简介
病毒利用内吞途径克服了质膜的屏障进入动物细胞。虽然病毒通过氯氰菊酯包被的凹坑进入已经被广泛研究并得到了很好的理解(沼泽等。, 1984)，病毒通过替代途径进入的特征不太明确。猿猴病毒40（SV40）是一种非包膜病毒，它使用一种明显独特的进入途径到达动物细胞的细胞核。SV40与细胞表面的主要组织相容性复合体（MHC）I类分子结合(布鲁等。, 1992)然后在致密、无板条涂层的凹坑中观察到(卡滕贝克等。, 1989;安德森等。, 1996;斯坦格等。, 1997;诺金，1999;Parton和Lindsay，1999年). 这些凹坑富含小窝蛋白-1，但比小窝蛋白小，增加了小窝蛋白在病毒周围聚集的可能性(斯坦格等。, 1997). 与此模型一致，与含病毒膜相关的小窝蛋白-1水平显示随着时间的推移而增加(斯坦格等。, 1997). 随后，病毒在对胆固醇扰动剂敏感的过程中被内化(安德森等。, 1996). 小窝蛋白在这一过程中的作用是由小窝蛋白的显性阴性突变体也抑制病毒感染这一发现提出的(罗伊等。, 1999). 病毒进入显然没有伴随MHC I类内化(安德森等。, 1998)，在一个依赖于酪氨酸激酶活性的过程中(丹格利亚等。, 1996;Chen和Norkin，1999年;诺金，1999). 早期的电子显微镜研究表明，病毒随后被直接转运到内质网（ER），因为没有发现中间站(卡滕贝克等。, 1989). 细胞表面和内质网之间的直接通路将是一个新发现，尽管与胆固醇氧化酶诱导的小窝蛋白-1从小窝到内质网腔的重新分布类似(聪明等。, 1994).
病毒最终到达细胞核，在那里发生脱膜和复制。在进入途径的某些阶段，SV40病毒似乎会穿过膜进入胞浆，然后通过核孔复合体进入细胞核(聪明等。, 1991;山田和Kasamatsu，1993年). 细胞溶胶微量注射病毒蛋白抗体阻断感染过程(中西等。, 1996)这表明病毒在感染的某些阶段实际上在胞浆中是游离的，但其易位进入胞浆的机制以及参与这一过程的细胞室尚不清楚。
许多毒素从细胞表面逆向运输到内质网，在那里发生转移到胞质溶胶。这对逆行运输过程和易位机制提供了重要的见解。对于霍乱毒素（CT）来说，这一过程已经得到了特别好的表征。CT通过其结合亚单位与细胞表面的神经节苷脂GM1结合。GM1在小窝中稍有富集，但存在于整个细胞表面，包括网格蛋白涂层的凹坑(帕顿，1994年). 使用胆固醇破坏剂的抑制剂研究表明，CT是通过小窝内化的(奥兰迪和菲什曼，1998年). 然而，在缺乏小窝的细胞中，CT也能在胆固醇依赖的过程中有效内化(奥兰迪和菲什曼，1998年). 利用嵌合毒素进行的精细研究表明，与筏结构域的结合对CT的毒性进入至关重要(狼等。, 1998). CT的内化和小窝的萌芽都被认为依赖于动力学(亨利等。, 1998;奥兰迪和菲什曼，1998年). 内化后，CT进入内体，然后反式-高尔基体网络。然后毒素到达内质网，这个过程可以通过实验被布雷费尔德蛋白a（BFA）和微注射涂层抗体阻断(Lencer公司等。, 1993;南比亚尔等。, 1993;马约尔等。, 1998;吉罗德等。, 1999). a亚单位中的KDEL序列和KDEL受体的检索促进了这一过程(马约尔等。, 1998). 到达内质网后，蛋白质二硫键异构酶对毒素进行氧化还原依赖性去折叠(济等。, 2001). 然后，A亚单位被还原成具有酶活性的A1肽，通过Sec61通道易位到胞浆，将粗略内质网识别为易位发生的隔室(施密茨等。, 2000).
尽管最近的形态学研究表明，SV40进入途径中涉及一种新的内体中间物，称为小泡体(Pelkmans公司等。, 2001)，引导SV40沿着该途径的分子机制以及与已知贩运途径的相似性尚不清楚。SV40通路和CT通路之间可能存在明显的相似性，两者均提示涉及小窝、内质网，然后易位到胞浆(Parton和Lindsay，1999年). 这促使我们使用一系列先前显示的抑制CT毒性的操作来检查SV40感染入口。我们现在发现，SV40感染被BFA阻断，在两个不同的步骤受到抑制：初始病毒进入步骤和细胞内步骤。显性阴性ADP-核糖基化因子1（Arf1）突变体、显性阴性Sar1突变体和微量注射βCOP抗体也可阻断感染。这些结果表明，SV40感染要么通过涉及高尔基中间产物的膜转运途径进行，要么需要功能性胞外途径。我们比较了这些SV40感染抑制剂对CT进入的影响，发现Arf1和Sar1突变体都抑制了CT从早期内体向高尔基复合体的转运。我们还发现一种新的CT毒性晚期事件抑制剂二肽N个-苯甲酰氧羰基-Gly-Phe-amide（Cbz-Gly-Phe-NH2）阻断SV40感染的晚期细胞内步骤，为这一新的病毒进入途径提供了新的见解。
材料和方法
抗体和试剂
