节律环磷酰胺方案选择性消耗CD4⁺CD25型⁺调节T细胞并恢复晚期癌症患者的T和NK效应器功能

摘要

介绍

CD4细胞⁺CD25型⁺调节性T细胞（Treg），约占CD4的2%⁺人类T细胞[1]是维持免疫耐受、防止出现器官特异性自身免疫病的主要因素[2]. 在荷瘤动物中，Treg还可以抑制抗肿瘤免疫反应[三,4]. 在啮齿类动物中，Treg积聚在肿瘤床和肿瘤引流淋巴结中，导致肿瘤进展[4,5]. 我们最近报道了肿瘤细胞可以驱动未成熟树突状细胞表达TGF-β，这是Treg局部扩张所必需的[5]. 患有各种恶性肿瘤的人类患者的循环和肿瘤浸润Treg数量也增加，这些Treg对肿瘤特异性T细胞产生功能抑制[6-8]. Treg不仅抑制同源T细胞反应，还钝化免疫的固有臂，通过下调NKG2D水平抑制NK细胞增殖和效应器功能[9]. Treg抑制NK细胞和T细胞与人类恶性肿瘤预后不良有关[8,9].

20世纪80年代，有报道称低剂量环磷酰胺（CTX）可降低实验肿瘤模型中未标记T细胞的抑制功能[10]和癌症患者[11]. 最近，我们证明了低剂量CTX可以显著降低CD4⁺CD25型⁺Treg在荷瘤动物体内蓄积，恢复免疫治疗对啮齿动物肿瘤的疗效[4]. 低剂量CTX不仅会减少Treg的数量，而且会抑制Treg抑制功能[12,13]. 这种消耗和/或抑制Treg的药理学操作可能代表着肿瘤学家的医疗设备中的关键免疫干预。

最近的研究表明，对化疗产生耐药性的晚期癌症患者仍然可以通过反复注射不同的细胞毒性药物，剂量为最大耐受剂量的十分之一到三分之一，即“节律性计划[14]旨在抑制肿瘤血管生成[15]. 在这种节律安排中，环磷酰胺目前每天口服低剂量[16,17]，但未进行免疫随访。在本报告中，我们证明了这种节律疗法选择性地靶向Treg并恢复终末期肿瘤患者的免疫功能。

患者、材料和方法

经区域医学研究伦理委员会（文件号：CCPPRB-0509-A2）批准，从9名转移性实体瘤患者（6名男性，3名女性，平均年龄52岁，范围37-5岁）中抽取15 ml外周血样本，这些患者在常规化疗失败后需要节律化疗，以及15名年龄匹配的健康志愿者（HV）（9名男性，6名女性，平均年龄49岁，范围30-2岁）。患者口服CTX 50 mg，每天两次，1周内服用，1周后停用，持续1个月或更长时间。表中总结了9名患者的临床特征1.

在患者和HV中，用肝素采集15 ml外周血样本并立即使用。使用以下单克隆抗体通过全血标记研究循环T和NK细胞的表型：荧光素-异硫氰酸盐结合抗CD3、藻红蛋白结合抗CD25或CD56、异藻蓝蛋白结合抗-CD4或CD8（均来自德国海德堡Becton Dickinson PharMinen）以及相应的同种对照抗体。然后用FACS白细胞固定和红细胞裂解试剂盒（Abcam，Paris，France）处理血液样本，并通过多色流式细胞术分析白细胞。CD4的比率⁺CD25型^高的T细胞，可能是Treg，是根据Baecher-Allan定义的标准测定的[1]. 在4名癌症患者中，首先使用Ficoll/Hypaque（瑞典乌普萨拉阿默沙姆）密度离心法从开始节律治疗前和1个月后采集的血液中纯化外周血白细胞，然后使用Foxp3试剂盒对Foxp3蛋白进行细胞内染色(网址：http://www.eBioscience.com)根据制造商的说明。在耗尽Treg的实验中，PBMC与抗CD25微珠（法国巴黎Miltenyi Biotec）在5μl/1×10浓度下孵育⁶细胞在冰上放置15分钟并清洗。CD4⁺CD25型^-通过LD柱纯化该组分，并通过流式细胞术（未显示）评估，表达的Foxp3蛋白比未耗尽细胞少四倍以上。为了确定NK杀伤活性，PBMC是否耗尽CD25⁺细胞与CFSE标记的K562细胞以10:1的E:T比孵育24小时。通过FACS分析评估CFSE中碘化丙啶掺入量来监测K562细胞死亡⁺细胞。对于T细胞增殖试验，CFSE标记的PBMC（1μM）是否耗尽CD25⁺根据制造商的说明，用抗CD3和抗CD28单克隆抗体（挪威奥斯陆Dynal Biotech）培养T细胞。通过FACS分析监测增殖，评估第5天CFSE染料的稀释度。在某些情况下[^三H] 在第4天添加胸腺嘧啶核苷（1μCi/孔），并在18小时后定量其并入分裂细胞。在五个HV中，我们有机会测定了Treg细胞的百分比，以及每隔一个月采集的两个样本的NK细胞和T细胞功能。我们没有发现显著差异。这就确立了在没有治疗的情况下这些结果的稳定性（未显示数据）。误差（±）表示标准偏差。

