细胞一样频繁地发生限制D类/S公司_MSS公司情节没有不同(图4c（c）) (n个= 75). 因此，与我们的研究结果一致，即Py的内吞和感染独立于网格蛋白和小窝介导的内吞（A.E.S.、H.E.和A.H.，未发表的观察结果），VLP的限制并不涉及网格蛋白包被的凹坑或表面小窝的包封。

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图4。

将VLP限制在细胞表面不需要小窝或涂有氯氰菊酯的凹坑。AF568 VLP与表达网格蛋白轻链GFP的活3T6细胞底面结合的TIRF图像(一)或小窝蛋白-1–GFP(b条). （比例尺，10μm）对于每个构造，整个细胞的代表性合并双色图像(上部)和特写（插入上部如所示下部)如图所示。(c（c）)D类/S公司_MSS公司小窝蛋白-1基因敲除小鼠肺成纤维细胞结合颗粒的VLP轨迹图。

为了确定肌动蛋白细胞骨架是否负责VLP限制，测试了肌动蛋白丝组装和拆卸抑制剂的作用。低浓度latrunculin A（200 nM）对微丝组装的轻度抑制导致VLP限制几乎完全丧失(n个= 74) (图5一). 在这种浓度下，TIRF显微镜使用肌动蛋白–GFP表达的3T6细胞显示，皮质肌动蛋白紊乱，而应力纤维仍然完好无损（电影8，发表于支持信息在PNAS网站上）。茉莉糖苷抑制微丝分解，不影响自由扩散和限制。在对照细胞中经常观察到的漂移被消除(n个= 146) (图5b条). 我们的结论是，在一段时间的自由扩散后，VLP颗粒被皮层肌动蛋白网络限制在横向运动中。一旦被该网络捕获，VLP运动被限制在限制性纤维动态变化所允许的局部移动中。

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图5。

细胞肌动蛋白和胆固醇的扰动对VLP运动的影响。D类/S公司_毫秒图中显示了VLP在加入0.2μM latrunculin A前15分钟与细胞结合时的流动性(一)以相同方式添加0.25μM茉莉糖苷(b条)，在VLP前1小时添加10 mM MCD(c（c）)，10 mM MCD–向用MCD预处理的细胞中添加胆固醇复合物2小时，如c（c）(d日)，0.2μM latrunculin A，在按c（c）(e（电子）)在VLP前添加0.2 mM染料木素1小时(（f）).

胆固醇消耗和激酶抑制的影响。胆固醇耗竭和酪氨酸激酶抑制抑制VLP内化和Py感染（参考。14以及A.E.S.、H.E.和A.H.未发表的观察结果）。为了确定胆固醇对细胞表面VLP流动性是否重要，我们使用胆固醇消耗药物MCD将细胞胆固醇水平降低至<40%。引人注目的是，与这些细胞结合的VLP在任何时候都没有表现出自由扩散(图5c（c）)(n个= 256). 在用制霉菌素和孕酮隔夜培养去除胆固醇后，也得到了类似的结果。固定作用是可逆的，因为在将胆固醇重新加入细胞后，VLP迁移率的分布再次与未处理的细胞相似(n个= 68) (图5d日). 胆固醇耗竭后自由扩散的丧失与皮质肌动蛋白无关，因为向胆固醇耗竭的细胞中添加latrunculin A并不能恢复大多数VLP的自由流动性(n个= 102) (图5e（电子）).

相比之下，酪氨酸激酶抑制剂金雀异黄素（genistein）也能阻止Py进入细胞，在SPT实验前1小时添加时，对VLP的限制没有明显的影响(n个= 101) (图5（f）). 我们的结论是，VLP的自由扩散或限制不需要酪氨酸激酶。

讨论

当使用扩散常数和MSS分析细胞边界VLP的轨迹时，可以区分不同的运动模式。结合后，VLP立即显示出5-10 s的快速随机扩散，其速度仅略慢于在二醇酰磷脂酰胆碱双层中与神经节苷脂受体GD1a结合的VLP所观察到的速度。自由扩散最终导致迁移率突然下降，粒子现在被限制在直径为30-60nm的区域。一些VLP继续显示缓慢的随机漂移。偶尔，VLP再次松动并进入另一个自由扩散阶段，但最终再次被困在相同或不同的限制区中。

VLP被限制的区域与氯氰菊酯涂层的凹坑或小窝没有重叠，限制的过程似乎与内吞作用没有直接联系。事实上，在内吞内化之前，这些颗粒可以被限制长达半个小时或更长时间，并且启动内吞所需的酪氨酸激酶诱导信号不需要限制。此外，我们还发现，latrunculin A对肌动蛋白丝的解离可以防止禁闭，不会影响同一细胞类型中的VLP内吞或Py感染（A.E.S.、H.E.和A.H.，未发表的观察结果）。因此，VLP的限制似乎反映了质膜的一个基本特性，并可能归因于细胞骨架将膜分隔的一般现象(26).

