Wnt-1诱导大鼠成纤维细胞生长、胞质β-连环蛋白和Tcf/Lef转录激活

逆转录病毒表达载体。

利用哺乳动物逆转录病毒表达载体pZNCX和pQNCX构建并表达全长小鼠重量-1，小鼠Wnt-5A型、和人类β-连环蛋白(S37A系列). cDNA在pZNCX和pQNCX中的表达由内部巨细胞病毒增强子/启动子驱动（未发表的观察结果）。Wnt-5A型cDNA由安德鲁·麦克马洪（哈佛大学）慷慨提供。突变体β-连环蛋白(S37A系列)cDNA由乔治敦大学的Steven Byers慷慨提供。所有的cDNA都经过修饰，在3′端编码血凝素（HA）表位标签。

细胞培养。

Rat-1成纤维细胞(13)和BOSC 23包装单元(34)在37°C，8%CO的条件下，在Dulbecco改良的Eagle's培养基（DMEM）中保存，补充10%胎牛血清和青霉素-链霉素₂湿度为90%。为了测量汇合处以外的生长情况，将Rat-1细胞接种在大约75%的汇合处，并在有血清存在的情况下过夜实现汇合。第二天，通过用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗细胞单层一次和用DMEM冲洗细胞单层一次来去除血清。然后在DMEM中培养细胞。在去除血清后的几个时间点，通过胰蛋白酶分解细胞，并在台盼蓝染色后计数活细胞。为了观察细胞在灌注后的生长，用冷甲醇-丙酮（1:1）固定细胞单层，用Giemsa核染色，并拍照。为了测量血清非依赖性细胞增殖，将Rat-1细胞接种在含有血清的约15%汇合处。第二天，取下血清，并在取下血清后的几个时间点获得活细胞数，如上所述。

腺病毒感染。

将Rat-1成纤维细胞接种在80%的汇合处，然后模拟感染或感染各种感染多重性（MOI）的重组腺病毒。感染前，用DMEM冲洗细胞。感染是用含病毒接种物在DMEM中进行的，DMEM是将2%胎牛血清添加到细胞中，在37°C下接种1小时。然后将细胞保存在含有2%胎牛血清的DMEM中。

瞬时转染和逆转录病毒感染。

通过磷酸钙转染逆转录病毒构建物到BOSC包装细胞中生成重组逆转录病毒(34). 一天后，用丝裂霉素C（10μg/ml；Sigma）处理BOSC细胞4 h。处理后24 h，将转染的BOSC细胞胰蛋白酶化，并接种目标Rat-1成纤维细胞进行共培养。48小时后，用每毫升含有500μg Geneticin（G418；Gibco）的培养基培养细胞。将耐药菌落合并为多克隆、稳定的细胞系，保存在每毫升含有250μg Genenticin的培养基中。

蛋白质印迹分析。

通过细胞裂解物的Western blot分析评估Wnt-1、Wnt-5A和β-catenin（S37A）蛋白的表达。简单地说，用冷PBS清洗细胞两次，造粒，并在裂解缓冲液（50 mM Tris[pH8]，150 mM NaCl，1%Triton X-100，每毫升10μg抑肽酶，0.5 mM苯甲基磺酰基氟化物，每毫升2μg亮氨酸蛋白酶，每毫升两μg胃蛋白酶抑制素）中再次悬浮在冰上30分钟。然后以10000 rpm（8000×克)在4°C下保持10分钟。用Bio-Rad蛋白质测定染料测定蛋白质浓度。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）（10%聚丙烯酰胺）分离细胞蛋白（50μg）并转移到硝化纤维过滤器上。

用含有1%牛血清白蛋白（BSA）（组分V）的TBST（10 mM Tris[pH8]，150 mM NaCl，0.2%吐温20）封闭过滤器，并用抗HA单克隆抗体12CA5（Berkeley antibody Co.）在室温下以1:50的稀释度在TBST–1%BSA中孵育2小时，进行免疫印迹以检测蛋白质表达。在室温下用TBST清洗斑点25分钟，在室温下以1:5000的稀释度暴露于二级抗体（辣根过氧化物酶结合羊抗鼠免疫球蛋白G[Amersham]）45分钟，并在室温下使用TBST清洗。用增强化学发光检测试剂（Amersham）和X射线胶片曝光观察蛋白质表达。

