肾内细胞而非骨髓来源细胞是再生的主要来源缺血后肾脏

肾内细胞的肾小管再生。

女性cre公司^{科威特先令};Z/EG公司如前所述，对小鼠（6-8周龄）进行左肾单侧IRI 45分钟(13). 为了同时测量外源性骨髓干细胞的掺入，向小鼠注射从雄性C57BL/6小鼠分离的BMC。给年龄匹配的假手术小鼠注射BMC作为对照。左肾出现广泛的肾小管坏死和凋亡，刷状缘膜丢失，细胞从基底膜上脱落，一些细胞出现核浓缩（图​（图2A）。2A） ●●●●。细胞死亡后细胞增殖，IRI后2天外髓质外条纹中PCNA的表达证明了这一点（图​（图2B）。2B） ●●●●。肾脏的这一区域包含近端小管的S3段，特别容易受到缺血损伤。PCNA在缺血后肾脏中的表达具有时间依赖性。IRI后1天，9.4%±2.0%的肾小管细胞表达PCNA，2天表达更高（34%±5.1%；n个= 4). 相反，假手术后2天，年龄匹配的对照肾脏中PCNA的表达为0.68%±0.07%(n个= 4). IRI后7天，PCNA表达降至16%±2.5%，28天时，仅有0.2%±0.04%的细胞表达PCNA，与年龄匹配的对照肾脏中观察到的0.07%水平无显著差异。

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图2

表达EGFP的肾小管上皮细胞中的肾小管损伤和细胞增殖。在肾组织切片中进行PAS染色和免疫染色cre公司^{科威特先令};Z/EG公司肾IRI小鼠(一)IRI后2天肾脏的PAS染色。肾小管损伤表现为刷状边界膜的丢失、细胞从基底膜分离以及一些细胞中的核凝结（箭头）。(B类)PCNA在肾小管细胞中的表达（红色，箭头所示）。(C类)肾小管内BrdU掺入的低倍图像。一些含BrdU的细胞（红色，箭头）与EGFP表达细胞（绿色）共定位。箭头表示BrdU并入EGFP-阴性细胞。(D类)表达EGFP的上皮细胞中BrdU掺入（红色，箭头）（绿色）。用DAPI对细胞核进行复染，并合并图像(B类–D类). 比例尺：20μm。

我们测量了BrdU掺入量以评估细胞再生(10). 在小鼠缺血损伤后14天内注射BrdU，然后取肾，切片，并用抗BrdU抗体染色。图​图2C2C是缺血后肾脏的低倍图像，显示肾小管细胞中BrdU掺入，其中一些表达EGFP。第28天，当在2个相邻肾切片上平均计算1100个细胞核时，7.6%±0.3%的肾小管细胞合并了BrdU(n个= 3). 相比之下，只有0.4%±0.13%的肾小管细胞将BrdU掺入到假手术小鼠肾脏中(n个= 4). 大多数BrdU阳性细胞位于外髓质的外条，LTA染色阳性，表明它们代表近端小管的S3段。在THP表达的厚升支和水通道蛋白-2表达的集合管中也检测到BrdU阳性细胞（数据未显示）。这些结果表明损伤后肾小管再生良好。用BrdU和EGFP抗体对缺血肾脏进行修饰，结果表明BrdU被整合到EGFP阳性细胞的DNA中（图​（图2D）。2D） ●●●●。这些结果为EGFP表达的肾小管细胞再生肾小管提供了直接证据。

在对侧非缺血肾脏中也观察到BrdU掺入（数据未显示）。然而，我们在未受损肾脏的EGFP阳性细胞中未检测到BrdU。为了评估EGFP表达细胞的细胞再生程度，我们测量了近端小管中EGFP表示细胞的数量，这是发生更多损伤和再生的部位。正如EGFP在cre公司^{科威特先令};Z/EG公司小鼠，并非所有近端肾小管细胞都表达EGFP。由于近端小管中EGFP表达的基线水平较低，变化是可以量化的，而远端肾单位中的基线表达过高，无法检测到标记细胞百分比的变化。在损伤肾脏中，54%±4.9%的近端肾小管细胞呈EGFP阳性，而在未损伤肾脏中34%±7.8%的近侧肾小管上皮细胞呈EGF阳性。损伤细胞和未损伤细胞之间EGFP表达细胞的百分比差异具有统计学意义(n个= 4;P（P）< 0.05). 总之，这些结果表明，上皮细胞是肾小管修复的主要前体，这是从损伤中恢复的肾脏近端小管中EGFP阳性细胞数量增加的原因。

