卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）直接参与卡波西肉瘤的病因(1–4)并显示免疫缺陷患者（如HIV患者和移植受者）的发病率很高。与其他γ-疱疹病毒一样，KSHV含有模仿宿主用来调节细胞生长和凋亡的基因(三). 这些过程的失调有助于病毒存活并成功复制。最近体内研究表明，gammaherpes病毒表达多种细胞蛋白模拟物，包括病毒周期蛋白和病毒bcl-2，它们对免疫受损宿主中病毒潜伏期和复制的重新激活至关重要(5). 此外，这些病毒基因可能会基于其干扰已建立的肿瘤抑制途径的能力，增加病毒感染细胞的致癌转化倾向(2).
KSHV编码与人类Bcl-2序列和功能同源的蛋白质(6). Bcl-2蛋白家族成员通过其作为细胞凋亡抑制剂或促进剂的作用，在组织稳态、胚胎发生和免疫反应中发挥重要作用(7–10). 细胞Bcl-2的前生存功能是与促凋亡家族成员（如Bak、Bax和Bad）异源二聚体化的结果。基于序列比对（图。)KSHV Bcl-2蛋白包含Bcl-2同源（BH）基序BH1和BH2。此外，KSHV Bcl-2的BH1区域包含特征性的“NWGR”序列，该序列被认为对Bcl-2抗凋亡功能以及Bcl-2与其他家族成员异源二聚体的能力至关重要(11). 然而，KSHV Bcl-2保护细胞凋亡的机制尚不清楚。细胞分析表明KSHV Bcl-2与促凋亡Bcl-2家族成员（如Bax和Bak）不发生异二聚体(12).
基于KSHV Bcl-2和人类全长Bcl-x二级结构的序列比对L（左）和Bcl-2。KSHV Bcl-2的α-螺旋显示在序列上方。BH区域如下所示。跨膜结构域（TM）显示在序列下方。
KSHV Bcl-2仅与BH3和BH4基序具有有限的同源性(12). 结构和突变研究表明，BH3区域对Bcl-2家族成员的抗凋亡活性很重要，BH4区域可能对Bcl-2-活性的调节很重要。人Bcl-2在Asp-34的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶裂解将BH4区与其余蛋白质分离，并产生一个截短的蛋白质，该蛋白质是促凋亡的还是抗凋亡的。Bcl-2的病毒KSHV同源物不包含这种半胱氨酸蛋白酶裂解位点，因此可以逃避这种额外的调节(13,14).
病毒KSHV同源物Bcl-2也可能保护病毒感染细胞免受KSHV病毒周期蛋白（v-cyclin）表达诱导的凋亡(15,16). 在CDK6水平升高的细胞中，v-cyclin的表达通过v-cyclin-CDK6介导的细胞Bcl-2失活磷酸化诱导细胞凋亡。与胱天蛋白酶切割一样，细胞Bcl-2的磷酸化发生在蛋白质的非结构环中（氨基酸32-80）(15,16). 因为病毒Bcl-2缺乏这个环，所以即使存在v-cyclin-CDK6也能保持其抗凋亡活性(16). 因此，病毒蛋白表现出不同于细胞Bcl-2的抗凋亡特性。
抑制凋亡似乎对提高KSHV感染细胞的存活率很重要，这样病毒就可以在宿主中复制、传播和持续存在。更好地了解病毒如何模拟宿主蛋白，可能有助于开发针对病毒感染细胞中失调通路的治疗方法。在这里，我们描述了KSHV中发现的Bcl-2同系物的溶液结构，并将其与之前确定的Bcl-1结构进行了比较(17)，Bcl-xL（左）(18,19)和Bax(20). 此外，我们研究了KSHV Bcl-2与来自促凋亡蛋白Bak、Bax和Bad的BH3区域的肽形成复合物的能力。最后，通过定点突变探讨了病毒蛋白的各种残基与BH3肽结合的重要性。
