磷脂酰丝氨酸增强包膜病毒进入

摘要

包膜病毒载体，特别是逆转录病毒载体和包含水疱性口炎病毒包膜糖蛋白（VSV-G）的载体，目前用于从诱变到基因治疗的广泛应用（例如，参见参考文献2,16、和43). 然而，许多应用受到载体滴度的限制。浓缩病毒可以绕过这一限制，但浓缩对一些病毒来说很困难，包括许多常见的逆转录病毒。感染期间加入聚阳离子，如聚布林、鱼精蛋白硫酸盐或带电聚合物，也可以提高感染率(20,21,23,38,40). 人们认为，通过减少病毒包膜和细胞之间的排斥反应，可以改善感染(12,13).

我们最近发现，用磷脂酰丝氨酸（PS）组成的脂质体治疗靶细胞也可以增强两种不同包膜病毒载体的感染(10). Polybrene的这种效果是累积的，因此表明PS治疗将为增强病毒感染提供一种有用的工具。在此，我们进一步描述了这种现象，并发现PS治疗可能会影响病毒融合。

当存在功能性病毒受体时，PS对靶细胞的治疗会增强多包膜病毒的感染。

我们用PS处理了多种细胞类型，并将其暴露于几种不同的病毒载体中，以检查PS增强转导的特异性和程度（表​（表1）。1). 所有细胞均表达所用病毒载体的功能受体。携带LAPSN逆转录病毒载体的病毒(27)编码人类胎盘碱性磷酸酶（AP）或LNCG逆转录病毒载体(32)编码绿色荧光蛋白（GFP），并使用以下表达所示Env蛋白的包装细胞系制备：PA317（嗜热性小鼠白血病病毒[MLV]株4070A）(24); FlyRD（RD114）(11); PJ4（jaagsiekte绵羊逆转录病毒[JSRV]）(30); 和PG13（长臂猿白血病病毒[GALV]）(25). 如前所述，通过转染制备VSV-G假型载体(10). 用PS处理靶细胞使这些病毒的转导增加了2到20倍。我们还检查了这种增强与Polybrene提供的增强之间的关系，并确定这些处理具有协同效应。例如，Rat-2/Hyal2细胞的JSRV感染被Polybrene单独增强了4倍，PS单独增强了6倍，两者结合增强了25倍（两个实验结果的平均值）。

我们尝试使用PS治疗增加两种非包膜病毒对HT-1080细胞的感染，这两种病毒是一种5型腺病毒载体（Ad.RSV-βgal）(42)和腺相关病毒2型载体（CWCZn）(15)，两者均编码β-半乳糖苷酶。在这些病例中，PS治疗实际上分别减少了75%和25%的病毒感染。这些结果表明，PS不会刺激这些非隐匿病毒载体的感染，并且表明PS增强感染可能发生在病毒进入的融合步骤，而非隐匿的病毒不需要该步骤。

在没有功能性受体的情况下，靶细胞的PS治疗不允许病毒进入。

为了测试病毒感染的增强是否与受体无关，我们将多种细胞系暴露于病毒中，这些病毒通常由于缺乏功能性受体而无法感染这些细胞。我们测试了使用PE501逆转录病毒包装细胞制作的Moloney MLV假型LAPSN载体(26)HT-1080和HEK 293人类细胞；大鼠细胞系208F、NRK和rat-2上的JSRV伪型LAPSN载体；基于NIH 3T3小鼠细胞的GALV假型LAPSN载体；以及CHO-K1仓鼠细胞上的异种MLV（AKR6）假型LAPSN载体。LAPSN（AKR6）异型病毒是通过感染印度侏儒小鼠带有LAPSN和可复制AKR6病毒的尾部成纤维细胞(8). 未检测到转导（<1 AP⁺病灶形成单位/ml），在所有这些病毒-细胞组合的两个独立实验中使用或不使用PS。阳性对照感染表明，所有这些细胞类型都可被识别细胞表达受体的逆转录病毒载体感染（数据未显示）。

PS处理会暂时增加靶细胞上细胞表面PS的数量。

为了进一步表征PS治疗的效果，我们研究了外源性添加的PS脂质体是否被纳入靶细胞的质膜中。PS处理后NIH 3T3、ZF4、HT-1080和Rat-2细胞中测得的细胞表面PS水平增加如图所示。​图1。1在这些细胞类型中，背景PS水平和添加PS脂质体后增加的幅度都不同。然而，细胞表面PS水平的增加之间没有明显的相关性（图。​（图1）1)以及病毒感染增强的程度（表​（表1）。1). NIH 3T3和Rat-2细胞上各种病毒受体的表达不会影响PS水平或本试验中对PS脂质体的反应（重复试验中变化<5%[数据未显示]）。PS处理72小时内，处理细胞的PS水平恢复正常，细胞的传染性与未处理细胞相同（数据未显示）。