细胞分离和β-连环蛋白分析。

如前所述，通过分离细胞裂解物制备的细胞溶质和膜池中的β-连环蛋白水平进行评估(第14页,44). 简单地说，用冷PBS洗涤细胞两次，并将其收集在生理缓冲液（PB）中（10 mM Tris[pH 7.4]，140 mM NaCl，5 mM EDTA，2 mM二硫苏糖醇，1 mM苯甲基磺酰氟，1μg/ml抑肽酶，2μg/ml亮肽，2μg/ml胃蛋白酶抑制素）（500μl/100-mM融合皿）。细胞在PB中通过Dounce均质器进行30次均质，用微型离心机以3000 rpm（500×克)温度为4°C。以30000 rpm（100000×克)在4°C下保持90分钟。上清液被指定为胞质级分，将颗粒重悬于含有0.1%十二烷基硫酸钠的PB中（每100 mm汇合培养皿150μl），并指定为膜级分。用Bio-Rad蛋白质测定染料测定各个组分中的蛋白质浓度。β-连环蛋白通过在SDS–10%聚丙烯酰胺凝胶上分离30μg细胞溶质蛋白或15μg膜蛋白进行分析，并通过Western blot分析使用抗β-连环素单克隆抗体（Transduction Laboratories）在室温下在TBST–1%BSA中1:5000稀释2 h进行分析。用增强化学发光检测试剂（Amersham）和X射线胶片曝光观察蛋白质表达。

Wnt-1影响后诱导细胞生长。

在Rat-1成纤维细胞中观察到的生长特性之一是，它们需要接触抑制和血清耗竭才能生长停滞。为了检测Wnt-1是否能够克服Rat-1细胞中的这些生长抑制信号，我们分析了Wnt-1诱导流畅后生长的能力。在无血清条件下分析生长后通量，并通过活细胞计数进行测量。在没有血清的情况下，Rat-1/Wnt-1细胞在感染后继续增殖，而对照Rat-1/Wnt-5A细胞仍然生长受阻（图。​（图2A）。2A） ●●●●。在注入后9天，Rat-1/Wnt-1细胞在无血清条件下继续增殖。与对照Rat-1/Wnt-5A细胞相比，相对细胞数量增加了三倍，这反映了对Wnt-1表达的反应（图。​（图2A）。2A） ●●●●。

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图2

Wnt-1诱导静止的Rat-1成纤维细胞增殖。Rat-1/Wnt-1（∗）和对照Rat-1/Wnt-5A（б）细胞培养至融合，去除血清，并监测融合后的生长。（A） 在灌注后数天，用胰蛋白酶消化活细胞，并用台盼蓝排除法进行计数。相对细胞数百分比计算为取血清后1天记录的相对细胞数的百分比。对一式三份样品进行计数并取平均值。（B） 灌注6天后，固定细胞单层，用Giemsa核染色并拍照。钢筋，4.75 mm。

增殖的Rat-1/Wnt-1细胞紧密堆积在一起，形成单层细胞密集簇。在对细胞单层进行Giemsa染色后，这些簇是明显的（图。​（图2B）。2B） ●●●●。在类似条件下，Rat-1/Wnt-5A在汇合处保持生长停滞，如细胞单层的均匀Giemsa染色所示（图。​（图22B） ●●●●。

Wnt-1诱导血清非依赖性细胞增殖。

为了测试Wnt-1是否足以代替促有丝分裂血清成分支持细胞生长，我们分析了无血清条件下Rat-1稳定细胞系的生长。野生型Rat-1、Rat-1/Wnt-5A或Rat-1/Wnt-1成纤维细胞稀疏接种于无血清培养基中（<15%融合），并通过计数血清去除后多天的活细胞来测量细胞增殖。野生型Rat-1细胞仍然存活，生长非常缓慢，在无血清培养17天后生长逐渐减弱（图。​（图3A）。三A） ●●●●。Wnt-1的过度表达显著增加了无血清培养基中Rat-1成纤维细胞的生长（图。​（图3A）。三A） ●●●●。与对照细胞相比，Rat-1/Wnt-1细胞的细胞数量增加了2.5倍。对照组Wnt-5A表达细胞在培养3周后未达到融合（图。​（图3B）三B） 而Rat-1/Wnt-1细胞在培养1周后达到融合，并在融合后继续增殖（图。​（图3B）。三B） ●●●●。培养24天后，Rat-1/Wnt-1细胞的细胞总数增加了9倍。