材料和方法
质粒构建。
制备了几种不同的KSHV Bcl-2结构体，并对其在核磁共振结构研究中的适用性进行了评估。KSHV Bcl-2的编码氨基酸1–146的片段（图。)取自全长KSHV Bcl-2。碎片被插入Nco公司我和Xho公司用于表达的pET21d（+）质粒（Novagen）的I位点。在C末端添加额外的12个残基（DDDDLEHHHHH），并包括N67D和V117A的突变，以优化蛋白质在大肠杆菌以双突变体KSHV Bcl-2为模板，采用快速改变定点突变试剂盒（Stratagene）制备KSHV Bcl-2突变体。编码序列经DNA测序证实。
表达和纯化。
在所有情况下，KSHV Bcl-2蛋白都是通过在大肠杆菌BL21（DE3）生长在M9培养基上。统一15N标记，均匀15N中，13C标记，且均匀15N中，13C-标记75%2H样品用含有以下任一成分的培养基制备15全日空航空公司4氯，15全日空航空公司4Cl加[U-13C] 葡萄糖，或15全日空航空公司4Cl，[单位-13C] 葡萄糖和75%2H（H）2O、 分别是。此外，制备了均匀的样品15N中，2H标记；13在亮氨酸、缬氨酸和δ的甲基上标记C1异亮氨酸甲基；并在含有苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的M9培养基上质子化15全日空航空公司4氯，[3-13C] -α-酮丁酸，[3,3′-13C] -α-酮异戊酸、质子化苯丙氨酸、质子化酪氨酸、质子化色氨酸和100%2H（H）2O（运行）(21). 用镍纯化可溶性蛋白质2+亲和层析。核磁共振样品在90%的氢中含有0.5–1.0 mM蛋白质2O/10%2H（H）2O或100%2H（H）2O、 20毫摩尔2H-Tris（pH 7.8）和5 mM2H-DTT公司。
核磁共振波谱。
所有核磁共振实验均在298 K下在Bruker（Billerica，MA）DRX500、DRX600或DRX800核磁共振光谱仪上进行。骨干1H时，13C、 和15通过以下方式实现了N个共振分配[15N中，13C（75%）2H] KSHV Bcl-2通过使用一套氘解耦三重共振实验[HNCA、HN（CO）CA、HN(22). 侧链1H和13C核磁共振信号来自HCCH-全相关光谱实验(23)，缬氨酸和亮氨酸甲基的立体特异性分配是通过对13C类-13在生物合成定向、部分地观察到的C偶联模式13C标签KSHV Bcl-2(24). 核过热效应（NOE）距离约束是从三维空间获得的15N-和13C编辑的NOE光谱(25,26)以80 ms的混合时间获得。在15将蛋白质交换到由2H（H）2O。
结构计算。
KSHV Bcl-2结构是使用模拟退火协议计算的(27)使用程序美国有线电视新闻网（分子模拟，马萨诸塞州沃尔瑟姆）。平方势(F类NOE（无）=50千卡摩尔−1)用于约束NOE导出的距离。基于交叉峰值强度，NOE导出的距离约束的上限为3.5、4.5或6.0。在细化阶段，添加了额外的模糊约束，上限为6.0，对于与化学位移表一致的未指定交叉峰（即质子的误差栏为0.07ppm，杂原子的误差栏是0.7ppm）和结构。扭转角约束φ和ψ由N，C′，C的分析生成α、和Hα通过使用滑石程序(28). 200 kcal mol的力常数−1拉德−2适用于所有扭转约束。仅当观察到残基具有缓慢交换的酰胺质子时，α-螺旋中才包含显式氢键。程序检查用于分析集合中计算结构的几何质量(29).