编码Arf1（Q71L）的表达质粒(Pepperkok公司等。, 1998;吉罗德等。, 1999)，Sar1（H79G）(阿里多等。, 1995;Pepperkok公司等。, 1998)和绿色荧光蛋白（GFP）标记的温度敏感性水疱性口炎病毒糖蛋白（ts-045-G）(规模等。, 1997)和亲和纯化的抗βCOP（EAGE）(Pepperkok公司等。, 1993)前面已经描述过。抗βCOP（EAGE）抗血清（用于免疫荧光标记）和鼠抗蛋白二硫异构酶（PDI）单克隆抗体(皮萨罗-科尔达等。, 1998)分别是Rohan Teasdale和Jenny Stow博士（澳大利亚昆士兰分子生物科学研究所）的亲切礼物。兔SV40中和血清(比泰尔等。, 1984)来自Janet Butel博士（德克萨斯州休斯顿贝勒医学院分子病毒学和微生物学系），亲和纯化抗p23(罗霍等。, 1997)来自Manuel Rojo博士（瑞士日内瓦大学生物化学系）、Ban-Hock Toh博士（澳大利亚墨尔本）针对EEA1的人类抗血清和小鼠抗凝素(Linstedt和Hauri，1993年)来自德国哥廷根的Hans-Dieter Soeling博士也是慷慨的礼物。商业上获得了针对小窝蛋白-3（肯塔基州列克星敦市转导实验室）、GM130（转导实验）和SV40 T抗原（加利福尼亚州圣地亚哥PharMinen）的小鼠单克隆。Brefeldin A、Cbz-gly-phe-NH2、Cbz-gly-gly-NH2、异硫氰酸荧光素（FITC）共轭的CT-B亚单位、未标记的全毒素和CT抗血清从Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）获得。4,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）和德克萨斯红结合转铁蛋白来自分子探针（尤金，OR）。培养基和细胞培养试剂购自Invitrogen（加利福尼亚州卡尔斯巴德）或BioWhittaker（马里兰州沃克斯维尔）。
细胞培养与病毒感染
Vero细胞（非洲绿猴肾细胞，ATCC CCL 81）和CV1细胞（非洲绿色猴肾细胞（ATCC CCL70））在补充10%（vol/vol）最高血清（BioWhittaker）和2 mM的DMEM中保存我-谷氨酰胺加或减青霉素（100 U/ml）和链霉素（100μg/ml）。将编码小窝蛋白-3的重组Semliki森林病毒（SFV）（来自芬兰赫尔辛基国家公共卫生研究所的Elina Ikonen博士）稀释到含有2 mM的无血清培养基中我-加入细胞前加入谷氨酰胺和0.2%牛血清白蛋白。在37°C下感染1小时后，清洗细胞，允许感染持续5小时或更长时间，然后固定和免疫标记小窝蛋白-3，以检测成功感染的细胞。如前所述，从感染的CV1和Vero培养物中制备含SV40的上清液，并随后在感染实验中使用这些病毒库存(斯坦格等。, 1997). 用于生成SV40上清液的库存是Jurgen Kartenbeck博士（德国海德堡德国癌症研究中心细胞生物学部）慷慨赠送的礼物。
微量注射
每种微量注射用抗体样品的制备均如引用的参考文献中所述。在10 mM KH中溶解的纯化兔IgG（Sigma-Aldrich）2人事军官4pH 7.2和75 mM KCl微量注射缓冲液(亨利等。, 1998)对照组注射10mg/ml。在氯化铯梯度上纯化用于微量注射的质粒DNA，并以50–100μg/ml的速度注射到细胞核中。使用计算机辅助的自动微量注射系统（CompiC INJECT，AIS2；Cellbiology Trading，Hamburg，Germany）将抗体和DNA毛细管微量注射到细胞中通过使用由Flaming/Brown P-97微量移液器（Sutter，Novato，CA）从薄壁硼硅酸盐玻璃毛细管（1.2毫米外径；0.94毫米内径）（Clark Electromedical Instruments，Pangbourne Reading，England）拉出的微毛细管。将待注射的细胞镀在小玻璃盖玻片上，并在室温（RT）下注射到含有0.75 mg/ml碳酸氢盐和10 mM HEPES（pH 7.4）的Hanks培养基中。在随后的操作之前，允许细胞在37°C的含有青霉素-链霉素的培养基中在注射后0.5–4小时（或5小时用于注射cDNA的表达）内恢复。
免疫荧光和电子显微镜
需要用SV40 T抗原单克隆抗体进行免疫标记的实验在−20°C的100%甲醇中固定5分钟。需要这种固定的微注射实验通常首先在室温下用4%多聚甲醛（PFA）在磷酸盐缓冲液（PBS）中固定20分钟，然后用100%甲醇固定，如上所述。这减少了甲醇固定对注射抗体的冲刷。所有其他实验仅在室温下用4%PFA在PBS中固定20分钟。免疫荧光分析的细胞处理如下。PFA固定细胞在PBS中的0.1%皂苷中渗透10分钟，然后在50 mM NH中培养4氯在PBS中保持10分钟（用于淬灭醛基），在封闭溶液（由0.2%牛血清白蛋白和0.2%鱼皮明胶组成）中保持20分钟。在含有一级抗体的封闭溶液中培养30分钟后，进行4×5分钟PBS洗涤，然后在含有荧光标记的二级抗体的封锁溶液中培养20分钟。再进行4×5-min PBS洗涤后，将细胞在水中冲洗，并装入Mowiol贴装介质中。在需要核染色的实验中，细胞在1μg/ml DAPI中在PBS中培养2分钟，然后冲洗和安装。用甲醇固定的细胞不需要皂苷渗透。使用奥林巴斯BX60显微镜连接到Daige电荷耦合器设备的相机图像捕获系统。使用Adobe Photoshop 5.0（加利福尼亚州山景城Adobe Systems）制作免疫荧光图像。细胞根据斯坦格等。(1997).