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图3

Wnt-1诱导Rat-1成纤维细胞的血清非依赖性生长。野生型Rat-1（□）、Rat-1/Wnt-1（∗）和对照Rat-1/Wnt-5A（б）细胞以低密度（<15%合流）接种，去除血清，并监测其非血清依赖性生长。（A） 在取下血清后数天，对细胞进行胰蛋白酶消化，并对活细胞进行计数。相对细胞数百分比是相对于血清清除后1天记录的细胞数计算的。对三份样品进行计数和平均。（B） 在取下血清后的多天（第1、8和17天），拍摄Rat-1/Wnt-1和Rat-1/Wnt-5A细胞的照片，并监测其血清非依赖性生长。

Wnt-1诱导Rat-1成纤维细胞中β-连环蛋白的胞浆积累。

以前有报道称Wnt-1的表达导致β-catenin稳态水平的增加(20,33,44). 还假设细胞液中β-catenin的积累负责Wnt-1下游信号传导(35). 在确定Wnt-1影响Rat-1成纤维细胞的生长和形态特性后，我们研究了Wnt-1对Rat-1细胞中β-catenin蛋白水平的影响。为了研究β-连环蛋白对Wnt-1反应的变化，我们评估了Rat-1细胞裂解物的总裂解物以及细胞溶质和膜部分中的β-连环素蛋白水平。蛋白质组分的Western blot分析显示，与对照细胞相比，Wnt-1表达细胞的胞浆β-catenin水平显著增加（图。​（图4B，4B、 车道2）。野生型Rat-1和对照Rat-1/Wnt-5A细胞的胞浆β-连环蛋白水平几乎检测不到（图。​（图4B，4B、 车道1和3）。β-连环蛋白水平在总裂解物中保持不变（图。​（图4A）4A） 和膜组分（图。​（图4C，4C、 通道1至3）。Rat-1细胞系的免疫荧光分析显示出一种主要的膜信号，并且在对Wnt-1表达的反应中，β-catenin的细胞定位没有改变（数据未显示）。

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图4

Wnt-1诱导Rat-1成纤维细胞中β-连环蛋白的胞浆积累。Western blot分析野生型Rat-1（空白）、Rat-1/Wnt-1（W1）和Rat-1/Wnt-5A（W5A）细胞的普通（A）、细胞溶质（B）和膜（C）蛋白部分的稳态β-catenin蛋白水平。细胞未感染或感染Ad/Wnt-1或对照Ad/LacZ（MOI=5）。按照材料和方法中的描述，制备并分离细胞提取物。蛋白质组分用SDS-PAGE（10%聚丙烯酰胺）分离，转移到硝酸纤维素上，并用抗β-连环蛋白抗体（抗β-Cat）进行Western blot分析。

研究爪蟾表明Wnt-5A可以干扰Wnt-1信号(46). 为了研究Rat-1细胞中的这种相互作用，我们通过Ad/Wnt-1感染将Wnt-1引入Rat-1/Wnt-5A细胞，并测量细胞溶质β-catenin水平的变化。野生型Rat-1细胞和Rat-1/Wnt-5A细胞对Wnt-1表现出同等的反应性，导致Ad/Wnt-1感染2天后细胞液中β-catenin蛋白的急性诱导（图。​（图4B，4B、 车道4和6）。Ad/Wnt-1在对照组（第4车道）或Rat-1/Wnt-5A（第6车道）细胞中诱导的β-catenin水平与Rat-1/Wnt-1稳定细胞系（第2车道）中观察到的水平相当。这些结果表明，Rat-1/Wnt-5A细胞系在选择后对Wnt-1的反应性没有改变，Wnt-5A的表达不会干扰Wnt-1活性。Rat-1/Wnt-1细胞的Ad/Wnt-1感染并没有进一步增加细胞溶质β-catenin水平（第5通道）。控制性Ad/LacZ感染对三种细胞系中的任何一种β-catenin水平均无影响（图。​（图4B，4B、 车道7至9）。