肽结合。
采用荧光偏振竞争法测定BH3肽（SynPep，Dublin，CA）与Bcl-2蛋白的相对亲和力。按照说明进行荧光偏振测量(30)使用SLM8000荧光计和带有GQVGRQLAIIGDK（FITC）INR序列的荧光标记Bak肽作为探针。该肽对KSHV Bcl-2和人类Bcl-2的解离常数分别为144和350 nM。在含有120 mM磷酸钠（pH 7.55）、0.01%牛丙种球蛋白和0.1%叠氮化钠的缓冲液中进行滴定。KSHV BCL-2的蛋白质浓度为290 nM，探针浓度为2.9 nM；而细胞BCL-2的蛋白质浓度则为550 nM。利用Wang的解析表达式，使用内部编写的软件从滴定曲线中确定解离常数(31).
结果和讨论
KSHV Bcl-2蛋白的一部分（残基1-146）缺乏假定的C末端跨膜螺旋（图。)表示为大肠杆菌同位素标记并纯化。发现该蛋白质在大pH范围内以高于0.1 mM的浓度聚集，因此不适合核磁共振结构研究。提高蛋白质在大肠杆菌，制备了一个双突变蛋白（N67D，V117A）。这个15该突变体的N异核单量子相干谱与野生型蛋白质的谱基本相同，表明蛋白质的折叠得到了保留。此外，突变体和wt蛋白与Bak中的荧光肽具有相似的亲和力，分离常数分别为144和139 nM。
蛋白质的主链和侧链共振来自标准的异核三维核磁共振实验（参见材料和方法)记录在均匀标记的蛋白质样本上15N和13C和75%氘化。为了快速获得分配和明确的结构约束，还对均匀标记为15N和2H和选择性富集13亮氨酸、缬氨酸和δ的甲基上的C1异亮氨酸的甲基。此外，该样品的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸残基被质子化(21).
KSHV Bcl-2蛋白的结构由1953个NMR导出的明确距离和扭角约束以及1023个模糊距离约束共同确定（表). 图。一描述了主干（N，Cα，C′）10个低能结构的叠加，这些结构是使用程序从核磁共振数据中导出的美国有线电视台除去残基1–5、23–31和146–152，主链原子与平均位置的原子均方根偏差为0.39±0.05Å，所有重原子的均方根误差为0.75±0.06。系综和能量最小化结构的结构统计如表所示.不存在大于5的二面角违规o个无大于0.4Å的NOE违例。只有共价几何、NOE、扭转和排斥项包含在结构细化中。即使如此，Lennard–Jones能量仍然很大且为负值，这表明这些结构具有良好的非键合接触。用程序分析平均最小化结构检查(29)结果表明，KSHV Bcl-2的70.4%的残留位于Ramachandran图的最有利区域，而另外25.2%的残留位于允许区域。
表1
| 〈南非〉* | 〈 〉第页 |
|---|
| 实验距离约束的rmsd，Å |
| 残留量（397） | 0.023 ± 0.002 | 0.014 |
| 顺序（407） | 0.017 ± 0.003 | 0.035 |
| 短程（366） | 0.026 ± 0.003 | 0.026 |
| 远程（452） | 0.028 ± 0.002 | 0.035 |
| 氢键（39） | 0.085 ± 0.002 | 0.092 |
| 塔罗斯(204) |
| 美国有线电视台势能（kcal-mol−1)† |
| E类总计 | 94.6 ± 0.8 | 114.6 |