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图1。

PS处理增加了各种细胞类型中细胞表面PS的数量。细胞用400μM的PS处理24小时，并用荧光染料标记的膜联蛋白-V染色表面PS水平，如前所述(10). 这种蛋白质与PS紧密而特异地结合，通常用于测量细胞表面PS水平(三,19,35-37). 虚线表示未处理的细胞，细线表示标记有膜联蛋白V的对照细胞，粗线表示标记了膜联蛋白-V的PS处理细胞。每个峰包含大约10000个细胞。

靶细胞对PS治疗的剂量反应因细胞类型而异。

除了PS对病毒感染有不同的影响外，不同的细胞株对添加PS也有不同的反应。少数细胞株表现出中度死亡和生长抑制，而大多数细胞株受影响较小。添加400μM PS脂质体后，细胞表面PS水平的细胞类型之间的变化如图所示。​图11.

为了检查感染对不同剂量PS的剂量反应，将HT-1080和Rat-2/Hyal2细胞与不同水平的PS孵育24小时，并测定接触LAPSN（JSRV）病毒后的感染率（图。​（图2）。2). 对于Rat-2/Hyal2细胞，PS的最佳浓度为80μM，而HT-1080细胞的最佳浓度是320μM。在PS水平最高时，Rat-2/Hyal2细胞开始死亡，而HT-1080细胞对这种毒性的抵抗力更强（数据未显示）。由于细胞对PS的剂量反应因细胞类型而异，因此确定特定细胞类型的PS最佳浓度非常重要。我们的结果表明，通过使用比表中所用浓度更低的PS处理细胞，某些细胞类型可能会获得更高水平的增强​表11.

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图2。

不同浓度的PS对两种细胞类型的病毒感染的影响。对HT-1080和Rat-2/Hyal2细胞进行PS处理，并通过LAPSN（JSRV）进行病毒感染，但添加浓度为400、320、240、80、32和6.4μM的PS脂质体除外。所示数据为三口井的平均值±标准偏差。这个实验重复了一次，结果相似。

添加其他磷脂不会影响包膜病毒感染。

为了探讨磷脂的添加对细胞膜的非特异性破坏导致PS感染增强的可能性，我们检测了由其他磷脂组成的脂质体的作用。我们以前的工作表明磷脂酰胆碱（PC）脂质体对ZF4细胞中的VSV-G和RD114假载体感染没有影响(10). 除PS和PC外，还用磷脂酰甘油（PG）和磷脂酰乙醇胺（PE）处理Rat-2/Hyal2细胞。选择这些脂质是因为它们与PS相似，并且在膜融合中具有潜在作用；PG可能与人类免疫缺陷病毒1型融合肽相互作用，在慢病毒融合中发挥作用(28,29)PE具有促进双层到六角形相变的能力，这可能有助于膜融合(34). 添加PC、PG或PE不会影响annexin-V染色测量的靶细胞中的PS水平（重复实验中变化<5%）。这三种磷脂中没有一种对病毒感染有明显影响，而PS的添加导致了LAPSN（JSRV）病毒感染的大幅增加（图。​（图3）。三). HT-1080细胞的LAPSN（RD114）病毒感染也有类似结果（数据未显示）。

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图3。

与其他磷脂相比，PS对感染的增强具有特异性。如文中所述，对Rat-2/Hyal2细胞进行LAPSN（JSRV）感染。相同的方案用于制备脂质体我-α-磷脂酰-数字图书馆-甘油，我-α-磷脂酰胆碱，以及我-如PS所述的α-磷脂酰乙醇胺（Sigma）。将脂质体添加到400μM的细胞中24小时。所示数据为两个实验的平均值±标准偏差，每个实验重复进行。