病毒感染的定量
量化每次实验中20个或更多抗体注射细胞和40个或更多转染细胞的感染效率。对于药物治疗和温度敏感性实验，从每种治疗的100个或更多细胞中量化感染效率。
结果
SV40的面到面流量
SV40被小窝内化，然后到达内质网的一个亚结构域。病毒到达小窝的分子机制和分选机制目前尚不清楚。
我们首先通过塑料切片和免疫标记检查了含有SV40的隔室的性质。用SV40孵育21小时的细胞Epon切片显示，病毒位于内质网网状光滑膜区，内质网与核糖体突起的粗面内质网膜相连（图、A和B）。膜紧贴病毒颗粒的表面，表明病毒仍与膜的腔表面结合。这些细胞的超薄冰冻切片被标记有病毒抗体和顺式-高尔基体标记p23或ER标记PDI。病毒膜对顺式-高尔基体/中间隔室被p23抗体标记（我们未公布的数据），但被PDI抗体标记（图C） ●●●●。虽然大多数病毒颗粒在这些非常显著的扩大内质网结构域中观察到，但病毒颗粒偶尔在高尔基复合体附近观察到，可能在高尔基相关膜中观察到（我们的未发表数据），增加了病毒在感染期间可能与这些隔室短暂结合的可能性。
SV40在ER PDI-阳性亚结构域中的电镜定位。Vero细胞在37°C下与SV40孵育18至21小时，然后固定和处理epon包埋（A和B）或冰冻切片（C）。（A和B）SV40聚集在粗糙内质网的一个区域。病毒颗粒（大箭头）位于粗糙内质网膜的光滑区域；核糖体（B中的小箭头）在连接到含有SV40的结构的池中很明显。（C） 标有SV40（大金色，大箭头）和PDI（小金色，小箭头）的冰冻切片，显示病毒与ER标记的共定位。N、 细胞核。棒材，200 nm。
Brefeldin A抑制SV40的入境和入境后贩运
上述观察结果促使我们进一步研究SV40以与许多细菌毒素相似的方式短暂通过高尔基体室的可能性，这些细菌毒素也遵循内吞途径到达内质网。由于感染中的短暂中间产物可能难以从形态学上识别，并且病毒感染过程相对不同步，因此我们选择使用定义的膜转运抑制剂和感染检测来进一步描述转运途径。
我们首先利用真菌代谢产物BFA检测了高尔基复合体在SV40贩运途径中的可能参与。该药物抑制小GTPase Arf1上的鸟嘌呤核苷酸交换(Jackson和Casanova，2000年)，一种适配器蛋白，负责将COPI涂层募集到内胚体和生物合成膜上。结果是抑制了从内质网到高尔基复合体的顺行运输(米苏米等。, 1986)以及高尔基体与内质网的伴行小管化和融合(利平科特·施瓦茨等。, 1989;舍尔等。, 1997). 因此，BFA被广泛用于抑制高尔基复合体和ER之间的顺行和逆行运输。Vero细胞用BFA预处理3h，然后用SV40和BFA孵育21h，然后固定和免疫标记病毒编码的T抗原（T-ag）。如图所示，BFA是SV40感染的有效抑制剂。当浓度低至0.1μg/ml时，我们观察到99%的感染抑制（图E） ●●●●。这些相对较低剂量的0.1和0.5μg/ml BFA被发现分别在治疗1和3小时内有效地破坏高尔基体形态（图、A和B）。
SV40感染早期事件的BFA敏感性。高尔基体标记物giantin的免疫标记显示，0.1μg/ml BFA处理3 h（B）可以破坏Vero细胞的高尔基复合体（参见A中未处理的细胞）。用0.1μg/ml BFA处理Vero细胞3小时，然后在药物持续存在的情况下用SV40感染21小时，观察到对病毒感染的有效抑制（E；+BFA对照）。SV40的免疫标记（绿色）和DAPI的核染色（蓝色）显示，BFA（D）处理的细胞周围有病毒积聚，这种模式与未处理的细胞（C）明显不同。（E） 当在感染开始后的不同时间点应用3h BFA治疗时，SV40感染早期而非晚期事件对药物的敏感性是明显的。给出了一个具有代表性的实验。（F） BFA抑制SV40的内化。允许在0.5μg/ml BFA中培养1 h的Vero细胞在37°C的温度下，在药物存在或不存在的情况下内化SV40 2 h。随后将细胞暴露在SV40中和抗血清中，可以在没有药物的情况下，在感染46小时之前灭活所有表面暴露的病毒。T-ag的固定和免疫标记显示，与未经处理的对照组相比，BFA处理的细胞中病毒感染对中和抗血清的敏感性大大提高。给出了一个具有代表性的实验。感染效率与未接触中和抗血清的对照组的感染效率标准化。（G） Vero细胞的Epon切片在0.3μG/ml BFA中培养3小时，然后在药物存在下感染SV40 21小时。薄片显示细胞表面积聚病毒颗粒，如插图中低倍放大所示。病毒在表面上正常的小窝状内陷（箭头）中积聚。空腔也很明显（箭头）。（H） BFA抑制SV40的细胞内运输。在接触中和抗血清之前，Vero细胞在37°C下感染SV40 2 h。随后，在感染的剩余20小时内，使用或不使用0.5μg/ml BFA进行培养，然后对T-ag进行固定和免疫标记。细胞计数显示，与未经处理的对照相比，BFA处理的细胞对感染有很强的抑制作用。感染效率与未经治疗的对照组相比正常化。给出了一个具有代表性的实验。棒材，20μm（A–D）和100 nm（G）。