| E类债券 | 1.8 ± 0.1 | 3.6 |
| E类英国 | 54.8 ± 0.9 | 68.3 |
| E类进口 | 5.2 ± 0.4 | 6.7 |
| E类击退 | 17.7 ± 0.8 | 13.5 |
| E类否 | 14.1 ± 1.1 | 21.4 |
| E类L-J公司 | −724.4 ± 12.2 | −739.1 |
| 笛卡尔坐标rmsd（Å）‡ | 骨干 | 都很重 |
|---|
|
|
〈SA \9002；vs.\9001 〉 | 0.39 ± 0.05 | 0.76 ± 0.06 |
(一)主干（N、Cα，C′）病毒KSHV Bcl-2的10个低能NMR衍生结构的叠加。螺旋相对于Bcl-x结构中观察到的螺旋进行编号L（左）. (B类)功能区(36)描述病毒KSHV Bcl-2的平均最小化结构。中心螺旋α5为黄色。(C类)病毒KSHV Bcl-2的溶剂可及表面显示疏水槽。亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基均为黄色。天冬氨酸和谷氨酸呈红色。赖氨酸、精氨酸和组氨酸呈蓝色。所有其他残留物类型均为灰色。
结构描述。
KSHV Bcl-2是一种全α螺旋蛋白（图。B类). 中心疏水性α-螺旋（α5）形成蛋白质的核心，一边夹在两亲性螺旋α3和α4之间，另一边夹在一对两亲性螺α1、α2和α6之间。N末端螺旋α1（残基10–21）通过13残基环（残基22–35）与α2（残基36–46）相连。Lys-47处的一个显著弯曲将α2与α3（残基48-56）分离，并以几乎正交的方式定向这些螺旋。螺旋α4（残基63–77）、α5（残基84–100）和α6（残基105–131）以几乎反平行的方式定向，在Gly-124处螺旋6中出现扭结。由两个甘氨酸残基（残基132和133）组成的一圈将α6从α7（残基134-141）中分离出来，并使α7几乎垂直于螺旋4-6。由α2、α3、α4的残基和α5的N末端部分在蛋白质表面形成疏水沟槽（图。C类).
KSHV Bcl-2与其他Bcl-2家族成员的结构比较。
KSHV Bcl-2与相关的人类蛋白Bcl-2在结构上有很大的同源性(17)，Bcl-xL（左）(18,19)和Bax(20). 它们都包含相同数量的α螺旋，并共享相同的整体褶皱。此外，由BH1、BH2和BH3区域形成的疏水性凹槽保持在病毒蛋白中。该凹槽内衬疏水残基，在Bcl-2家族成员中高度保守。KSHV Bcl-2平均最小结构的主干叠加，不包括匝数和回路，带有Bcl-xL（左）Bcl-2的均方根偏差分别为2.7和2.5Å。
与其他Bcl-2家族成员一样，特征性NWGR序列是保守的。从结构上可以清楚地看出，这些残基在病毒蛋白中的作用与在Bcl-x中的作用相同L（左）在两个Bcl-x中L（左）色氨酸残基（W84）位于α5的N末端，与α6和α7上的疏水残基接触。结构数据表明，这对维持蛋白质的折叠很重要。事实上，在大肠杆菌当我们将这种色氨酸突变为丙氨酸或亮氨酸（即W84A或W84L）时。签名序列中的甘氨酸和精氨酸残基位于疏水间隙的顶部。这些残基（G85A和R86Q）的突变产生了可溶的、折叠良好的蛋白质，表明这些残基对维持KSHV Bcl-2的折叠并不重要。然而，在Bcl-x中L（左）这些残基被证明对来自促凋亡蛋白Bak的BH3肽的结合很重要(18).