结果

我们通过测定白细胞、淋巴细胞、CD4来监测口服节律CTX方案对9名癌症患者的影响⁺T、 CD8（CD8）⁺T、 治疗开始时和开始治疗后1个月循环血中的NK和Treg细胞亚群。有趣的是，循环CD4的数量⁺CD25型^高的对常规治疗耐药的9例晚期多转移性肿瘤患者，节律治疗前的Treg高于HV（图1a） ●●●●。此外，节律CTX治疗导致CD4显著降低⁺CD25型^高的T细胞，两者的百分比（之前为7.9±1.5%，之后为3.1±1.8%，P（P）<0.0001）和绝对数（28.7±9.4个/mm^三之前与6.4±5.4个细胞/mm^三之后，P（P）<0.0001）（图1a） ●●●●。这九名患者的Treg数量和百分比都有所下降（图1b、 c）。我们可以获得足够的材料来测定其中四名癌症患者节律治疗前后Foxp3的表达，并观察到CD25的数量显著减少⁺Foxp3系列⁺细胞和CD25^-Foxp3系列⁺治疗期间的细胞（图2). CD4下降⁺CD25型^高的节律治疗诱导的T细胞数量具有选择性，因为白细胞总数以及T淋巴细胞、CD3的数量没有显著下降⁺T细胞，CD8⁺T细胞和CD3^-CD56型⁺可以观察到NK细胞亚群（图三a、 b）。因此，在2周内每天服用100 mg CTX的1个月节律方案可以选择性地耗尽肿瘤患者的Treg亚群，并恢复HV中观察到的范围（图1a） ●●●●。在两名患者中，在停止治疗2个月后测量Treg数，发现两名患者的Treg值均恢复到治疗前水平（未显示）。

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图1

节律CTX选择性地耗尽癌症患者的调节性T细胞（Treg）。一CD3循环数⁺CD4细胞⁺CD25型^高的每毫米^三通过FACS分析确定。中位数，75%(箱)和SD(络腮胡子)为患者描绘(n个=9，表1)在（D0）和（D30）开始有节奏CTX后1个月之前和健康志愿者（HV）(n个 = 15).b条Treg进化的绝对数表示(左侧面板)和CD4百分比⁺T细胞(右侧面板)在节律CTX方案期间（D0）和（D30）开始节律CTX后1个月，对9名接受治疗的患者使用CD3上的FACS三色染色门控⁺CD4细胞⁺CD25型^高的细胞。c（c）CD4斑点分析的多面板表示⁺CD25型^高的使用CD3上的FACS三色染色门控技术，在节律CTX方案开始前（D0）和开始后1个月（D30）的所有患者中的T细胞⁺CD4细胞⁺CD25型^高的细胞

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图2

治疗期间Foxp3+细胞数量减少。CD4三色染色门控⁺开始CTX节律治疗前和1个月后4例患者的细胞及CD25和Foxp3表达分析

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图3

节律CTX治疗期间白细胞亚群的演变。一白细胞、淋巴细胞和CD3⁺患者血液中T淋巴细胞计数(n个=9，表1)开始节律CTX前和1个月后。b条血液中T和NK细胞亚群的计数。允许进行流式细胞术分析以评估CD3的百分比⁺CD4细胞⁺和CD3⁺CD8（CD8）⁺淋巴细胞和CD3^-CD56型⁺NK细胞。在开始节律CTX前和1个月后，根据9名患者的全血细胞计数计算绝对数。使用Fisher精确方法进行统计分析

同时，我们监测了节律性100毫克/天CTX方案对循环T细胞和NK细胞功能的影响。首先，我们测定了血液NK细胞杀伤NKG2D配体表达的K562的能力。虽然来自五种HV的PBMC表现出强大的NK细胞依赖性细胞毒活性，但癌症患者的PBMC在节律治疗开始前表现出降低的杀伤能力（分别为37±6%和9±1%，P（P）<0.005，图4a） ●●●●。肿瘤患者PBMC的杀伤活性可以通过CD25的缺失而部分恢复⁺电池（图4a） 正如我们之前的报告所预期的那样，Treg在体外削弱了NK细胞的功能[9]. 更重要的是，经过1个月的节律CTX治疗后，患者的NK细胞裂解活性增强，与HV相比没有显著差异（图4a） ●●●●。值得注意的是，残余CD4⁺CD25型^高的自CD25体外耗竭后，T细胞似乎失去了对NK细胞的抑制活性⁺细胞没有进一步提高细胞毒性水平（图4a） ●●●●。在这些晚期肿瘤患者中，与HV相比，TCR信号诱导的T细胞增殖在节律治疗开始前受到显著抑制（刺激5天后进入周期的细胞为17±3%，HV为45±6%）(P（P）<0.0001，图4a） ，并通过体外CD25缺失部分恢复(P（P） = 0.01). 开始CTX治疗一个月后，TCR信号诱导的血T细胞增殖显著恢复（图4b） 随着CD25的体外耗竭，残留的Treg失去了抑制功能⁺细胞并没有进一步改善TCR诱导的T细胞增殖（图4b） ●●●●。