成熟上皮细胞去分化是肾脏修复的机制。

检测再生肾脏中2种去分化标记物Pax2和vimentin的表达(三,14). 损伤后第3天，近曲小管部分区域的细胞缺乏刷状边界，如LTA染色缺失所示。这些区域的细胞表达Pax2（图​（图3A）。三A） ●●●●。在Pax2重新表达的近端小管中，37%±0.2%的细胞掺入BrdU(n个= 3). Pax2的近端肾小管表达在假手术肾脏或对侧非缺血肾脏中未观察到。在表达Pax2的小管中，细胞周期素依赖性激酶抑制剂p21的表达下调（图​（图3B）。三B） ●●●●。波形蛋白是去分化肾小管细胞的标记物，在近端肾小管中检测到（图​（图3C）。三C） ●●●●。重要的是，波形蛋白在EGFP阳性细胞中表达（图​（图3D），三D） 这表明去分化细胞来源于先前存在的成熟肾小管上皮细胞。在对侧肾的任何小管中均未检测到波形蛋白的表达。IRI后28天，在任何小管中都没有检测到波形蛋白的表达，在近端小管中也不再检测到Pax2。这些结果表明再生的小管已经成为成熟的上皮细胞。

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图3

肾小管修复过程中上皮细胞的去分化。在肾切片中进行免疫染色cre公司^{科威特先令};Z/EG公司肾IRI小鼠(一)在LTA阳性（绿色）近端小管中Pax2（蓝色，箭头）的表达。注意Pax2在损伤区的核定位缺乏LTA刷状边界染色。同一小管也含有含有BrdU（红色箭头）的细胞。(B类)在表达Pax2的细胞中下调p21（红色）（蓝色，箭头）。(C类)波形蛋白（红色）在LTA阳性（绿色）近端小管中的表达。(D类)表达EGFP（绿色）的上皮细胞中波形蛋白（红色）的表达。共存波形蛋白和EGFP的细胞呈黄色。(E类)EGFP表达细胞（绿色，箭头）显示BrdU（红色）的掺入和AQP3（蓝色）的基底侧表达。(F类)加入BrdU（绿色）的细胞建立了细胞间连接并表达ZO-1（红色，箭头所示）。用DAPI对细胞核进行复染(C类,D类、和F类)和图像已合并。比例尺：20μm。

结合BrdU的EGFP表达细胞重建了细胞极性，如基底细胞膜上AQP3的存在所示（图​（图3E）。三E） ●●●●。闭塞带1（ZO-1）的定位表明BrdU阳性细胞周围顶端紧密连接的形成（图​（图3F）。三F） ●●●●。增殖的AQP3表达细胞的存在表明，在这种IRI模型中，集合管细胞受到损伤并再生。

固有肾细胞是肾再生的主要来源。

在6至8周龄野生型同源雌性小鼠中，分析肾小管衍生细胞和BMC衍生细胞对肾再生的相对贡献，这些小鼠接受了6至8周龄野生型雄性供体的BMC。为了区分雄性细胞和雌性细胞，我们进行了Y染色体FISH，并通过抗BrdU染色鉴定了增殖细胞。在损伤后28天，即肾脏再生完成的时间点，采集肾脏，并将4μm厚的切片与Y染色体绘制探针杂交。我们通过分析未接受BMC移植的雄性和雌性小鼠的肾脏来测量Y染色体FISH的敏感性和特异性。在雄性小鼠肾脏细胞的细胞核外围检测到丰富的Y染色体信号（图​（图4A）。4A） ●●●●。FISH的敏感性计算为64%(n个= 5). 相反，女性肾脏中完全没有Y染色体信号（图​（图4B；4B类；n个=5），对应于100%的特异性。在外髓质外条的10个随机选择的区域内计数BrdU阳性细胞、Y染色体阳性细胞和总管状细胞(n个= 4). 结果总结见表​表1。1Y染色体阳性细胞的百分比根据Y染色体FISH分析的64%灵敏度进行校正。在小管中的所有BrdU阳性细胞中，89%不包含Y染色体，这表明它们来源于宿主细胞。其余11%的肾小管细胞含有Y染色体，这表明它们来源于注射的BMC。因此，固有肾细胞是肾小管再生的主要来源。