KSHV Bcl-2中BH3和BH4结构域的序列保守性很差(13). 然而，这些区域的病毒蛋白结构与其他Bcl-2家族成员同源。病毒Bcl-2的第一螺旋有助于掩埋来自α5和α6的疏水残基，因此在结构上与Bcl-2和Bcl-x的BH4区域中包含的螺旋相似L（左）当Bcl-2第一螺旋中的埋藏残基发生突变（例如V15E）时，它会影响蛋白质的抗凋亡活性及其与Bax异源二聚体的能力(32). 病毒Bcl-2的第二螺旋对应于Bcl-2和Bcl-x的BH3区域L（左）和这些人类蛋白质一样，构成KSHV Bcl-2疏水沟的一部分。
尽管KSHV Bcl-2、Bcl-2和Bcl-x的整体相似性L（左），病毒和人类蛋白质之间的螺旋、匝和环的长度存在关键差异（图。). 病毒蛋白的第一螺旋比Bcl-2和Bcl-x中相应的螺旋短两圈L（左）此外，病毒蛋白中连接α1到α2的环比wt人类蛋白中短得多（图。). 在Bcl-x中L（左）和Bcl-2，该环含有一个半胱氨酸蛋白酶裂解位点，可将这些抗凋亡蛋白转换为促凋亡蛋白。病毒同源物的短环不包含这种半胱氨酸蛋白酶裂解(13,14)或细胞Bcl-2中存在的失活磷酸化位点(16). 病毒蛋白与其细胞同源物之间的其他差异是连接α3到α4和α4到α5的环的长度。在KSHV Bcl-2中，α3和α4之间的环比Bcl-2和Bcl-x中的环短四个残基L（左）而连接α4到α5的环长三个残基。因为这两个区域都位于结合沟的外围，所以预计它们不会对KSHV Bcl-2与其他凋亡蛋白的结合起主要作用。
KSHV Bcl-2的比较(一)至Bcl-xL（左）(B类)和Bcl-2(C类). 疏水沟槽的残留物，与与Bcl-x络合时接触Bak和Bad肽的那些肽同源L（左）与NWGR序列的色氨酸残基一起显示。为了强调蛋白质结构区域的差异，我们对Bcl-2和Bcl-x的截短形式进行了比较L（左）(17,18).
Bcl-x之间观察到的显著结构差异L（左）Bcl-2涉及α3周围的区域(17). 在Bcl-2中，紧密弯曲将α2与α3分开，而在Bcl-x中L（左）一个短环将这两条螺旋线分开。此外，α3被翻译为Bcl-x中蛋白质的核心L（左）与Bcl-2相比。在病毒蛋白中，α3周围的区域更像Bcl-2而不是Bcl-xL（左）（图。). 然而，病毒蛋白中的残基是不同的，这对结合槽底部的化学特性有影响。
促凋亡BH3肽的识别。
Bcl-2家族成员之间的结合相互作用显示出明确的选择性(17,18). 为了研究KSHV Bcl-2的选择性，我们使用基于荧光偏振的分析来测量来自促凋亡蛋白Bak、Bax和Bad的一系列含BH3肽的亲和力（表). 早期关于Bcl-x的研究L（左）BH3肽结合和全长蛋白结合之间显示出良好的相关性(33,34). 在本研究中，我们发现Bak肽紧密结合(K（K）d日<50 nM）到病毒KSHV Bcl-2。这些结果与早期报告不一致，该报告表明KSHV Bcl-2在细胞分析中不与全长Bak结合(12). Bax肽也与KSHV Bcl-2结合，尽管与Bak相比亲和力降低，Bad 25-mer与病毒Bcl-2的结合更弱。
表2
| BH3肽 | K（K）d日，纳米
|
|---|
| KHSV Bcl-2型 | Bcl-x公司L（左） | Bcl-2型 |
|---|
| GQVGRQLAIIGDDINR（wt Bak） | <50* | 480† | 12,710§ |
| KKLSECLKRIGDELDS（重量Bax） | 980 | 13,000‡ | 5, 200 |
| NLWAAQRYGRELRRMSDEFVDSFKK（wt错误） | 3,900 | 0.6† | 15§ |
观察到的病毒蛋白对Bak、Bax和Bad肽的特异性与对Bcl-2或Bcl-x的特异性非常不同L（左）(17,18). 如表所示，Bcl-xL（左）与Bak和Bad肽紧密结合，但与Bax肽的结合较弱，而Bcl-2与Bad肽紧紧结合，但仅与Bak肽和Bax肽弱结合。基于其促进细胞凋亡的假定机制，病毒蛋白对Bak和Bax肽比Bad肽更大的亲和力是令人感兴趣的。Bak和Bax直接参与细胞死亡所需的线粒体功能障碍，而Bad和其他BH3-only家族成员是Bak和Bax同源寡聚的组织特异性触发器(35).