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图4

癌症患者接受节律CTX治疗后，T和NK细胞功能增强。一K562被杀。左侧面板1 × 10⁵PBMC是否从CD25中耗尽⁺细胞与1×10混合⁴CFSE标记K562细胞24小时。K562细胞死亡通过流式细胞术评估为加入碘化丙啶的CFSE标记细胞的百分比。图描述死区百分比的平均值±标准偏差n个=6名患者（表1)治疗前（D0）和治疗后（D30）以及n个=5名健康志愿者。这个右侧面板显示CD25耗尽前后D0和D30代表性患者的详细斑点分析⁺细胞。b条TCR信号诱导T细胞增殖。左侧面板1 × 10⁵CFSE标记的PBMC是否从CD25中耗尽⁺将细胞与涂有抗CD3和抗CD28单克隆抗体的微球混合72小时。通过流式细胞术测定T细胞的增殖，作为CD3的百分比⁺稀释CFSE染料的细胞。这个图表描述了百分比的平均值±标准偏差n个=6名D0和D30的患者n个=5名健康志愿者。这个右侧面板显示CD25耗尽前后D0和D30代表性患者的详细CFSE标记分析⁺细胞。统计分析采用Fisher精确方法(a、， b条)

节律治疗对Treg细胞群的选择性作用明显依赖于低剂量CTX。事实上，在另一系列六名癌症患者中，他们接受了类似的节拍疗法，但使用了两倍高剂量的CTX（即每天200mg而不是100mg），所有淋巴细胞亚群都被治疗耗尽，对Treg没有特异性（图5a、 b）。这一结果表明，只有低剂量的CTX与获得选择性Treg耗竭相关。

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图5

高剂量CTX（200 mg/天）节律治疗在Treg细胞耗竭中失去其特异性。一淋巴细胞，CD3⁺CD4细胞⁺和CD3⁺CD8（CD8）⁺淋巴细胞和CD3^-CD56型⁺在开始高剂量CTX节律治疗前和1个月后测定NK细胞绝对数。b条对CD3的影响⁺CD4细胞⁺CD25型^高的特雷格。使用Fisher精确方法进行统计分析

讨论

目前已明确证明Treg有助于肿瘤逃逸和抑制肿瘤免疫反应，但目前还没有证实任何治疗方法可以特异性诱导人类Treg缺失。据报道，一种含氟达拉滨的治疗方案可以诱导慢性淋巴细胞白血病患者的Treg耗竭，但这种治疗也会对其他淋巴细胞亚群产生强烈影响，从而削弱其他免疫细胞的效应功能[18]. 在转移性黑色素瘤患者中，使用结合IL-2和白喉毒素的融合蛋白破坏基于高亲和力IL-2受体表达的调节性T淋巴细胞未能消除Treg[19].

一项临床前研究报告称，节律CTX方案提高了小鼠特定肿瘤疫苗的疗效，但其对Treg的影响尚未报道[20]. 在这里，我们证明节律CTX方案选择性地耗尽人类Treg，同时保留其他淋巴细胞亚群的数量和功能。令人惊讶的是，这种节律性CTX方案并没有抑制T和NK细胞的功能，相反，它通过抑制Treg数量和功能而显著增强了T和NK细胞的功能。因此，最初设计用于通过对内皮细胞的作用来减少肿瘤血管生成的1个月节拍CTX方案，也减少了循环Treg的数量，并恢复了患有终末期多治疗肿瘤的患者的T细胞增殖和NK细胞效应器功能。尽管CTX明显耗尽了肿瘤患者的Treg，但它也可能有助于恢复1个月节律治疗后观察到的免疫反应。例如，CTX可以在小鼠模型中增强脾细胞产生IFN-α[21].

使用低剂量的CTX可能是该治疗对Treg数量和功能选择性影响的决定因素。使用更高剂量CTX（每天200毫克）的类似试验导致循环淋巴细胞数量大幅减少，这对所有淋巴细胞亚群都有影响，但对Treg没有任何选择性活性。此外，这种治疗降低了NK细胞依赖性细胞毒性和T细胞增殖能力（未显示）。

这些数据表明，这里描述的方案值得与旨在增强晚期癌症患者T细胞或NK细胞功能的特异性免疫疗法一起测试。

致谢

脚注

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