为了确定受BFA影响的感染进入途径的阶段，Vero细胞在37°C SV40感染的不同时间点接受0.1μg/ml BFA的3小时脉冲处理。感染21小时后T-ag的固定和免疫标记显示，当在病毒感染早期应用BFA时，可以明显抑制SV40感染（图E） ●●●●。为了检测BFA阻断病毒进入的可能性，我们使用了一种中和性抗SV40抗体，该抗体可灭活表面病毒。将中和抗体添加到与病毒在4°C孵育的细胞中，无需加热步骤以允许内化，从而导致感染完全阻断（我们未公布的数据）。在存在或不存在0.5μg/ml BFA的情况下培养的Vero细胞在37°C下与SV40加或减BFA在冰上孵育1小时，然后在37°C下孵育2小时，以便发生感染。然后将细胞在SV40中和抗体中培养30分钟，并清洗以去除BFA。在37°C下再感染46小时后，对T-ag进行固定和免疫荧光标记。SV40感染效率的定量显示，与未经处理的细胞相比，经BFA处理的细胞中SV40感染对中和抗体的敏感性大大提高，表明BFA在细胞表面捕获病毒（图F） ●●●●。因此，很明显，BFA对SV40感染的第一个作用是抑制最初的病毒进入。与此一致的是，用0.3μg/ml BFA处理并与病毒孵育21小时后，SV40仅在细胞外围出现免疫标记，与未经处理的对照组中观察到的模式不同（图、C和D）。小窝蛋白-1和SV40的双重免疫标记显示没有明显的共定位（我们的未发表数据）。在瞬时转染小窝蛋白-1-YFP的细胞中也获得了类似的结果，但没有与小窝蛋白1-YFP标记的外周SV40共定位（我们的未发表数据）。这些细胞的Epon切片显示，在早期未经处理的细胞中，病毒颗粒在紧密包裹的表面连接的内陷中无法区分。根据免疫荧光数据，在细胞内观察到少量病毒颗粒（图G） ●●●●。
为了研究BFA是否也抑制表面后贩运步骤，在没有BFA的情况下，将Vero细胞与SV40在37°C孵育2小时，以允许病毒感染超过初始内化步骤。然后用中和抗体灭活残留在细胞表面的任何病毒，并在存在或不存在0.5μg/ml BFA的情况下培养细胞，持续感染剩余的20小时。定量显示，与未经处理的对照组相比，BFA处理的细胞感染受到强烈抑制，显示SV40感染的内部步骤受到抑制（图H） ●●●●。
我们得出结论，SV40条目的初始进入步骤对BFA敏感。此外，SV40感染涉及第二个入口后BFA敏感步骤，可能涉及内体和/或高尔基复合体。
20°C时禁止SV40进入
虽然BFA以抑制内质网和高尔基复合体之间的转运而闻名，但它也被证明能抑制早期内体到高尔基复体的转运（例如，内吞志贺毒素；Mallard公司等。, 1998). 为了确定SV40是否内化到早期内体中，我们利用了20°C时早期内体出口被阻断的观察结果(格里菲斯等。, 1988). 将SV40在20°C下感染Vero细胞4小时。病毒的固定和免疫标记显示病毒的染色明显丢失（我们未公布的数据）。为了证实病毒在20°C下内化的明显失败，我们再次使用SV40中和抗体测定。将Vero细胞在20℃或37℃下感染病毒4 h。随后将细胞暴露于中和抗体30 min，然后在37℃下再培养24 h，然后进行T-ag固定和免疫标记。感染效率的定量显示，在20°C下感染4小时后，病毒对中和抗体的敏感性比在37°C下的感染更高（图). 我们得出结论，SV40最初进入对BFA和20°C孵育都敏感。
SV40内化在20°C时被抑制。在用SV40中和抗血清中和表面暴露的病毒之前，用SV40在20或37°C下感染Vero细胞4小时。随后在37°C下孵育24小时后，固定细胞并对其进行T-ag免疫标记。定量感染效率显示，20°C下感染后病毒对中和抗体的敏感性比37°C感染后大得多。感染效率标准化为未接触中和抗血清的对照组。给出了一个具有代表性的实验。
BFA和20°C孵育抑制了CT从早期内切体的退出
接下来，我们研究了这些治疗对特征鲜明的逆行运输途径的影响。CT通过高尔基复合体高效输送至ER（见引言）。我们使用了FITC-标记的CT-B（CT-B-FITC），它被运输到高尔基体，或免疫标记的全毒素，它被运送到内质网(Lencer，2001年). 在20°C条件下，允许结合并内化FITC-标记的毒素B亚单位的Vero细胞未显示出对早期内体中毒素积累的抑制作用（图，A–C）。同样，用0.5μg/ml BFA预处理1小时的Vero细胞也将毒素内化为早期内体（图，D–F）。在暴露于BFA 21小时的细胞中，与SV40感染实验中使用的细胞相比，仍然可以观察到CT的内化，尽管检测到更大的质膜荧光强度，可能表明摄取减少（我们的未发表数据）。
在20°C和BFA条件下，CT-B的早期内体到高尔基体的转运受到抑制。将Vero细胞在0.5μg/ml CT-B-FITC中于20°C孵育1小时，导致毒素在EEA1阳性早期内体（箭头）中积聚，并且毒素无法到达高尔基复合体（a–C）。同样，在继续存在BFA的情况下，用0.5μg/ml BFA预处理2小时，然后将CT-B-FITC内化，导致毒素传递到EEA1阳性早期内体（箭头），即使在37°C（D–F）下1小时后也不会到达高尔基复合体。在BFA处理的细胞中，通过与共内化转铁蛋白-Texas Red（G和I）共定位，在一个被确定为再循环内体的小管室中也观察到了CT-B-FITC。棒材，10μm。
虽然BFA和20°C孵育对CT-B的内化几乎没有影响，但这两种处理都完全抑制了随后向高尔基体的转运。即使在20或37°C的温度下与BFA孵育1小时后，毒素仍未能到达高尔基体（图，A–F）。暴露于BFA的细胞内（图，D–I）通过共国际化的德克萨斯红标记转铁蛋白与CT-B-FITC的共定位，确定在分选内体和管状再循环内体中积累的毒素（图，G–I）。我们得出结论，SV40入口对BFA和20°C孵育的敏感性与其他已知的内吞途径（包括假定的小窝标记物CT）形成对比(Lencer公司等。, 1993;南比亚尔等。, 1993)并建议SV40使用一种新的进入途径。
微量注射βCOP抗体及Arf1和Sar1突变体表达抑制SV40感染