PS处理对病毒受体水平或Env与细胞的结合几乎没有影响。

为了研究PS治疗是否通过增加病毒受体水平或增加病毒与细胞的结合来增加病毒感染，我们测量了细胞表面受体水平和JSRV Env与Rat-2/Hyal2细胞的结合。Rat-2/透明质2细胞含有氨基末端FLAG标记的透明质2蛋白，该蛋白作为JSRV的受体(31). 使用或不使用80μM PS处理这些细胞24小时，并使用抗FLAG抗体测量受体水平（图。​（图4）。4). 使用这种浓度的PS是因为它最大限度地增加了这种细胞类型的传染性（图。​（图2）2)因此，应该最大限度地改变影响增长的因素。在同一分析中，如前所述，使用JSRV Env表面域-人免疫球蛋白G融合蛋白（JSU-IgG）测量JSRV与Env的结合量(39)（图。​（图4）。4). PS处理后，Hyal2蛋白和JSU-IgG结合水平均增加了2倍。此外，单细胞的背景荧光随着PS处理而增加，进一步降低了测量效果。这些微小的变化不太可能解释PS治疗后在这些细胞中观察到的JSRV感染增加了七倍。PS处理对受体水平和病毒结合均无显著影响，这进一步支持了PS处理增强病毒进入融合步骤的假设。

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图4。

PS治疗对病毒结合和受体水平的影响。左侧面板显示了FLAG抗体与Rat-2/Hyal2细胞的结合，有和没有PS处理。用80μM PS处理细胞24小时。虚线表示无抗体细胞的荧光水平；虚线表示仅与二级抗体孵育的细胞；并且实心重线表示用抗FLAG抗体和第二抗体孵育的细胞。右侧的两个面板显示了JSU-IgG与Rat-2/Hyal2细胞的结合，包括PS处理和未处理。两组实验均使用相同的PS制剂同时进行。虚线表示无抗体细胞的荧光水平；虚线表示仅与二级抗体孵育的细胞；实心重线代表用JSU-IgG（21μg/ml）和二级抗体培养的细胞。每个峰包含大约50000个细胞。该实验再重复三次，峰的相对位置变化≤10%。

PS脂质体易于大批量生产，可以冷冻而不丧失活性。

对于迄今为止所描述的所有实验，为了保持一致性，在每次实验之前都要生产新鲜PS。作为增强病毒感染的通用工具，制备大量PS脂质体并将其冷冻成等分，将更加方便。我们发现PS脂质体无论是大批量还是小批量生产，对细胞都有相同的作用（数据未显示）。因此，我们分几个大批次生产PS，并将等分样品保持在4°C或−20°C。在两个实验中，保持在4°C的脂质体在3天内失去了约25%的活性。然而，储存在−20°C下的等分样品至少能保持30天的有效性（数据未显示）。事实上，PS脂质体冷冻后的有效性增加了两倍，持续了30天（两次实验的结果[数据未显示]）。

PS治疗最有可能影响病毒融合。这一结论得到了如下事实的支持：在感染显著增加的情况下，PS治疗对受体水平和病毒结合的影响最小。此外，感染增强仅发生在包膜病毒中，而不发生在两种未包膜病毒测试中。我们不认为这种增强是与病毒吸附有关的电荷效应，例如聚brene，因为聚苯乙烯带负电荷，阴离子反复被证明可以减少病毒感染(4,22,38). 质膜中PS浓度的大幅增加可能会影响病毒融合的许多方面，例如脂质堆积、双层曲率的改变、膜流动性的改变以及双层相中局部诱导的变化（有关综述，请参阅参考文献33). 需要进一步的生物物理研究来阐明PS增强病毒融合的特殊机制。

我们的结果表明，PS细胞表面水平的增加会导致病毒感染的相应增加。有趣的是，PS通常主要存在于质膜的内叶上，而在细胞外发现的PS含量相对较低(6,41,44). 细胞中PS的典型水平可能是影响正常病毒融合的限速因素。

病毒-细胞融合是一个复杂且尚未完全理解的过程（有关综述，请参阅参考文献5,9、和33). 到目前为止，还没有提出PS在包膜病毒融合中的作用，尽管有证据表明PS在Sindbis病毒复制中的进入后要求(18)以及Semliki Forest病毒的mRNA帽盖(1). 病毒粒子中PS的存在可能在人类免疫缺陷病毒感染中起支持作用(7). 同样，将PS包含到仙台病毒病毒体中可以提高病毒体/细胞融合水平(17). 然而，之前还没有发现靶细胞膜中的磷脂酰丝氨酸水平在病毒进入中起任何作用。我们的结果表明，PS在促进包膜病毒融合方面发挥了作用，可以用作增加感染率的通用工具。

致谢

参考文献