为了进一步研究Wnt-5A和Wnt-1之间的潜在相互作用，我们构建了表达Wnt-5AHA、Ad/Wnt-5A的腺病毒表达结构。用Ad/Wnt-5A感染Rat-1细胞不会导致细胞出现可检测到的形态或增殖变化（数据未显示）。感染后2天细胞裂解物的Western blot分析表明，感染Ad/Wnt-5A的细胞中存在Wnt-5A蛋白（图。​（图5A，5A、 车道2至4）。在感染Ad/Wnt-1的细胞中检测到Wnt-1蛋白（第6道）。在模拟感染细胞（1区）或感染对照腺病毒Ad/LacZ的细胞（5区）中未检测到Wnt蛋白。通过增加Ad/Wnt-5A的MOI，在Rat-1细胞中检测到Wnt-5A蛋白表达的逐步适度增加。

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图5

Wnt-5A的共表达并不影响Wnt-1对Rat-1成纤维细胞胞浆β-catenin的诱导作用。（A） Ad/Wnt-5A增加MOI时Rat-1细胞中Wnt-5A蛋白的表达。显示了在MOI为5、10或20或Ad/Wnt-1（W1）（MOI=5）或Ad/LacZ（Z）（MOI=5）时感染Ad/Wnt-5A后2天或模拟感染（M）后细胞裂解物的Western blot分析。用抗HA抗体检测Wnt-1和Wnt-5A蛋白。（B） Wnt-5A的共表达并不干扰Wnt-1对Rat-1成纤维细胞胞浆β-catenin的诱导作用。显示了模拟感染（M）、感染Ad/Wnt-1（W1）、Ad/LacZ（Z）或Ad/Wnt-5A（5A）、与Ad/Wnt1（MOI=5）和Ad/Wnt-5 A（MOI=5、10或20）共感染或与Ad/Wnt-1（W2）（MOI=20）共感染后Rat-1细胞稳态胞浆β-catenin蛋白水平的Western blot分析。制备细胞提取物，进行分级，并用抗β-连环蛋白抗体（anti-β-Cat）进行蛋白质印迹分析。

为了研究Wnt-5A对Wnt-1活性的潜在调节作用，我们通过与Ad/Wnt-5A和Ad/Wnt-1共感染将Wnt-5A和Wnt-1引入Rat-1细胞，并在共感染后2天检测细胞裂解物胞浆部分的β-catenin水平。在感染Ad/Wnt-1后，Rat-1细胞的胞浆β-catenin水平显著增加（图。​（图5B，5B、 车道2；参见图。​图4B）。4B） ●●●●。感染Ad/Wnt-5A的细胞显示出几乎无法检测到的细胞溶质β-连环蛋白水平（图。​（图5B，5B、 通道4），以及模拟感染细胞和感染对照的细胞Ad/LacZ（通道1和3）。将Rat-1细胞与Ad/Wnt-1和Ad/Wnt-5A联合感染，使MOI增加5、10和20，导致Wnt-1诱导的细胞溶质β-catenin水平没有变化（第5至7道）。与Ad/Wnt-1和Ad/LacZ联合感染对Wnt-1诱导β-catenin也没有影响。这些结果表明，Wnt-5A与腺病毒载体共表达并不干扰Wnt-1对Rat-1成纤维细胞β-catenin的诱导。

Wnt-1诱导Rat-1成纤维细胞的Tcf/Lef转录激活。

目前的模型表明，细胞溶质β-连环蛋白与下游效应器相互作用，转位到细胞核，并激活靶基因。一类潜在效应物是Tcf/Lef HMG转录因子(30,35). 我们假设Wnt-1可能通过激活Tcf/Lef转录因子Wnt（重量）Rat-1成纤维细胞的信号转导途径。为了解决这个假设，我们在Tcf荧光素酶报告分析中分析了Wnt-1对Rat-1成纤维细胞Tcf/Lef转录活性的影响(22).

这些实验中使用的Tcf荧光素酶报告子结构pTOPFLASH包含三个最佳的Tcf结合元件，它们串联放置在最小c-福斯驱动荧光素酶基因表达的启动子(22). 对照Tcf报告基因pFOPFLASH在结合元件中含有关键的核苷酸替换，从而破坏Tcf结合。我们观察到，将Wnt-1表达载体和pTOPFLASH-Tcf报告子共同转染到Rat-1成纤维细胞中，转染2天后产生了较强的荧光素酶活性（图。​（图6A）。6A） ●●●●。背景荧光素酶活性在pTOPFLASH和alacZ公司-含有质粒（图。​（图6A）。6A） ●●●●。Wnt-1诱导的pTOPFLASH报告子的激活量是对照pFOPFLASH-报告子的三倍。随着Wnt-1质粒（0.5、1或5μg）数量的增加，转染并未导致pTOPFLASH报告子的激活增加（图。​（图6A）。6A） ●●●●。