表面后SV40贩运步骤对BFA治疗的敏感性增加了高尔基复合体参与病毒进入途径的可能性。微量注射βCOP抗体已令人信服地证明了对高尔基复合体和内质网之间逆行交通的抑制作用，βCOP是COPI包被囊泡的包被体复合体的一种成分。微量注射抗βCOP（EAGE）(佩珀科克等。, 1993)被发现抑制COPI介导的KDEL受体和ERGIC-53的逆行转运，这两种分子在ER和高尔基复合体之间构成循环(吉罗德等。, 1999). 抗βCOP注射也抑制了内吞CT-A亚单位的逆行交通(马约尔等。, 1998;吉罗德等。, 1999). 用抗βCOP抗体微量注射Vero细胞。3到4小时后，细胞被SV40感染21小时，然后固定并免疫标记微量注射的抗体和T-ag。微量注射抗体显示细胞溶质标记和强烈的高尔基染色（图A） ●●●●。感染效率的量化显示，与周围未注射细胞相比，微注射细胞中的病毒感染受到强烈抑制（图B） 表明抗βCOP抗体是SV40感染的有效抑制剂。
通过微量注射βCOP抗体抑制SV40感染。Vero细胞被微量注射βCOP抗体、抗EAGE，并受到SV40感染。病毒核抗原T-ag（红色）和微量注射抗体（绿色）的固定和双重免疫标记可分别检测感染细胞和注射细胞（A）。细胞计数显示βCOP抗体（B）显著抑制SV40感染。给出了三个独立实验的平均值和SEM。棒材，20μm。
作为抑制COPI介导转运的第二种独立方法，我们使用GTPase缺陷Arf1突变体（Q71L）的过度表达。该突变体此前已被证明在早期分泌途径中抑制COPI依赖性转运(Dascher和Balch，1994年)并在体外抑制货物分子在COPI涂层囊泡中的分选和浓缩(拉努瓦等。, 1999). Vero细胞微注射Arf1（Q71L）和GFP表达质粒的混合物或单独注射GFP质粒（作为对照）。5小时后，用SV40孵育细胞以表达蛋白质。用两种质粒注射GFP表达细胞，通过免疫标记细胞βCOP来验证Arf1（Q71L）的表达。在注射了两种质粒的细胞中观察到高尔基βCOP标记模式的明显破坏或完全消失，而在仅注射了GFP构建物的细胞中没有观察到GFP高水平表达（图，A–D）。感染效率的量化显示，与相邻的非表达细胞相比，Arf1（Q71L）表达细胞对SV40感染有较强的抑制作用。在单独表达GFP的细胞中没有观察到这种抑制作用（图E） ●●●●。
Arf1（Q71L）和Sar1（H79G）对SV40感染的抑制作用。将Arf1（Q71L）和GFP表达质粒（a）的混合物或GFP质粒（C）注入Vero细胞，并孵育5小时，以使蛋白质表达发生。βCOP（B和D）免疫标记显示，在表达GFP和Arf1（Q71L）（A和B）的细胞中，高尔基βCOP标记模式明显中断或完全缺失，但在仅表达GFP（C和D）的细胞内没有。对这些细胞进行SV40感染和感染效率的定量显示，与单独表达GFP的细胞相比，Arf1（Q71L）转染的细胞具有有效的抑制作用（E）。在类似的实验中，GTPase缺陷的Sar1突变体也能显著抑制SV40感染（F）。图表显示了三个独立实验的平均值和SEM。转染细胞的感染效率已与周围未转染细胞正常化。棒材，40μm。
除了对COPI介导的高尔基体和内质网之间的逆行转运的影响外，显性阴性Arf1突变体和微量注射的βCOP抗体也可能影响内吞早期的事件，因为Arf1和COP蛋白与内吞运输有关(安妮托等。, 1996;达罗等。, 1997;顾等。, 1997;Gu和Gruenberg，2000年;Jackson和Casanova，2000年). 为了确定ER/Glgi转运的中断是否有助于抑制病毒感染，我们通过表达Sar1、Sar1（H79G）的GTP-限制性突变体，检测了ER/Golgi转运选择性抑制剂对SV40感染的影响(阿里多等。, 1995). 我们观察到，与GFP和Sar1表达质粒（H79G）共注射的细胞对SV40感染有显著抑制作用（图F） ●●●●。使用对温度敏感的水泡性口腔炎病毒糖蛋白（ts-045-G）证实，Sar1（H79G）和Arf1（Q71L）在该系统中有效抑制顺行转运（图). 这些结果表明Arf1、Sar1和COP依赖性贩运步骤在SV40感染中起着直接或间接的作用。
ts-045-G的外周血转运被Sar1（H79G）和Arf1（Q71L）抑制。将GFP标记的ts-045-G表达质粒单独（A）或与ts-045-G和Sar1（H79G）（B）或Arf1（Q71L）（C）表达质粒的混合物注入Vero细胞。随后在限制温度（39.5°C）下培养3小时，允许突变蛋白的表达和ts-045-G在ER中的积累（我们的未发表数据）。在允许温度（31°C）下再培养3小时，可将ts-045-G输送至仅表达该突变的细胞的质膜（A）。然而，在表达Sar1（H79G）（B）或Arf1（Q71L）（C）的细胞中，ts-045-G仍滞留在内质网和核周聚集物中，从未到达质膜。棒材，20μm。
Arf1（Q71L）和Sar1（H79G）抑制CT向高尔基体的转运
为了进一步比较CT和SV40的转运途径，我们检测了上述抑制剂对CT-B转运到高尔基复合体或CT全毒素转运到内质网的影响。微注射编码Arf1（Q71L）和Sar1（H79G）质粒的细胞孵育5小时，然后让其结合并内化CT-B-FITC 40分钟。观察到毒素到达高尔基体时受到明显抑制。然而，毒素被内化到早期内体中，尽管细胞表面信号强度的明显增加表明进入受到轻微抑制（图). 微量注射抗βCOP抗体（EAGE）可引起类似的CT内化抑制（我们的未公开数据）。
Arf1（Q71L）和Sar1（H79G）抑制CT向高尔基复合体的转运。将GFP与Arf1（Q71L）（a-D）或Sar1（H79G）（E-H）表达质粒的混合物注入Vero细胞。蛋白表达5小时后，让细胞结合CT-B-FITC或未标记的全毒素，并在37°C下内化40分钟。注射细胞（通过A、C、E和G中显示的GFP表达进行鉴定）显示毒素内化到早期内体，但不内化到高尔基体（B、D、F和H中的轮廓细胞）。注射细胞的细胞表面也经常出现明显的毒素积聚，这可能反映了初始内化的轻微减少。棒材，20μm。