在SPT和光漂白后荧光恢复研究的基础上，几个研究小组得出结论，细胞溶质表面的肌动蛋白丝将质膜分隔成纳米组分，这些纳米组分允许蛋白质和脂质在其内部快速局部扩散，但抑制涉及细胞间运动的长距离扩散(4,6,26). 为了解释皮质肌动蛋白的作用，膜骨架“栅栏”或“围栏”模型和锚定跨膜蛋白“尖桩”模型(4,5,27,28)已被提议。

篱笆或围栏场景涉及到通过紧密结合的动态肌动蛋白丝在内表面形成网格来分割质膜的细胞溶质表面。纤丝阻止蛋白质和与粗大细胞质突起复合物的自由扩散。虽然这些蛋白质和复合物可以在网格的每个分区内自由扩散，但部门间的运动受到限制(4,6,26,29,30). 在纠察场景中，不需要庞大的细胞质结构域来限制。相反，由皮层肌动蛋白丝固定到位的跨膜蛋白是两个膜小叶中成分横向迁移的障碍。这些纠察队施加的限制程度取决于移动实体的大小和拥挤程度(5).

在VLP的情况下，与之结合的神经节苷脂受体仅限于外层双层小叶。在这种情况下，导致肌动蛋白介导的限制的跨膜耦合是如何发生的尚不清楚。然而，由于神经节苷脂的单个聚糖部分与病毒蛋白1的结合常数小于毫摩尔(31)VLP很可能从一开始就由多个神经节苷脂固定(32). 利用霍乱毒素β亚单位聚集神经节苷脂已被证明在人工脂质双层中诱导相分离(33). 此外，神经节苷脂和细胞表面相关VLP定位于膜的耐洗涤剂部分（参考文献。34以及A.E.S.、H.E.和A.H.未发表的观察结果）。综上所述，这些发现得出结论：VLP-神经节苷脂复合物是脂筏的一部分(7)这可能是跨膜耦合和后续包封的关键步骤。

我们发现，自由扩散的初始阶段被细胞胆固醇的消耗所消除，这是一种阻止VLP内吞并抑制Py感染的治疗方法（参考文献。14以及A.E.S.、H.E.和A.H.未发表的观察结果）。胆固醇耗竭会导致质膜成分的固定化，这在文献中并非史无前例。据报道，几种糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白、跨膜蛋白和脂质的横向迁移率降低(35–38). 一种解释这种作用的机制是肌动蛋白依赖性的、可逆的脂质凝集成大的、稳定的、有序的脂质结构域(35,36,38). 相反，有人提出胆固醇消耗会导致PI（4,5）P下降₂-水平，进而影响皮质肌动蛋白细胞骨架，从而降低膜组件的侧向流动性(37). 由于latrunculin A不能逆转胆固醇耗竭的影响，胆固醇耗竭细胞中VLP流动性的缺乏很可能是由于含有神经节苷脂和结合VLP的大型不动膜斑块的形成。

对于Py VLP，我们的结果引导我们建立了一个模型，该模型从传入VLP与几个神经节苷脂分子的寡糖部分结合开始。直到发生某种形式的跨双层耦合，对VLP-受体复合物施加严格的肌动蛋白丝依赖性限制，才能限制由此形成的复合物的横向迁移。这种变化很可能是由于向复合体中添加了更多组件所致。这些成分可以形成与肌动蛋白丝的直接桥梁，或者仅复合物的大小或结构的变化就足以使其通过栅栏或尖桩机制受到约束。由于茉莉花碱内酯处理减少了VLP限制后经常观察到的缓慢漂移，因此很可能整个络合物可以从一个纳米组分移动到下一个，但前提是丝状晶格是动态的，并且受到局部重排。偶尔观察到的VLP快速恢复自由扩散可能代表络合物的不稳定。

无论复合物是否被肌动蛋白捕获，激酶和其他信号因子都会被招募并启动级联反应，最终导致VLP的内吞内化。利用SPT、TIRF显微镜和其他提供细胞表面过程动态信息的方法，进一步研究细胞结合病毒和VLP的行为，将有助于阐明这些效应的重要性和普遍性，并有助于我们了解质膜的特性。

补充材料

致谢

笔记

作者贡献：H.E.、A.E.S.和A.H.设计的研究；H.E.进行研究；I.F.S.、H.L.和P.K.提供了新的试剂/分析工具；H.E.、A.E.S.和A.H.分析数据；H.E.、A.E.S.和A.H.写了这篇论文。

本文直接（第二轨道）提交给PNAS办公室。

缩写：SPT，单粒子跟踪；TIRF，全内反射荧光；VLP，类病毒颗粒；Fl-DPPE，荧光素二棕榈酰磷脂酰乙醇胺；甲基-β-环糊精；MSS，矩标度谱；Py，多瘤病毒；AF568，Alexa Fluor 568。

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