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图6

Wnt-1诱导Rat-1成纤维细胞的Tcf/Lef依赖性转录。（A） Wnt-1的瞬时表达诱导Tcf/Lef依赖性转录。野生型（pTOPFLASH）或突变型（pFOPFLASH）Tcf报告子构建物（4μg）被联合转染到Rat-1成纤维细胞中，Wnt-1或lacZ公司cDNA。（B） Rat-1/Wnt-1细胞中Wnt-1的稳定表达诱导组成性Tcf/Lef转录激活。将野生型Tcf（pTOP）或突变体Tcf（p FOP）报告体构建物（4μg）转染到Rat-1/Wnt-1或Rat-1/Wnt-5A稳定细胞系。转染后2天测定荧光素酶活性。对三份样品进行计数和平均。

接下来，我们研究了在稳定的Rat-1细胞系中是否存在组成型Tcf/Lef转录活性。用pTOPFLASH或对照pFOPFLASH-报告基因转染Rat-1/Wnt-1和Rat-1/Wnt-5A细胞，2天后测定荧光素酶活性。图​图6B6B说明Rat-1/Wnt-1细胞显示出三倍于对照Rat-1/Wnt-5A细胞的组成性Tcf-依赖荧光素酶活性。当用突变的Tcf报告基因pFOPFLASH转染Rat-1/Wnt-1和Rat-1/Wnt-5A细胞时，显示出类似的背景荧光素酶活性（图。​（图6B）。6B） ●●●●。使用猴病毒40早期启动子表达荧光素酶的构成型报告子（pSV2-Luc）进行对照转染，证明转染效率在所有稳定细胞系中都是可比的（数据未显示）。

突变的β-连环蛋白（S37A）不会在胞质溶胶中积累。

据推测，β-catenin的细胞溶质积累是驱动活性β-catentin/Tcf转录复合物形成的关键事件。因此，胞浆β-catenin的积累将是Wnt-1信号传导的速率限制步骤。野生型细胞溶质β-catenin通常不稳定，在缺乏Wnt-1信号的情况下迅速降解(1). 在残基37（S37A）处发生丝氨酸到丙氨酸突变的突变β-连环蛋白被认为比野生型β-连环素更稳定，因此更活跃(42).

为了检测β-连环蛋白的活性，我们在Rat-1成纤维细胞中表达了β-连环素（S37A）。使用表达HA-epitope标记的β-catenin（S37A）的重组逆转录病毒，我们生成了多克隆Rat-1稳定细胞系Rat-1/β-CatS37A。用抗HA抗体对全细胞裂解物进行Western blot分析，显示Rat-1/β-CatS37A细胞中β-catenin（S37A）蛋白的表达。图​图7A7A（通道2）显示Rat-1/β-CatS37A细胞的全细胞裂解物中的HA标记的β-catenin（S37A）蛋白，迁移速度约为92kDa。在模拟感染细胞中未检测到外源蛋白（图。​（图7A，7A、 车道1）。同时，用抗β-连环蛋白抗体进行的Western blot分析显示，外源性β-连环素（S37A）蛋白（第4道）的迁移率略高于内源性β-连蛋白（第3道）。观察到的β-catenin（S37A）电泳迁移率的变化可能是由于HA表位标签引起的。

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图7

突变的β-连环蛋白（S37A）不会在胞浆中积聚。（A） Rat-1/β-CatS37A稳定细胞系中β-catenin（S37A）的Western blot分析。用SDS-PAGE分离细胞裂解产物（1、2道用10%聚丙烯酰胺，3、4道用7.5%聚丙烯酰胺）并转移到硝化纤维素中，用抗HA抗体（2道）或抗β-连环蛋白（4道）进行Western blot分析检测β-连环素（S37A）。通道1显示在对照细胞中未检测到外源蛋白。泳道3显示β-连环蛋白在Rat-1细胞中的内源性表达。外源性β-连环蛋白（S37A）蛋白质由第4条车道上的箭头指示。（B） Western blot分析Rat-1/Wnt-1（W1）、Rat-1/Wnt-5A（W5A）和Rat-1/β-CatS37A（S37A）稳定细胞系中的细胞溶质β-catenin蛋白水平。细胞未感染或感染Ad/Wnt-1（MOI=5）或对照组，Ad/LacZ（MOI=5）细胞溶胶蛋白组分用SDS-PAGE（10%聚丙烯酰胺）分离，转移到硝化纤维素中，并用抗β-连环蛋白抗体（抗β-Cat）进行Western blot分析。