然后我们检查了CT全毒素向内质网的转运。未经处理的细胞显示，根据免疫荧光判断，CT在2小时内到达内质网（图). 将上述构建物注入Vero细胞，并通过与放线菌酮孵育4 h来阻止蛋白质表达。然后让细胞在20°C的温度下在没有放线菌胺的情况下结合并内化CT全毒素1 h。随后在37°C下再孵育2小时后，细胞被固定并进行CT免疫标记。该方案允许在不存在突变蛋白的情况下，CT在20°C下初步内化为内体，但随后在37°C下，在存在新合成的突变蛋白的情况下，转运至高尔基体和内质网。如图所示突变蛋白导致了对内质网转运的抑制，毒素积聚在早期内体（通过与EEA1共定位鉴定；我们的未发表数据）或核周假定高尔基体元件中。
Arf1（Q71L）和Sar1（H79G）抑制CT向ER的传输。将GFP与Arf1（Q71L）（a和B）或Sar1（H79G）（C–F）表达质粒的混合物注入Vero细胞，并在10μg/ml环己酰亚胺中培养4 h。然后，允许细胞在20°C下在没有环己酰氨的情况下结合并内化CT全毒素1 h，随后在37°C下再培养2 h。虽然毒素（B、D和F）在未注射的细胞（如A、C和E所示）中明显到达内质网，但表达Arf1或Sar1突变体的细胞（由A、C、E所示的GFP表达确定）在内质网中表现出明显的毒素缺乏，毒素在内体中积聚，有时在注射细胞中观察到高尔基体。棒材，10μm。
Arf1（Q71L）抑制CT从内体向高尔基体的转运，这与之前所述的BFA的作用完全一致，可以用Arf1/COPI介导的内体与高尔基复合体之间的转运步骤来解释。然而，Sar1（H79G）的类似抑制作用只能归因于高尔基体的破坏或这种内吞途径依赖于功能性外吞途径。
Cbz-gly-phe-NH2对SV40感染的抑制作用
为了进一步比较SV40感染性贩运与CT向内质网和胞浆的贩运，我们研究了最近描述的CT毒性抑制剂的作用。二肽苄氧羰基Cbz-gly-phe-NH2在毒素作用的晚期引起有效阻断，并且对最初的毒素进入步骤没有影响(De Wolf，2000年). 因此，该代理提供了一个重要的工具，用于比较SV40贩运的后期阶段与CT贩运的晚期阶段。
用2 mM Cbz-gly-phe-NH2或非活性模拟物Cbz-gly-gly-NH2预培养Vero细胞1 h。然后将细胞与SV40在相同药物的持续存在下孵育21小时。T-ag表达效率的定量显示了Cbz-gly-phe-NH2对感染的有效抑制（图A） ●●●●。相反，非活性类似物Cbz-gly-gly-NH2在相同浓度下没有影响（图A） ●●●●。在表面暴露的SV40失活（使用中和抗体）和同时暴露于抑制性二肽之前，允许病毒内化4小时的细胞中的感染同样受到抑制。这证实了病毒进入后的抑制作用（图D） ●●●●。
Cbz-gly-phe-NH2抑制SV40感染，但不抑制SFV感染。（A） Vero细胞用2 mM Cbz-gly-phe-NH2或其非活性类似物Cbz-gly-gly-NH2预处理1 h，或未经处理。在持续存在或不存在二肽的情况下，随后感染SV40，然后进行T-ag固定和免疫标记。感染效率定量显示Cbz-gly-phe-NH2持续抑制SV40感染，但不抑制其非活性类似物。给出了三个独立实验的平均值和SEM。（B） 用2mM Cbz-gly-phe-NH2预处理1小时或不处理的Vero细胞在药物持续存在或不存在的情况下受到SFV感染。感染效率的定量显示，处理细胞中没有抑制SFV感染。给出了三个独立实验的平均值和SEM。（C） 在继续使用该药物的情况下，在SV40感染21小时之前，用2 mM Cbz-gly-phe-NH2预处理Vero细胞1小时。然后清洗细胞，并在没有药物的情况下培养不同时间。虽然在洗脱药物后的前3小时内感染效率仍然较低，但在6小时后开始出现T-ag表达的恢复，并且在没有药物的情况下9小时后完全恢复。感染效率与未经治疗的对照组相比正常化。展示了一个具有代表性的实验。（D） 在SV40中和抗血清灭活表面暴露病毒之前，用SV40感染Vero细胞4小时。然后将细胞在含有2mM Cbz-gly-phe-NH2或其无活性类似物的培养基中再孵育20小时的感染。T-ag表达的定量显示二肽抑制剂能有效抑制感染。给出了三个独立实验的平均值和SEM。
为了评估该药物是否对SV40或CT等逆行贩运途径具有特异性，我们检测了其对包膜病毒SFV感染的影响。这种病毒通过氯氰菊酯介导的内吞作用进入细胞，需要输送到酸性内体，以转移到胞浆并产生感染(沼泽等。, 1984). 当Vero细胞在药物存在下暴露于重组SFV时，未观察到对SFV编码蛋白caveolin-3[SFV（cav-3）]的感染和表达的抑制作用（图B） ●●●●。
如对CT毒性的抑制作用所示，Cbz-gly-phe-NH2对SV40感染的作用被发现是快速可逆的。与未经处理的对照组相比，在洗脱药物和感染SV40之前预处理1小时的细胞没有显示出感染抑制作用（我们未公布的数据）。这表明1h预处理没有持久效果。此外，正如CT内化所观察到的那样，SV40感染的阻滞似乎位于感染途径的后期。在药物存在的情况下进行21小时SV40感染，然后在没有药物的情况下进行不同时间的孵育，然后进行T-ag的固定和免疫标记。在洗去药物后的前3小时，处理过的细胞的感染百分比保持非常低，但在6小时后开始恢复，并在9小时后达到对照水平（图C） ●●●●。如果病毒被添加到细胞外，这段时间比感染所需的时间短，并且表明病毒在感染进入途径的后期积累。与此一致，塑料切片的电子显微镜显示，在抑制剂处理细胞和对照处理细胞中到达内质网池的病毒颗粒数量没有明显差异（我们的未公开数据）。
最后，我们检查了Cbz-gly-phe-NH2处理细胞中的CT贩运。在抑制剂处理的细胞中未检测到CT-B-FITC到达高尔基体的抑制，这表明只有毒性进入途径中的晚期事件受到影响（图).