在V74、L78和I85将Bak肽突变为丙氨酸会导致肽对KSHV Bcl-2的亲和力大幅降低（表). 在Bcl-x的结构中L（左）/Bak肽复合物，这些残基被观察到与Bcl-x凹槽中的残基发生疏水性接触L（左）(18)事实上，这些突变对Bak肽对Bcl-x的亲和力有类似的影响L（左）此外，天冬氨酸-83突变为丙氨酸会降低Bak肽对KSHV Bcl-2的亲和力，尽管没有观察到Bcl-x的亲和力大L（左）.
表3
Bak肽突变体与KSHV Bcl-2和Bcl-x的结合L（左）
| 肽 | KSHV Bcl-2型K（K）d日，毫微克 | Bcl-x公司L（左）K（K）d日，毫微克 |
|---|
| GQVGRQLAIIGDDINR公司 | <50 | 480* |
| GQ公司一GRQLAIIGDDINR公司 | >10,000 | >10,000† |
| GQVGRQ公司一AIIGDDINR公司 | >10,000 | >10,000† |
| GQVGRQLAIIGDD公司一尼泊尔卢比 | >10,000 | >10,000† |
| GQVGRQLAIIG公司一DINR公司 | 149 | >10,000† |
为了研究Bak和Bax BH3肽与KSHV Bcl-2结合的位置，我们监测了用肽滴定后酰胺和甲基共振的光谱变化。在滴定过程中发生显著变化的酰胺和甲基基团共振绘制在蛋白质表面，如图所示。如预期，受到显著影响的残留物位于KSHV Bcl-2的BH1、BH2和BH3区域形成的凹槽中。Bcl-x的氨基酸侧链L（左）与结合的Bak和Bad肽紧密接触，如图所示。其中一些残基在KSHV Bcl-2（F105、F146、R138和A142）中是相同的，一些是保守取代的（L108M、V130I和V141L），而其余的在两种蛋白质（A93Y、F97L、A104L和L130G）之间的性质差异很大。因此，尽管KSHV Bcl-2的结合槽与Bcl-x中的结合槽一样明显具有疏水性L（左）和Bcl-2，病毒蛋白和肽之间的接触表面可能有很大不同。
溶剂可及表面，显示KSHV Bcl-2的疏水性凹槽。的方向一与图中相同。C类然而B类是相反的面。当Bak的BH3肽被滴定到蛋白质溶液中时，残留物发生显著变化，呈洋红色。
通过定点突变研究了NWGR序列中保守的甘氨酸和精氨酸残基的重要性。这些残基（G85A、G85V和R86Q）的突变大大降低了病毒Bcl-2对荧光标记Bak肽的亲和力，其解离常数分别为4800、>10000和1900 nM。wt蛋白显示144 nM肽的离解常数。因为15这些突变蛋白的N个异核单量子相干光谱与wt蛋白的基本相同，观察到的亲和力变化很可能是因为突变蛋白与肽接触的变化。对于甘氨酸突变体，亲和力降低与基于Bcl-x复合物结构的预期一致L（左）含有Bak和Bad肽(18,30). 在这两种复合物中，肽与甘氨酸紧密结合，表明较大的残基，如丙氨酸或缬氨酸，将导致不利的空间接触。
在Bcl-x中L（左）/Bak复合物，标志性精氨酸残基的侧链定位为与Bak肽的Asp-83进行良好的静电接触，事实上，这种精氨酸在Bcl-x中突变为谷氨酰胺L（左）抑制其与Bax蛋白的结合。类似地，KSHV Bcl-2蛋白R86Q的相同突变降低了其对Bak肽的亲和力，尽管其效果不如Bcl-x的显著L（左）这些数据虽然令人惊讶，但与D83A-Bak肽突变体减少但没有消除肽结合的观察结果一致（表). 因此，这些数据表明，肽D83和蛋白质R86之间的相互作用在KSHV Bcl-2中不如在Bcl-x中重要L（左）.