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图4

骨髓基质细胞对肾小管再生的影响(一–H（H）)和肾功能(我). (一)丰富的Y染色体信号位于雄性小鼠肾脏细胞核的外围（红色，箭头），与Y染色体的典型核定位一致。FISH分析的敏感性为64%(n个= 5). (B类)未接受雄性BMC移植的雌性小鼠肾脏显示完全没有Y染色体信号。(C类)含有BrdU（绿色）的管状细胞显示存在Y染色体（红色，箭头所示）。(D类–F类)Y染色体FISH（红色）随后进行肾小管上皮细胞标记物（绿色）的免疫染色。(D类)箭头表示Y⁺细胞角蛋白⁺管状上皮细胞。(E类)箭头表示Y⁺长期协议⁺近端管状细胞。(F类)箭头表示Y⁺AQP3类⁺收集导管细胞。注意AQP3的基底外侧染色，它定义了Y的管内定位⁺细胞。(G公司)注射雄性BMC的野生型雌性小鼠肾脏中含有Y染色体的管状细胞（箭头）cre公司^ksp公司;Z/EG公司捐赠者。箭头表示间质细胞。(H（H）)中显示的同一单元格G公司免疫染色显示EGFP为阴性（箭头）。细胞核用DAPI复染(一,B类、和D类–H（H）)和图像已合并。比例尺：20μm。(我)未接受BMC注射的假手术小鼠（对照组；填充三角形）、未接受BMC注射的肾性IRI小鼠（IRI–BMC；开放圆）和接受BMC注射液的肾性IR小鼠（IRI+BMC；填充圆）的BUN水平。在注射或不注射BMC的小鼠中未观察到具有统计学意义的差异。n个每个时间点=5–13；总共84只小鼠。

表1

肾细胞是肾小管再生的主要来源

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骨髓细胞可以成为肾小管上皮细胞。

我们之前已经表明，在肾IRI后，将从雄性Rosa26小鼠分离的分选造血干细胞移植到非转基因雌性受体中，会导致近端小管中出现β-gal阳性细胞(16). 此外，雄性特异性PCR斯里基因和Y染色体FISH显示雌性肾脏中存在雄性衍生细胞。为了更清楚地定义肾脏中的供体来源细胞，我们先进行Y染色体FISH，然后进行免疫组化(27). 损伤后28天，在肾小管的Y染色体阳性细胞中检测到BrdU掺入，这表明BMC衍生细胞增殖（图​（图4C）。4C） ●●●●。在小管中未检测到CD45阳性细胞，这表明没有浸润性造血细胞（小管炎）。为了确认BMC肾小管上皮细胞的形成，我们进行了Y染色体FISH分析，然后用上皮细胞标记细胞角蛋白进行免疫染色。在表达细胞角蛋白的细胞中检测到Y染色体（图​（图4D）。4D） ●●●●。在IRI小鼠模型中，肾近端小管承受的损伤最大，再生最活跃(三,28). 近端小管特异性凝集素LTA染色显示近端小管状细胞中存在Y染色体（图​（图4E）。4E） ●●●●。收集管中也观察到BMC衍生细胞，收集管被认为对IRI具有相对抵抗力(三). Y染色体阳性集合管细胞表达AQP3，这表明它们是主要细胞（图​（图4F）。4F） ●●●●。此外，AQP3对基底外侧膜的标记清楚地定义了BMC衍生细胞的管内定位。综上所述，这些结果表明BMC可以分化为表达管状结构蛋白和水通道的管状上皮细胞。当BMC与男性分离时cre公司^{科威特先令};Z/EG公司将小鼠移植到患有肾IRI的野生型雌性小鼠中，虽然肾小管中存在Y染色体阳性细胞，但未检测到天然EGFP荧光或免疫染色的EGFP表达（图​（图4，4、G和H）。这一结果表明，在肾脏中观察到的EGFP阳性细胞并非来源于BMCs。