接下来，我们分析了Rat-1/β-CatS37A细胞胞质部分中β-catenin（S37A）蛋白的水平。通过细胞分馏和用抗β-连环蛋白抗体进行的Western blot分析，我们观察到细胞溶质部分中β-连环素（S37A）蛋白很少积累（图。​（图7B，7B、 通道3）与Wnt-1表达细胞（通道1）相比。与Rat-1/Wnt-5A细胞一样，Rat-1/β-CatS37A细胞的胞浆β-catenin水平较低（第2和第3通道）。然而，这两种细胞系均对Wnt-1表现出急性反应性，表现为Ad/Wnt-1感染后2天，β-catenin蛋白在胞浆中大量积累（第5和第6通道）。Ad/LacZ控制感染对任何细胞系（第7至9道）中的β-catenin水平均无影响。Ad/Wnt-1感染后Rat-1/β-CatS37A细胞中β-catenin的细胞溶质池主要由内源性β-catening组成。异位表达的β-连环蛋白（S37A）被检测为一种较慢的迁移形式，对Wnt-1信号表现出很少或没有反应性，并且在Ad/Wnt-1感染后不会在胞质溶胶中积累（数据未显示）（见讨论）。

β-连环蛋白S37A不影响Rat-1成纤维细胞的生长。

接下来，我们对无血清条件下Rat-1/β-CatS37A细胞的生长进行了表征。稀疏播种时，Rat-1/β-CatS37A细胞增殖速度与野生型Rat-1细胞相似（图。​（图8A）8A） 在没有血清的情况下没有达到融合（图。​（图8B）。8B） ●●●●。Rat-1/β-CatS37A细胞的增殖速度明显低于Rat-1/Wnt-1细胞（对比图。​图3A三A和图。​图8A）。8A） ●●●●。Rat-1/β-CatS37A细胞保留了野生型Rat-1成纤维细胞的形态和生长特性（图。​（图8B）。8B） ●●●●。此外，如Rat-1/Wnt-1细胞所示，Rat-1/β-CatS37A细胞在无血清培养基中受影响后未能生长（数据未显示）。我们还从Rat-1/β-CatS37A细胞系中产生并分析了八个克隆系。尽管β-catenin（S37A）的表达水平存在克隆差异，但通过Western blotting测定，Rat-1/β-CatS37A的多克隆系和克隆系之间的生长和形态几乎没有明显差异（数据未显示）。

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图8

突变β-连环蛋白（S37A）的表达不会改变Rat-1细胞的形态或生长特性。Rat-1/β-CatS37A（）和野生型Rat-1（□）细胞以低密度（<15%合流）接种，去除血清，并监测其血清非依赖性生长。（A） 在取下血清后数天，对细胞进行胰蛋白酶消化，并对活细胞进行计数。相对细胞数百分比计算为取血清后1天记录的相对细胞数的百分比。样品计数为一式三份。（B） 去除血清后，在图中所示的日期拍摄野生型Rat-1和Rat-1/β-CatS37A细胞。

我们感谢尤金·马坎托尼奥（Eugene Marcantonio）、弗兰克·科斯坦蒂尼（Frank Costantini）、鲁迪·格罗斯谢尔德（Rudy Grosschedl）和马丁·朱利叶斯（Martin Julius）对手稿的讨论和批判性阅读，感谢马丁·尤利叶斯和严庆友（Qingyou Yan）构建逆转录病毒。汉斯·克利夫斯（Hans Clevers）慷慨提供了pTOPFLASH和pFOPFLASH-报告构建物，史蒂文·拜尔斯（Steven Byers）慷慨提供β-catenin（S37A）cDNA，里卡多·达拉·菲娃（Riccardo Dalla-Favera）慷慨提供Rat-1成纤维细胞。

这项工作得到了美国陆军医学研究与材料司令部（USAMRMC）根据DAMD17-94-J-4069、美国癌症学会（ACS DB-81）和玛丽莲·博克迈尔·斯佩里基金会（Marilyn Bokemeier Sperry Fund）的资助，以及美国国立卫生研究院（T32 CA09503）为C.S.Y.提供的10月前奖学金的支持。