Cbz-gly-phe-NH2对高尔基体后CT毒性的抑制作用。Vero细胞在2 mM Cbz-gly-phe-NH2（A和B）或其非活性类似物（C和D）中预先孵育，然后在药物持续存在下结合和内化CT-B-FITC（A和C）40分钟。然后固定细胞并免疫标记高尔基基质蛋白GM130（B和D）。在抑制剂处理的细胞中，高尔基复合体对CT-B的摄取没有明显差异。棒材10μm。
总之，我们已经确定了一种有效的新型SV40感染可逆抑制剂，该抑制剂在感染进入过程的后期发挥作用。这使得Cbz-gly-phe-NH2成为详细描述这些贩运途径的宝贵工具。
讨论
目前的研究为一种简单的非包膜病毒SV40从细胞表面到其复制位点细胞核的途径提供了新的见解。该途径涉及从细胞表面小窝到粗面内质网的一个亚结构域的运输。我们已经从形态学上检查了该途径，然后继续使用特定抑制剂来破坏感染进入途径。我们现在表明，病毒进入的初始步骤显示出独特的特征，被BFA和20°C下的细胞培养所阻断。我们还表明，该病毒通过依赖Arf1/COPI和Sar1功能的途径到达ER。最后，我们确定了一种新的病毒感染抑制剂，即已知可阻断CT毒性的二肽Cbz-gly-phe-NH2。这些研究为这一新型病毒进入途径的分子机制提供了基础性的新见解。
SV40入口的分子表征
SV40感染通过病毒与细胞表面MHC I类分子的结合进行(布鲁等。, 1992)然后和卡维奥莱交往(安德森等。, 1996;斯坦格等。, 1997;Chen和Norkin，1999年;诺金，1999;Parton和Lindsay，1999年;Pelkmans公司等。, 2001). 病毒随后被内化，但目前尚不清楚病毒是促进内化还是遵循小窝的组成内化，这仍然是一个有争议的问题。我们现在表明，内化步骤被BFA和20°C培养所阻断。这表明一种不同于其他特征明确的内化途径的途径，尤其是CT的组成性入口，CT是一种假定的小泡标志物。虽然BFA的细胞内效应具有很好的特征，但尚未令人信服地证明BFA敏感Arf蛋白在质膜内吞途径中的作用。CT、转铁蛋白和蓖麻毒素的内吞作用均显示为BFA非依赖性(Lencer公司等。, 1993;南比亚尔等。, 1993;Schonhorn和Wessling-Resnick，1994年;乌林·汉森和柳城，1995年). 同样，在20°C下孵育不会抑制CT的进入，并且通常用于在早期内体中积累配体，这是由于该区室的运输受阻，而不是在最初的内化中(Lencer公司等。, 1992;Mallard公司等。, 1998;蓬诺宁等。, 1998;任等。, 1998). 有趣的是，最近一项对各种糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定蛋白所使用的转运途径的研究描述了一种新的内吞途径，其在20°C下的孵育敏感性与SV40进入相似(尼科尔斯等。, 2001). 这种途径可以将筏相关蛋白GPI-锚定GFP和内源性GPI-锚固蛋白CD59从质膜传递到非经典的内胚小室，最后传递到高尔基复合体(尼科尔斯等。, 2001). SV40感染途径的另一项最新形态学研究(Pelkmans公司等。, 2001)证明病毒内化至作者称之为“小窝体”的类似非经典内体室。小窝体和GPI-锚定的含蛋白内体室常见的是缺乏经典的早期内体标记物，如EEA1和内化转铁蛋白。此外，Pelkmans公司等。(2001)能够证明小窝小泡体的管腔pH值是中性的，并且也显示小窝蛋白-1是该小窝的标记。在20°C下抑制SV40进入和GPI-锚定蛋白内吞的可能性反映了关键分子通过分泌途径运输的质膜传递受阻的间接影响，而不是对内化的直接影响仍然存在。然而，这些途径显示出与已知内吞途径的关键差异，未来的研究将旨在剖析新的内化机制。
Arf1、βCOP和Sar1参与SV40贩运
本研究最引人注目的发现是，SV40通过依赖Arf1/COPI功能和Sar1功能的BFA敏感通路从细胞表面传递到其复制位点。在平行实验中，我们发现霍乱毒素的细胞内运输对BFA、Arf1/COPI功能的破坏以及Sar1功能的破坏也很敏感。先前已经描述过通过微量注射抗βCOP（EAGE）阻断毒素从高尔基体到内质网的转运(马约尔等。, 1998). 然而，我们在此证明了BFA、βCOP抗体、Arf1（Q71L）和Sar1（H79G）对毒素的早期内体到高尔基体转运的抑制作用。之前已经描述过BFA对志贺毒素（一种相关毒素）从早期内体运输到高尔基体的类似抑制作用(Mallard公司等。, 1998)但Sar1参与这种途径的发现是前所未有的，并为抑制的可能机制提供了新的线索。