骨髓基质细胞对肾脏修复的贡献很小。

肾IRI导致肾小球滤过率降低和血尿素氮（BUN）水平升高。IRI后，肾小球滤过率（GFR）在1周内恢复到接近基线水平(29). 我们测量了未注射BMC的假手术小鼠和注射或不注射BMC左肾IRI小鼠的BUN水平。从携带CD45.1的雄性B6-Ly5.2/Cr小鼠中获取骨髓细胞，并将其注射到携带CD45.2的受体雌性C57BL/6NCr小鼠中。切除右肾以消除其对肾小球滤过率的影响。手术后1天，假手术小鼠的BUN水平为20±2 mg/dl。相反，未注射BMC的肾IRI小鼠BUN水平升高87±8 mg/dl。BMC注射并未降低肾IRI小鼠的BUN水平（91±12 mg/dl）（图​（图4I）。4一） ●●●●。损伤后1至7天内，注射或不注射BMC的小鼠的BUN水平无统计学差异(n个每个时间点=5–13；总共84只小鼠）。肾功能缺乏改善不是由于BMC移植失败所致。第28天的流式细胞术分析显示，38%的外周有核细胞携带CD45.1供体细胞标志物，这表明成功植入了BMCs。

缺乏肾脏保护作用表明，移植的骨髓细胞在损伤后的第一周对肾脏再生的贡献有限。我们发现，早在损伤后2天，Y染色体阳性细胞就开始出现在间质和肾小球中。然而，在小管中检测到Y染色体阳性细胞的最早时间点是5天。第7天，只有1或2个肾小管细胞/切片呈Y染色体阳性，检测到的Y染色体阳性细胞/肾切片总数不超过8个。

骨髓细胞可以形成多种类型的肾小球细胞。

移植的骨髓细胞除了形成上皮细胞外，还分化为肾小球和间质细胞。肾脏中Y染色体阳性细胞的数量在损伤后随时间增加而增加。我们统计了IRI后28天肾脏中Y染色体阳性细胞以及肾小管、肾小球和间质中Y染色体阴性细胞的总数(n个= 4). 随机选择10个皮质和髓质区域进行计数。结果总结见表​表2。2每1011个肾细胞平均检测到52个Y染色体阳性细胞。这意味着在对Y染色体FISH 64%的敏感性进行校正后，肾细胞总数的8%是供体或衍生的。在这些细胞中，8.4%为肾小管上皮细胞，10.6%为肾小球细胞，81%为间质细胞（图​（图55).

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图5

骨髓衍生细胞形成肾细胞。肾脏中8%的骨髓来源细胞由肾小管上皮细胞、肾小球细胞和间质细胞组成。显示了不同细胞类型的相对百分比。

表2

IRI后28天肾脏Y染色体阳性细胞

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对来自骨髓细胞的肾小球细胞的形成进行了更详细的检查。在所计数的436个肾小球中，180个（41%）含有1-4个Y染色体阳性细胞/肾小球（图​（图6A）。6A） ●●●●。在计数的316个肾小球中，仅检测到1个CD45阳性细胞（数据未显示）。由于普通白细胞抗原CD45仅在造血细胞的细胞表面表达，CD45阳性细胞的稀少表明肾小球中的大多数造血细胞已分化为非造血细胞。或者，骨髓细胞中的间充质干细胞可能有助于肾小球细胞的形成。为了鉴定内皮细胞，我们用番茄红凝集素（LEL）(30). 供体来源的细胞为CD45阴性和LEL阳性，这表明移植的骨髓基质细胞形成了内皮细胞（图​（图6B）。6B） ●●●●。肾小球中的一些供体衍生细胞表达波形蛋白，但不表达Wt1，这表明它们是系膜细胞（图​（图6C）。6C） ●●●●。表达Wt1的供体来源足细胞(31)也检测到（图​（图6D）。6D） ●●●●。在肾小球的所有干细胞中，35%为内皮细胞，31%为系膜细胞，27%为足细胞，7%为壁上皮细胞(n个= 4). 由于肾脏中总计10.6%的骨髓衍生细胞形成肾小球细胞，这些数值表明3.8%的骨髓细胞形成内皮细胞，3.4%形成系膜细胞，3.0%形成足细胞，0.7%形成壁上皮细胞（图​（图55).

