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溶解缓冲液溶解蛋白质的能力不同,其中含有十二烷基硫酸钠(SDS)和其他离子洗涤剂的溶解缓冲液被认为是最粗糙的,因此最有可能产生最高产率。
选择裂解缓冲液时的主要考虑因素是所选抗体是否能识别变性样品。如果情况并非如此,则应在抗体数据表上注明,并应使用不含洗涤剂或相对温和的非离子洗涤剂(NP-40、Triton X-100)的缓冲液。
蛋白质定位和裂解缓冲液选择
*与全细胞或组织裂解物相比,仅或主要在亚细胞位置发现的蛋白质在亚细胞部分的裂解物中更富集。当试图获得弱表达蛋白的信号时,这可能很有用。请参考我们关于亚细胞分离的单独协议。
溶血缓冲液配方:
NP-40缓冲器
这是一种研究细胞质或膜结合蛋白质或全细胞提取物的常用缓冲液。如果担心相关蛋白质没有从不溶性物质或聚集物中完全提取出来,RIPA缓冲液可能更适合,因为它含有更容易将蛋白质带入溶液的离子洗涤剂。
RIPA缓冲液(放射免疫沉淀分析缓冲液)
*可以配制成10%的储备溶液,必须避光。
RIPA缓冲液适用于全细胞提取和膜结合蛋白,并且可能比NP-40或Triton X-100缓冲液更适用于提取核蛋白。它会破坏蛋白质之间的相互作用,因此可能会对免疫沉淀和下拉分析产生问题。
如果必须保持蛋白质之间的相互作用或尽量减少变性,则应使用不含离子洗涤剂(如SDS)的缓冲液,最好不含非离子洗涤剂的缓冲液(如Triton X-100)。
无洗涤剂缓冲液的细胞裂解是通过机械剪切实现的,通常使用Dounce均质器或通过将细胞通过注射器尖端。在这些情况下,一个简单的Tris缓冲液就足够了,但如上所述,含有洗涤剂的缓冲液需要释放膜或细胞骨架结合蛋白。
缓冲液
Tris-Triton缓冲液(细胞骨架蛋白)
所有四种缓冲液将在4°C下保存数周或最多一年(如果分成等分并储存在-20°C下)。
一旦发生水解,蛋白质水解、去磷酸化和变性就开始了。如果样品始终保存在冰上或4°C下,并将适当的抑制剂新鲜添加到裂解缓冲液中,则这些事件可以显著减缓。
各种供应商提供了现成的抑制剂鸡尾酒,但您可以自己制作鸡尾酒。
原钒酸钠制备
在通风柜中执行所有步骤。
变性、还原样品
抗体通常识别一小部分感兴趣的蛋白质(称为表位),该结构域可能位于蛋白质的3D构象中。为了使抗体能够接触到这部分,有必要展开蛋白质,即使其变性。
要变性,使用带有阴离子洗涤剂十二烷基硫酸钠(SDS)的加载缓冲液,并将混合物在95–100°C下煮沸5分钟。在70°C下加热5–10分钟也是可以接受的,并且在研究多程膜蛋白时可能更可取。这些物质在煮沸时会聚集,聚集物可能无法有效进入凝胶。
标准加载缓冲器称为2X Laemmli缓冲器(LaemmliUK,1970)。噬菌体T4头部组装过程中结构蛋白的裂解。自然,227680-5)。它也可以以4倍和6倍的强度制作,以尽量减少样品的稀释。2X将以1:1的比例与样品混合。
2x Laemmli缓冲液配方
当SDS与蛋白质一起使用时,所有蛋白质都会因其与SDS阴离子的结合而带负电。SDS以1.4:1的质量比相当特异地与蛋白质结合。在这样做的过程中,SDS根据多肽的长度给其赋予负电荷。变性多肽变成负电荷杆,每单位长度的电荷密度相等。因此,迁移是由分子量决定的,而不是由多肽的固有电荷决定的。
SDS等级对高质量蛋白质分离很重要:沿着单个凝胶束的蛋白质染色背景,带有模糊或稍显不同的蛋白质带,表明SDS陈旧或质量较差。缓冲液中包含2-巯基乙醇或二硫苏糖醇可减少二硫键,这是按大小进行分离所必需的。
将甘油添加到加载缓冲液中,以增加待加载样品的密度,从而将样品保持在井底,限制溢出和凝胶加载不均匀。
为了可视化蛋白质的迁移,通常在加载缓冲液中加入一个小的阴离子染料分子(例如溴酚蓝)。由于染料是阴离子型的,并且体积小,它将以最快的速度迁移混合物中要分离的任何组分,并提供一个迁移前沿来监控分离过程。
在蛋白质样品处理过程中,应在加热步骤前后通过涡流混合样品,以获得最佳分辨率。
天然和非还原样品
或者,抗体可以识别由非接触氨基酸组成的表位。虽然表位的氨基酸在一级序列中彼此分离,但在蛋白质的折叠三维结构中它们彼此接近,抗体只能识别存在于折叠结构表面的表位。
在这些情况下,重要的是在非变性条件下进行蛋白质印迹,这将在应用部分的数据表中注明。一般来说,非变性条件仅意味着将SDS从样品和迁移缓冲液中取出,而不加热样品。
某些抗体只能识别非还原形式的蛋白质(尤其是半胱氨酸残基),并且必须将还原剂β-巯基乙醇和DTT排除在加载缓冲液和迁移缓冲液之外。
经验法则:减少和变性,除非数据表另有规定。
协议由Abcam“AS-IS”根据Abcam实验室使用Abcam试剂和产品的实验提供;在这些条件之外使用协议的结果可能会有所不同。