一种解释是，Arf1和COPI外壳组装在早期内体上，介导毒素向反式-高尔基网络（因为众所周知，Arf1介导COP蛋白在早期内胚体膜和高尔基膜上的组装；安尼托等。, 1996;达罗等。, 1997;顾等。, 1997;Gu和Gruenberg，2000年;杰克逊和卡萨诺瓦，2000年). 然而，这并不能解释Sar1（H79G）介导的对同一步骤的抑制，因为已知Sar1 GTPase仅在ER-Glgi交通中起作用(阿里多等。, 1995). 或者，因为从ER到高尔基的顺行运输都需要Arf1/COPI功能和Sar1功能(阿里多等。, 1995;罗伊等。, 1996;Pepperkok公司等。, 1998)，早期内体到高尔基体的运输可能间接依赖于功能性外排途径传递的关键调节分子。内吞途径对功能性外排途径的这种依赖性也可以解释在20°C时CT在早期内体中的积聚，以及在20°C时BFA和20°C对SV40在质膜上的抑制，因为外排细胞从细胞内流到细胞外反式-高尔基网络在20°C时被抑制(Pepperkok公司等。, 1993). 这是否反映了细胞表面新合成的小窝蛋白-1对病毒内化的需要尚待确定。
值得注意的是，在病毒最初进入后，还发现BFA抑制了细胞内步骤。传染途径中受影响的贩运步骤仍未解决；由于所使用的抑制剂使细胞内隔室的形态发生了巨大变化，塑料切片的电子显微镜分析已被证明是困难的（我们的未公开数据）。也有可能BFA、βCOP抗体、Arf1（Q71L）和Sar1（H79G）都在抑制病毒从高尔基体向内质网的逆行运输。然而，这与Pelkmans公司等. (2001)这项研究表明，德克萨斯州红标SV40在感染期间的任何时候都没有与高尔基体标记物共定位。相反，活荧光显微镜显示，病毒与GFP标记的小窝蛋白-1共内化到小窝小窝小泡体室，病毒从小窝蛋白1中分离出来，并沿着微管轨道运输到通过与ER标记共定位确定为ER的核周小室。我们的研究提供了更多的工具，用于未来表征这一尚不清楚的感染途径和所涉及的分子机制。
Cbz-gly-phe-NH2对SV40感染的抑制作用
为了进一步比较SV40和CT进入途径的特性，我们使用了二肽苄氧羰基Cbz-gly-phe-NH2，最近证明它可以抑制CT毒性的晚期(De Wolf，2000年). 我们现在证明，这种药物，但不是一种非活性相关二肽，是一种有效且可逆的SV40感染抑制剂。抑制SV40感染的初步特征表明，该药物正在影响病毒感染的晚期。同样，我们发现该药物对CT-B-FITC向高尔基室的摄取和传递的早期步骤没有明显抑制作用，这证实了De Wolf的观察结果。SFV通过氯氰菊酯包被的凹坑进入细胞，并在转位到胞浆之前进入酸性内体隔室，其感染完全不受药物影响，强调了抑制SV40和CT通路的特异性。此外，感染后膜蛋白SFV（cav-3）的产生表明，在这些实验中没有发生抑制蛋白翻译的现象，尽管其他人已经描述过这种药物的作用(斯特劳斯等。, 1988;布罗斯特罗姆等。, 1991;普罗斯特科等。, 1992). 类似地，SV40启动子下细胞溶质蛋白GFP的表达在治疗和未治疗的细胞中同样有效（我们的未发表数据）。因此，SV40感染处理细胞后T-ag表达的抑制不能归因于蛋白质翻译的抑制。这种二肽如何影响SV40感染，是否以类似的方式阻断CT作用和SV40感染？Cbz-gly-phe-NH2是一种金属蛋白酶抑制剂，但已知该药物会导致细胞内钙储存的消耗并降低细胞内钙(布罗斯特罗姆等。, 1991). 这种对钙储存的影响被认为是其抑制内质网和高尔基复合体、高尔基复合物和质膜之间的膜转运事件的基础(斯特劳斯等。, 1988;格拉沃塔等。, 1990;库兹涅佐夫等。, 1992;艾弗萨等。, 1995)增加细胞外钙水平可以缓解这种抑制(库兹涅佐夫等。, 1992). 然而，我们发现，在细胞外钙水平升高的情况下，SV40感染的抑制作用仍然存在（我们未发表的数据）。Cbz-gly-phe-NH2对CT毒性的抑制获得了相同的结果(De Wolf，2000年). 这表明这两个过程的共同抑制机制与之前描述的药物作用不同。也有人认为Cbz-gly-phe-NH2可能影响CT向胞浆转运的通道(De Wolf，2000年). 这一假设现在可以得到验证，并可能使该药物成为一种有价值的工具，用于剖析SV40易位中神秘的后期步骤。
总之，我们已经确定了迄今为止未预料到的涉及SV40感染的依赖于COP的贩运步骤。引导SV40沿着这条新路线前进的细胞机械和分选机制现在等待解剖。本文所述的工具在进一步分析和可能利用这种新型病毒贩运途径方面应证明是强大的。
