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一氧化氮合酶（NOS）通过两个连续的单氧化反应催化L-精氨酸的胍基氮五电子血红素氧化为L-瓜氨酸，从而产生一氧化氮（NO），生成N-（ω）-羟基-L-精氨酸（NHA）作为中间产物。在哺乳动物中，有三种不同的NOS同工酶：神经元（nNOS或NOS-1）、细胞因子诱导型（iNOS或NOS-2）和内皮细胞（eNOS或NOS-3）。一氧化氮合酶是同二聚体。在真核生物中，每个单体都有一个N末端加氧酶结构域，该结构域与底物L-精氨酸、锌、辅因子血红素和5.6.7.8-（6R）-四氢生物蝶呤（BH4）结合。真核NOS也有一个C末端提供电子的还原酶区域，该区域与细胞色素P450还原酶同源，并与NADH、FAD和FMN结合。虽然原核生物可以利用与NOS完全不同的一组酶产生NO作为反硝化的副产物，但少数原核生物也具有仅由NOS加氧酶结构域组成的NOS。原核生物NOS与底物L-Arg、锌以及辅因子血红素和四氢叶酸结合。