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图6

骨髓细胞形成肾小球细胞。Y染色体FISH（红色）后进行肾小球细胞标记物的免疫染色。(一)箭头表示Y⁺CD45型^–肾小球中的细胞。(B类)箭头表示Y⁺爆炸下限⁺内皮细胞。LEL标记为绿色。箭头表示Y⁺爆炸下限^–单元格。(C类)箭头表示Y⁺波形蛋白⁺重量1^–系膜细胞。Wt1在细胞核中标记为蓝色。(D类)箭头指示Y⁺重量1⁺足细胞。Wt1在细胞核中标记为绿色。箭头表示Y⁺重量1^–单元格。用DAPI对细胞核进行复染(一,B类、和D类)和图像已合并。比例尺：20μm。

Y染色体FISH分析。

小鼠Y染色体涂布探针由简并寡核苷酸引物PCR产生，使用Diane Krause（美国康涅狄格州纽黑文耶鲁大学）友好提供的DNA模板，并通过刻痕翻译标记地高辛，如前所述(44). 使用上述方法对福尔马林固定和石蜡包埋肾脏切片（厚度4μm）进行Y染色体FISH分析(27). 使用Cy-3结合的小鼠抗地高辛（Jackson ImmunoResearch Laboratories）来可视化Y染色体信号。分别用未注射雄性BMC的正常雄性和雌性小鼠的肾脏测试Y染色体FISH分析的敏感性和特异性。通过计算Y染色体阳性核数除以总核数[（Y⁺细胞核÷总细胞核）×100%]。

免疫组织化学。

如前所述，在石蜡切片（厚度为4μm）上进行免疫染色(16). 简言之，肾脏切片在4°C下培养过夜，用GFP抗体（1:00；Invitrogen Corp.）、BrdU抗体（1:2.5；BD）、Pax2抗体（1:50；Zymed Laboratories Inc.）、vimentin抗体（1:100；Chemicon International）、p21抗体（1:200；Upstate）、PCNA抗体（1:00:Santa Cruz Biotechnology Inc.）、泛细胞角蛋白抗体（1:500；DakoCytomation）、AQP3抗体（1:1400；Chemicon International）、CD45（1:50；CALTAG Laboratories）、Wt1（1:50，Santa Cruz Biotechnology Inc.）、α-SMA（1:400；Sigma-Aldrich）、ZO-1（1:100，Upstate）、THP（1:100；John Hoyer，美国宾夕法尼亚州费城儿童医院）(45)TSC（1:00；美国马里兰州贝塞斯达NIH Mark Knepper）(46). 清洗后，肾脏切片在室温下与二级抗体孵育1小时。二级抗体包括Alexa Fluor 488结合山羊抗兔或山羊抗鼠IgG、Alexa Fluor 594结合山羊抗家兔IgG和Alexa Fluor 350结合燕麦抗鼠Ig G（1:400；Invitrogen Corp.）。一些肾脏切片用生物素化抗鼠或抗羊IgG孵育，然后用亲和素-荧光素孵育（1:400；Vector Laboratories）。用Vector Laboratories获得的FITC-标记的LTA（1:50）、DBA（1:40）或TEL（1:50。在用Zeiss-Axioplan显微镜在外荧光照明下进行可视化和摄影之前，用DAPI对细胞核进行复染。使用OpenLab 3.1.7版软件对图像进行合并和分析。

CD45.1细胞的流式细胞术分析。

通过穿刺口腔后静脉收集外周血。用0.84%NH溶解红细胞₄Cl.用FITC-coupled anti-CD45.1抗体（1:1000；BD Biosciences-Pharmingen）孵育有核血细胞，并用流式细胞仪（FACScan；BD）进行分析。

我们感谢Jeffery Pippin的技术建议，Sunshine Kucholtz和Diem Van的技术援助，Arthur Weinberg对肾脏组织病理学的审查，以及Michael Rauchman的有益讨论。我们感谢劳雷尔·约翰逊和雪莉·鲍曼的秘书协助。这项工作得到了NIH拨款DK062839（给F.Lin）和DK066535（给P.Igarashi）的支持。